הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מיפוי העברת אנרגיית תהודה של Förster: מתודולוגיה חדשה להבהרת תכונות מבניות גלובליות

1.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63433

⸱

16 במרץ 2022

 ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

במאמר זה

סיכום

המחקר מפרט את המתודולוגיה של מיפוי FRET כולל בחירת אתרי תיוג, בחירת צבעים, רכישה וניתוח נתונים. מתודולוגיה זו יעילה בקביעת אתרי קשירה, שינויים קונפורמיים ותנועות דינמיות במערכות חלבונים, והיא שימושית ביותר אם היא מבוצעת בשילוב עם מידע מבני תלת-ממדי קיים.

תקציר

העברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) היא שיטה מבוססת פלואורסצנטיות מבוססת המשמשת למדידה מוצלחת של מרחקים בתוך ובין ביו-מולקולות במבחנה , כמו גם בתוך תאים. ב-FRET, היעילות של העברת אנרגיה, הנמדדת על ידי שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה או באורך החיים, מתייחסת למרחק בין שתי מולקולות או תוויות פלואורסצנטיות. קביעת דינמיקה ושינויים קונפורמיים מהמרחקים הם רק כמה דוגמאות ליישומים של שיטה זו למערכות ביולוגיות. בתנאים מסוימים, מתודולוגיה זו יכולה להוסיף ולשפר מבנים גבישיים קיימים של קרני רנטגן על ידי מתן מידע לגבי דינמיקה, גמישות והתאמה למשטחי קישור. אנו מתארים את השימוש ב-FRET ובקביעות מרחק נלוות כדי להבהיר תכונות מבניות, באמצעות זיהוי אתר איגוד או אוריינטציות של תת-יחידות דימר. באמצעות בחירה מושכלת של אתרי תיוג, ולעתים קרובות שימוש באסטרטגיות תיוג מרובות, יישמנו בהצלחה שיטות מיפוי אלה כדי לקבוע תכונות מבניות גלובליות בקומפלקס חלבון-DNA ובמערכת טרנסלוקציה של חלבונים SecA-SecYEG. במערכת SecA-SecYEG, השתמשנו בשיטות מיפוי FRET כדי לזהות את אתר קישור הפרה-פרוטאין ולקבוע את ההתאמה המקומית של אזור רצף האותות המאוגדים. מחקר זה מתאר את השלבים לביצוע מחקרי מיפוי FRET, כולל זיהוי אתרי תיוג מתאימים, דיון בתוויות אפשריות, כולל שאריות של חומצות אמינו שאינן מקומיות, הליכי תיוג, כיצד לבצע מדידות ופירוש הנתונים.

מבוא

עבור חלבונים, הבהרת הדינמיקה יחד עם ידע מבני תלת-ממדי (תלת-ממדי) מובילה להבנה משופרת של יחסי מבנה-תפקוד של מערכות ביו-מולקולריות. שיטות מבניות, כגון קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית, לוכדות מבנה סטטי ולעתים קרובות דורשות קביעת מבנים מרובים כדי להבהיר היבטים של קשירת ביו-מולקולציה ודינמיקה1. מאמר זה דן בשיטה מבוססת פתרון למיפוי אלמנטים מבניים גלובליים, כגון אתרי קשירה או אינטראקציות איגוד, שעשויים להיות ארעיים יותר ופחות קלים ללכידה בשיטות סטטיות. מערכות מועמדות חזקות למתודולוגיה זו הן כאלה שבהן מבנה תלת-ממדי נקבע בעבר על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, ספקטרוסקופיה של NMR או שיטות מבניות אחרות. במקרה זה, אנו מנצלים את המבנה הגבישי של קרני הרנטגן של קומפלקס SecA-SecYEG, שחקן מרכזי במסלול ההפרשה הכללי של חלבונים, כדי למפות את מיקומו של אתר קשירת פפטידי אותות באמצעות העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET) לפני הובלת הפרפרוטאין על פני הממברנה2. מניפולציה של המערכת הביולוגית באמצעות שינויים גנטיים יחד עם הידע שלנו על המבנה התלת-ממדי אפשרו את קביעת הקונפורמציה של רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם מיד לפני ההחדרה לערוץ 3.

FRET כולל העברה נטולת קרינה של אנרגיה ממולקולה אחת (תורם) לאחרת (מקבל) באופן תלוי מרחק שנמצא דרך חלל 4,5. היעילות של העברה זו מנוטרת באמצעות ירידה בתורם או עלייה בעוצמת הפלואורסצנציה של המקבלים. ניתן לתאר את היעילות של העברת אנרגיה כ

E = R06/(R06 + R6)

שבו ערך R0 הוא המרחק שבו ההעברה יעילה ב-50%6. הטכניקה תוארה בעבר כשליט מולקולרי והיא יעילה בקביעת מרחקים בטווח של 2.5-12 ננומטר, בהתאם לזהותם של צבעי התורם-מקבל 4,7,8,9. עוצמות הפלואורסצנציה של התורם ואורך החיים עם או בלי מקבל מאפשרים קביעת יעילות ההעברה וכתוצאה מכך, מרחקים 5,8. בשל זמינות הטכנולוגיה, רגישות השיטה וקלות השימוש, FRET מצאה יישום רחב גם בתחומים כגון ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת ומיקרוסקופיה קונפוקלית6. הופעתם של חלבונים פלואורסצנטיים כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק הפכה את התצפית על דינמיקה תוך-תאית והדמיה של תאים חיים לקלה יחסיתל-10,11. יישומי FRET רבים כגון אלה נדונים בפירוט בנושא וירטואלי זה.

במחקר זה, אנו מתמקדים במיוחד בשימוש במדידות FRET כדי להניב ערכי מרחק כדי לקבוע פרטים מבניים. בעבר, נעשה שימוש יעיל במדידות FRET כדי לקבוע את הקונפורמציה של מולקולות דנ"א כאשר הן קשורות לחלבון 12,13,14, לדינמיקה הפנימית של חלבונים ולאינטראקציות קושרות חלבונים 15,16,17. היתרונות של שיטה זו טמונים ביכולת לקבוע אלמנטים מבניים גמישים ודינמיים בתמיסה עם כמויות נמוכות יחסית של חומר. באופן משמעותי, שיטה זו יעילה במיוחד כאשר משתמשים בה בשילוב עם מידע מבני קיים ואינה יכולה לשמש כאמצעי לקביעת מבנה תלת-ממדי. השיטה מספקת את התובנה הטובה ביותר ואת העידון של המבנה אם העבודה מתבססת על מידע מבני קיים שלעתים קרובות בשילוב עם סימולציה חישובית18,19. כאן מתואר השימוש במרחקים המתקבלים ממדידות FRET במצב יציב ובזמן לפתרון זמן כדי למפות אתר מחייב, שמיקומו לא היה ידוע, על מבנה קריסטלוגרפי קיים של קומפלקס SecA-SecYEG, חלבונים עיקריים במסלול ההפרשה הכללי3.

מסלול ההפרשה הכללי, מערכת שמורה מאוד, מפרוקריוטים דרך אאוקריוטים ועד ארכיאה, מתווך את העברת החלבונים לרוחב או לתוך הממברנה למיקומה התפקודי של התא. עבור חיידקים גראם-שליליים, כגון E. coli, האורגניזם ששימש במחקר שלנו, חלבונים מוחדרים לתוך הממברנה הפנימית או עוברים טרנסלוקציה על פני הממברנה הפנימית לפריפלסמה. קומפלקס תעלות ה-SecY החיידקי (המכונה טרנסלוקון) מתאם עם חלבונים אחרים כדי לבצע טרנסלוקציה של החלבון המסונתז החדש, המופנה למיקומו הנכון בתא באמצעות רצף אותות הממוקם בדרך כלל ב-N-terminus20,21. עבור חלבונים הקשורים לפריפלזמה, החלבון ATPase SecA מתחבר למנהרת היציאה של הריבוזום, ועם הפריפרוטאין לאחר שכ-100 שאריות תורגמו22. יחד עם חלבון המלווה של SecB, הוא שומר על הפרפרוטאין במצב של התגלגלות. SecA נקשר לטרנסלוקון SecYEG, ובאמצעות מחזורים רבים של הידרוליזה של ATP, מאפשר הובלת חלבונים על פני הממברנה23,24.

SecA הוא חלבון רב-תחומי שקיים בצורות ציטוזוליות וממברנה הקשורות לממברנה. החלבון ההומודימרי בציטוזול, SecA מורכב מתחום קשירת פרפרוטאין או קישור צולב25, שני תחומים קושרי נוקלאוטידים, תחום כנף סלילית, תחום פיגומים סליליים ושתי אצבעות סליל (THF)26,27,28,29 (איור 1). במחקרים קריסטלוגרפיים קודמים של קומפלקס SecA-SecYEG, מיקומו של ה-THF הציע כי הוא היה מעורב באופן פעיל בטרנסלוקציה של חלבונים וניסויים צולבים שלאחר מכן עם פפטיד האותות ביססו עוד יותר את המשמעות של אזור זה בטרנסלוקציה של חלבונים30,31. מחקרים קודמים, שהשתמשו במתודולוגיית המיפוי FRET, הראו כי פפטידי אותות אקסוגניים נקשרים לאזור זה של SecA 2,32. כדי להבין באופן מלא את הקונפורמציה והמיקום של רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם של הפרה-פרוטאין לפני ההחדרה לתעלת SecYEG, נוצרה כימרה חלבונית שבה רצף האותות והשאריות של האזור הבוגר המוקדם חוברו ל-SecA באמצעות מקשר Ser-Gly (איור 1). באמצעות מבנה בר-קיימא ביולוגית זה, הוכח עוד יותר כי רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם של הפרפרוטאין נקשרים ל-THF באופן מקביל2. לאחר מכן, מתודולוגיית מיפוי FRET שימשה כדי להבהיר את הקונפורמציה והמיקום של רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם בנוכחות SecYEG כמתואר להלן3.

הידע על המבנה התלת-ממדי של מתחם SecA-SecYEG 33,34,35 והמיקום האפשרי של אתר הכריכה אפשרו לנו למקם באופן שיפוטי תוויות תורמים-מקבלים במיקומים שבהם ההצטלבות של מרחקי FRET בודדים מזהה את מיקום אתר הכריכה. מדידות מיפוי FRET אלה גילו כי רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם של הפרפרוטאין יוצרים סיכת שיער עם הקצה הממוקם בפתחו של ערוץ SecYEG, מה שמדגים כי מבנה סיכות השיער מעוצב לפני החדרת התעלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. בחירת אתרי תיוג

  1. זהה לפחות שלושה אתרי תיוג פוטנציאליים כדי לשלש את אתר הקשירה הפוטטיבי על מבני החלבונים הקיימים. במקרה זה, SecA, SecYEG ופרפרוטאין המחוברים ל- SecA באמצעות איחוי גנטי זוהו2.
    1. בחר אתרי תיוג בטווח של 25-75 Å מאתר הקשירה הפוטטיבי ובאזורים סטטיים יחסית של החלבון, המרחק יקבע את זוג צבעי ה- FRET הספציפי שישמש36. אתרו את אתרי הסימון באזורי חלבונים הנבדלים יחסית זה מזה, כך שהאתרים יתארו את הקודקודים של משולש כאשר אתר הקשירה הפוטטיבי ממוקם במרכזו (איור 1A-D).
    2. להציג או לזהות שאריות ציסטאין (Cys) באתרי תיוג בעלי עניין בחלבון שאין לו שאריות Cys אחרות, כדי לשפר את יעילות הסימון של האתר הספציפי37,38.
    3. הציגו חומצות אמינו לא טבעיות, למשל p-azidophenylalanine לתיוג באמצעות כימיה של קליקים, על מנת לתייג ביעילות חלבון אחד בשתי עמדות נפרדות עם צבעים שונים39,40.
    4. בדוק את המוטנטים של Cys לאובדן תפקוד. אמתו את הפעילות של המוטציה חסרת ה-Cys ואת המוטציה הלא טבעית של חומצות האמינו באמצעות בדיקת פעילות מתאימה. במקרה זה, הפעילות אומתה עם בדיקת צמיחה ואחריה בדיקת ATPase ירוקה במבחנה 32,41,42

2. תיוג החלבון

  1. טהרו את החלבון או החלבונים המעניינים לפחות 95% לצורך תיוג מדויק. לטהר חלבוני SecA ו- SecYEG בהתאם לפרוטוקולים המפורטים בהפניה3. ודא שיש לך לפחות 5 מיקרוגרם של חלבון מטוהר לשלב זה, מכיוון שחלק מהחלבון יאבד במהלך תהליך הסימון.
  2. בחר שני צבעים למדידות FRET בהתאם לערך R0 שלהם ולמרחקים החזויים בין אתרים מסומנים. הערך ערכי R0 וציין את פליטת התורמים ואת חפיפת ספיגת המקבלים באמצעות המידע ממסד הנתונים של חלבונים פלואורסצנטיים, אשר נותן גם ספקטרה עבור צבעים נפוצים (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    הערה: R0 מוגדר כמרחק שבו יעילות ההעברה היא 50% עבור זוג צבעים נתון. עבור ניסויי מיפוי, המרחקים החזויים צריכים להיות קרובים לערך R0 של זוג הצבעים כדי להבטיח שניתן יהיה למדוד מרחקים במדויק.
  3. סמן את המיקומים שזוהו בשלב 1.1.1. עם צמד הצבעים התורם-מקבל.
    1. סמן את החלבון על פי הוראות היצרן תוך מתן תשומת לב מיוחדת לפרמטרים כגון ריכוז חלבון אופטימלי, טמפרטורה, pH, משך זמן ומאגר עבור הצבעים הספציפיים שבהם נעשה שימוש 43,44.
    2. הכינו את החלבון בריכוז של 1-2 מ"ג/מ"ל או כ-10 מיקרומטר ב-25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA (TKE) buffer. ממיסים צבע בדימתילפורמיד (DMF) או דימתילסולפוקסיד (DMSO) לריכוז סופי של 1 mM. מוסיפים את הצבע בצורה טיפתית לתמיסה תוך כדי ערבוב כדי להגיע לצבע: יחס חלבון טוחן של 5:1 (50 μM צבע: 10 μM חלבון).
    3. אפשרו לתגובה להמשיך במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר (RT) בבקבוקון זכוכית עם נדנדה עדינה או לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. עצור את התגובה על ידי הוספת β-mercaptoethanol.
      הערה: אם החלבון אינו תואם למאגר Tris, ניתן להשתמש במאגרי פוספט או HEPES. שמור על pH בטווח של 7.0-7.5. אם לחלבון יש קשרים דיסולפידיים, הוסיפו חומר מחזר כגון DTT או TCEP לפני התוויה. הסר DTT על ידי דיאליזה או סינון ג'ל לפני הוספת צבע.
  4. למדידות FRET מדויקות, הסר את הצבע החופשי באמצעות רכז צנטריפוגלי עם חתך משקל מולקולרי מתאים (MWCO) כדי לאפשר לצבע החופשי לזרום דרכו תוך שמירה על החלבון המסומן.
    1. הכן את קרום הריכוז על ידי הצבת ~ 1 מ"ל של מים בחלק העליון של רכז 3 מ"ל ולאחר מכן צנטריפוגה של המים דרך הממברנה (לפחות 10 דקות ב 4,300 x גרם).
    2. הסר צבע חופשי על ידי צנטריפוגה מדגם מסומן ברכז (20 דקות ב 4,300 x g). חזרו על הפעולה 3-4 פעמים והשליכו את הזרימה.
    3. בדוק את יעילות הסימון של החלבון המסומן באמצעות ספקטרוסקופיית ספיגת UV-Vis.
      הערה: מדידות FRET דורשות יעילות תיוג של 50% או יותר. יעילות תיוג נמוכה יותר מפחיתה את אות ה- FRET ועלולה להוביל לאי דיוקים במדידה.
    4. קבל ספקטרום UV-Vis של החלבון המסומן עם טווח של 250-700 ננומטר כדי לצפות הן ברצועת ספיגת החלבון והן ברצועת הספיגה המרבית של הצבע. מדוד את הספיגה בשיא הספיגה של הצבע וב-280 ננומטר עבור חלבון.
    5. קבע את ריכוז החלבון ותקן עבור כל תרומה מהצבע באמצעות מקדם התיקון, CF, והמשוואות הבאות45,46:
      figure-protocol-1
      כאשר C הוא ריכוז החלבון (M), A280 הוא ספיגת הדגימה ב-280 ננומטר, Aמקסימום הוא הספיגה בספיגת הצבע המקסימלית, ε החלבון הוא מקדם ההכחדה של החלבון ב-280 ננומטר ו-CF הוא גורם התיקון, A'280/A'max, כאשר A'280 הוא הספיגה ב-280 ננומטר ו-A'max הוא הספיגה בשיא המקסימלי עבור הצבע בלבד.
    6. קביעת יעילות התוויות באמצעות המשוואה הבאה:
      figure-protocol-2
      כאשר צבע ε הוא מקדם ההכחדה הטוחנת של הצבע, C הוא ריכוז החלבון כפי שנקבע בשלב 2.4.5, ו-E הוא יעילות הסימון. חזור על שלב 2.4.2 עד שערך יעילות הסימון הוגדל והוא פחות מ- 100%.

3. קבע את ערכי R 0

  1. מדוד את ערכי R0 באתרו. הכינו שתי דגימות חלבון באותו ריכוז של סך החלבון, 4 μM, אחת עם החלבון המסומן בצבע התורם בלבד ואחת עם החלבון המסומן בצבע המקבל בלבד. עבור SecA, ריכוז חלבון של מונומר 4 μM SecA עובד היטב עבור מדידות אלה.
    1. הכינו נפחי דגימה של 2.5 מ"ל עבור קובט בגודל 1 ס"מ x 1 ס"מ, 600 μL עבור קובט 5 מ"מ x 5 מ"מ או 200 μL עבור קובט 3 מ"מ x 3 מ"מ.
  2. הפעל את הפלואורומטר ופתח את תוכנית הרכישה והניתוח הספקטרלית בתוכנת הפלואורסצנציה אם אתה משתמש בספקטרופלואורומטר. לחץ על M האדום כדי לחבר את המחשב למכשיר (איור 2A) ובחר ספקטרום פליטה.
    1. הזן פרמטרים של סריקה כגון אורך גל של עירור, הטווח של סריקת פליטה, טמפרטורה ומיקום מחליף דגימה באמצעות פריט התפריט Collect Experiment (איור 2B).
    2. לחץ על RTC ובצע אופטימיזציה של הגדרות המכשיר (למשל, חריצים ספקטרליים) על ידי ניטור פליטת הפלואורסצנציה בשיא באמצעות אורך גל של עירור שנקבע במקסימום הקליטה של הצבע. עבור SecA, הגדר את ההגדרות הבאות: פס פס כ- 1 ננומטר; עירור וחריצי פליטה כ-1 ו-1.5 מ"מ בהתאמה, כאשר הטמפרטורה היא 25 מעלות צלזיוס ומהירות הערבוב ב-250 סל"ד.
      הערה: אין לחרוג מקיבולת הספירות לשנייה (cps) של המכשיר (בדרך כלל 2 x 106 cps).
  3. מקם את דגימת החלבון המסומנת על ידי התורם במחזיק הדגימה ולחץ על הפעל כדי ליצור סריקת פליטה של החלבון המסומן בצבע התורם בלבד (חלבון התורם בלבד) על ידי העברת הדגימה בספיגת הצבע המרבית (למשל, 488 ננומטר עבור AF488) וסריקה מעל שיא הפליטה (505-750 ננומטר עבור חלבון SecA תורם בלבד המסומן ב- AF488).
  4. קבעו קו בסיס לסריקה על ידי הארכת הסריקה ב-25-50 ננומטר מעבר לסוף השיא. מדדו את התפוקה הקוונטית של החלבון התורם בלבד, על ידי ביצוע מדידות ספיגה ופלואורסצנציה על דגימות בריכוזים שונים כמתואר47. שמור על אותן הגדרות חריץ עבור מדידות אלה.
    1. השתמש בצבע התורם החופשי כהפניה לתפוקה הקוונטית. קבל לפחות ארבע מדידות של החלבון התורם בלבד והצבע החופשי בריכוזים שונים לצורך קביעה מדויקת.
    2. התאם את עוצמת הפלואורסצנציה או האזור המשולב לעומת הספיגה של החלבון התורם בלבד והצבע החופשי או הייחוס. קבע את המדרונות עבור החלבון התורם בלבד (שיפועD) ואת הייחוס (SlopeR).
    3. התשואה הקוונטית (Φ) מחושבת באמצעות המשוואה הבאה:
      figure-protocol-3
      כאן ΦD הוא התשואה הקוונטית של החלבון התורם בלבד, ΦR הוא התשואה הקוונטית של הצבע החופשי (בדרך כלל ניתן להשיג זאת מהיצרן), שיפועD ומדרוןR הם המדרונות שנקבעו בשלב 3.4.2 עבור החלבון והייחוס היחידים של התורם, בהתאמה ηD ו- ηR מייצגים את מדד השבירה של החלבון התורם בלבד ואת תמיסות הצבע ללא ייחוס, בהתאמה 47.
  5. השג ספקטרום ספיגה של החלבון שלך למקבל בלבד באמצעות תא באורך 1 ס"מ. צרו ספקטרום מקדם הכחדה של החלבון שלכם שמקבלים בלבד על ידי חלוקת ספקטרום הספיגה בריכוז הצבע.
  6. צור את אינטגרל החפיפה הספקטרלי, J (λ) באמצעות תוכנית אנליזה גרפית. ניתן להשתמש גם בתוכנית גליון עבודה סטנדרטית (לדוגמה, גיליון אלקטרוני) עבור תהליך זה.
    1. הכפל את ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטית של החלבון התורם בלבד (שלב 3.4) בספקטרום מקדם ההכחדה של החלבון המקבל בלבד כדי ליצור את ספקטרום החפיפה.
    2. הכפל את ספקטרום החפיפה המתקבל ב- λ4.
    3. קבע את השטח שמתחת לעקומה על ידי שילוב של אזור החפיפה. אזור החפיפה מוגדר כאזור שבו ספקטרום פליטת התורמים המוכפל בספקטרום מקדם ההכחדה של המקבל מניב ערכים חיוביים. אינטגרל החפיפה הספקטרלי מוגדר כ:
      figure-protocol-4
      כאשר FD (λ) הוא ספקטרום הפליטה של החלבון התורם בלבד (המתקבל בשלב 3.4) ו-εA(λ) הוא ספקטרום מקדם ההכחדה של החלבון המקבל בלבד ויש לו יחידות של M-1 cm-1 (המתקבל בשלב 3.5). אינטגרל החפיפה הספקטרלי המתקבל צריך לכלול יחידות של M-1 cm-1 nm4.
    4. נרמל את אינטגרל החפיפה הספקטרלית. חלקו את אינטגרל החפיפה בשטח המשולב של ספקטרום החלבון היחיד של התורם על פני אותו טווח ספקטרלי:
      figure-protocol-5
    5. חישוב הערך R0 ב- Å באמצעות המשוואה הבאה:
      figure-protocol-6
      כאשר κ2 הוא גורם הכיוון, הנלקח בדרך כלל כ- 2/3 עבור צבעים המסתובבים בחופשיות, η הוא מדד השבירה וניתן לקירוב כ- 1.33 עבור תמיסות מימיות מדוללות, QD הוא התשואה הקוונטית של התורם (שלב 3.4) ו- J(λ) הוא אינטגרל החפיפה הספקטרלי כפי שנקבע בשלב 3.6.35. הערה: אם הצבעים אינם מסתובבים באופן חופשי, ניתן להציג תיקונים כמתואר על ידי Ivanov 48 וליישם על ידי Auclair49 ו- Zhang 2,3.

4. בצע מדידות ספקטרליות של FRET

  1. הכינו דגימות חלבון של תורמים בלבד, חלבון מקבל בלבד ודגימות חלבון של תורמים-מקבלים בריכוז זהה; מומלץ ריכוז של 4 μM. השתמש בפתרון של 200 μL, אם אתה משתמש ב- cuvette של 3 מ"מ x 3 מ"מ, 600 μL אם אתה משתמש ב- cuvette של 5 מ"מ x 5 מ"מ, או 2.5 מ"ל אם אתה משתמש ב- cuvette בגודל 1 ס"מ x 1 ס"מ.
    1. הכינו את דגימת החלבון התורם-מקבל על ידי שימוש בכמויות טוחנות שוות של החלבון התורם בלבד והמקבל בלבד.
    2. שמרו על אותה כמות של דגימה מסומנת בתורם בקרה בלבד וקבלו רק דגימות חלבון באמצעות הכנסת חלבון ללא תווית בכמות טוחנת שווה לתורם בלבד או לדגימות המקבלות בלבד. לדוגמה, עבור תמיסות באותו ריכוז, כל דגימת FRET של תורם בלבד תכיל 100 μL של חלבון לתורם בלבד ו-100 μL של חלבון ללא תווית עבור נפח של 200 μL.
  2. צור ספקטרום פליטה פלואורסצנטי של התורם בלבד, המקבל בלבד, ודגימות מקבל התורם בלבד. מטב את האות כמתואר בשלב 3.2. לאחר האופטימיזציה שמור על אותן הגדרות עבור כל הדוגמאות.
    1. השג את הסריקה לתורם בלבד כמתואר בשלב 3.3. לעורר את התמיסה בספיגת הצבעים המקסימלית של התורם ולסרוק את שיאי הפליטה של התורם והמקבל (הצפוי).
    2. החלף את הדגימה בחלבון המקבל בלבד או שנה את מיקום מחליף הדגימה לקובטה המכילה את החלבון המקבל בלבד.
    3. קבל בדיקת פליטה של החלבון המסומן בצבע מקבל בלבד (חלבון מקבל בלבד) באמצעות אותן הגדרות כמו בשלב 4.2.1. לעורר את הדגימה באורך הגל של עירור התורם.
      הערה: ספקטרום זה מספק תיקון לכמות המקבל המתרגש באורך הגל של התורם (FA בשלב 5.1.2)
    4. החלף את הדגימה לדגימת החלבון המקבלת-תורם או שנה את מיקום מחליף הדגימה ל-cuvette המכיל את החלבון המסומן על-ידי התורם-מקבל.
    5. קבל סריקת פליטה של דגימת החלבון המקבלת-התורם באמצעות אותן הגדרות כמו בשלבים 4.2.1 ו- 4.2.3.
    6. עבור כל הספקטרום, מתאים לפלואורסצנציה ברקע על ידי הפחתת ספירות הרקע שנמדדו בסוף הסריקה.
  3. מדוד את אורך חיי התורם של התורם בלבד ואת דגימות התורם-מקבל שהוכנו כמתואר בשלב 4.1.2. השתמש במכשיר פלואורסצנטי לספירת פוטון יחיד בקורלציה בזמן המסוגל למדוד ולפתור דעיכות פלואורסצנטיות בטווח הזמן של ננו-שניות (10-9 שניות).
    הערה: עבור זוגות צבעי FRET, התאם את מקור אור העירור למקסימום הספיגה של צבע התורם.
    1. הפעל את המכשיר. פתח את תוכנת הרכישה, השתמש בתוכנת בקרת המכשירים לרכישת נתונים עם ספקטרומטר הפלואורסצנציה.
    2. לרכישה, בחר TCSPC Decay, עם טווח זמן של 55 ns, רווח של 1 ו 4096 ערוצים.
    3. קבל פונקציית תגובה למכשיר (IRF) באמצעות תמיסה של מלבין שאינו חלבי או תמיסת פיזור מסחרית ופקח על הפיזור במהירות של 490 ננומטר. התאם את הגדרת החריץ והשתמש במסנני צפיפות ניטרליים לפי הצורך כדי לשמור על קצב ספירה נמוך מספיק כדי למנוע ערימת דופק5. לחץ על קבל ולאחר מכן התחל. זה יתחיל את הרכישה.
      הערה: קצב ספירה מרבי של 4000 cps משמש לקצב חזרה של 180 קילוהרץ.
    4. אסוף את ה-IRF ב-490 ננומטר עד שלערוץ השיא יהיה מקסימום של 20,000 ספירות. אסוף IRF לפני ואחרי מדידת כל דעיכה פלואורסצנטית.
    5. קבל את הדעיכות הפלואורסצנטיות של התורם בלבד ואת דגימות מקבלי התורם בלבד על ידי ניטור פליטת הפלואורסצנציה באורך הגל של פליטת התורם, 520 ננומטר.
    6. התאם את הגדרות החריץ לקצב ספירה מרבי של 4000 cps או פחות. הגדרות חריץ הן בדרך כלל פס פס של 15-20 ננומטר עבור דגימות חלבון. אסוף את הדעיכה עד שיתקבלו 20,000 ספירות בערוץ השיא.
  4. נתח את הדעיכה או את עוצמת הפלואורסצנציה (I) כפונקציה של זמן (t) עבור אורך החיים הפלואורסצנטי (τ). התאמת הדעיכה לסכום מעריכים עם המשוואה הבאה:
    figure-protocol-7
    כאשר αI הוא הגורם הקדם-אקספוננציאלי של הרכיב ith ו- τI הוא אורך החיים. ההתאמה סובבת מחדש עם ה-IRF כדי להתאים לריקבון הפלואורסצנטי. לשפוט את איכות ההתאמה מהפרמטרים המופחתים של Χ2 .

5. ניתוח נתוני FRET

  1. חשב את יעילות FRET מהירידה בעוצמת התורם של מדגם התורם-מקבל ביחס לתורם רק עם המשוואה הבאה.
    figure-protocol-8
    כאשר FDA היא עוצמת הפלואורסצנציה של דגימת התורם-מקבל ו-FD היא עוצמת הפלואורסצנציה של המדגם היחיד של התורם בשיא הפלואורסצנציה של התורם. השתמש באזורים המשולבים של הפסגות אם הנתונים רועשים.
    1. נכון לגבי כל ההבדלים בסימון בין המדגם התורם בלבד לבין דגימות התורם-מקבל. חשב תיקונים המבוססים על מידת התוויה של התורם באופן הבא.
      figure-protocol-9
      כאשר fDA היא יעילות הסימון של התורם במדגם התורם-מקבל ו- fD היא יעילות הסימון במדגם התורם בלבד.
    2. נכון לכל תרומה של הפלואורסצנציה המקבלת לספקטרום הנרגש-תורם באמצעות חיסור ספקטרום החלבון המקבל בלבד (שלב 4.2) מספקטרום החלבון התורם-מקבל.
      figure-protocol-10
    3. נכון להבדלים ביעילות הסימון של החלבון המקבל בלבד ביחס לדגימת החלבון התורם-מקבל, מה שמניב את המשוואה הבאה לחישוב היעילות:
      figure-protocol-11
      כאשר fA מציין את הכמות החלקית של תיוג המקבל. משוואה זו כוללת את כל התיקונים עקב תיוג צבע ופלואורסצנציה של מקבלים.
    4. חישוב מרחקי FRET מהיעילות באמצעות המשוואה הבאה:
      figure-protocol-12
      באמצעות הערך R0 המתקבל בשלב 3.6.5.
    5. חשב את יעילות ה-FRET באמצעות אורך חיים פלואורסצנטי של התורם בלבד ודגימות מקבלי התורם בלבד שנמדדו בשלב 4.3.3-4.3.5:
      figure-protocol-13
    6. השתמש באורך החיים המשוקלל משרעת כדי לחשב את יעילות ה- FRET ולהשוות לתוצאות במצב יציב5.
      figure-protocol-14
    7. חשב את המרחק כשלב 5.1.4 מהיעילות שנקבעה על-ידי אורך החיים הפלואורסצנטי. השווה ערכים במצב יציב ובזמן שנפתרו עבור יעילות ומרחקים של FRET וודא שהם נמצאים בשגיאה זה מזה.

6. מיפוי המרחקים

  1. השתמש במרחקים המחושבים כדי למפות את אתר האיגוד במבנה התלת-ממדי. חשב את המרחקים והשגיאות עבור כל זוגות הצבעים והמיקומים שנבדקו באמצעות המשוואה הנתונה בערכי שלב 5.1.4 ו-R0 שהתקבלו בשלב 3.6.5 עבור כל זוג FRET.
    1. השתמש בתוכנית צפייה גרפית תלת-ממדית כגון PyMOL50 כדי למפות את המרחקים על המבנה (סקריפט המופיע בקובץ משלים). ניתן להזין פקודות מהסקריפט ישירות לחלון הפקודה עם מידע המרחק המתאים.
    2. צור מעטפת עבור כל מרחק שנמדד והשגיאה הקשורה אליו (איור 3, איור 4, איורים משלימים 1-3).
    3. מפה את המיקום דרך ההצטלבות של הקונכיות השונות (איורים משלימים 1-3). אתר קשירת פפטיד האותות מופה דרך שלושת המיקומים השונים ב-SecA וב-SecYEG ובארבעה מיקומים שונים על פפטיד האות (איור 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מחקר זה התמקד בקביעת המיקום של אתר קשירת הפרהפרוטאין ב- SecA לפני הכנסת הפרפרוטאין לערוץ SecYEG. כדי למפות את אתר הקשירה, ניסויי FRET בוצעו בין אזורים שונים של הפרפרוטאין ושלושה מיקומים נפרדים בחלבוני SecA ו-SecYEG (איור 1A-D). מהמרחקים שהתקבלו והמבנים התלת-ממדיים של SecA, SecYEG והפרפרוטאין, נחזה המיקום של אתר הקישור של פרפרוטאין. במקום להשתמש בשלוש ישויות נפרדות (SecA, SecYEG ופרפרוטאין) כדי לבצע מדידות אלה, רצף האותות של PhoA חובר ל-SecA באמצעות שינוי גנט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

באמצעות שימוש במתודולוגיית המיפוי של FRET, זיהינו את אתר קשירת רצף האותות בחלבון SecA. חשוב לציין שנוכחותו של מבנה גבישי תלת-ממדי של המתחם הקלה מאוד על המחקר שלנו. כוחה של מתודולוגיית מיפוי זו טמון ביכולת להשתמש במבנה קיים כדי לזהות מיקומים לתיוג. לא ניתן להשתמש במתודולוגיה זו כדי לקבוע מבנה תלת-ממדי; עם זאת, קביעת אלמנטים מבניים56, חידוד מבנה קיים49, קביעת מיקום אתר מחייב 2,32, או הבהרת תנועה דינמית

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק R15GM135904 של המכונים הלאומיים לבריאות (הוענק ל- IM) ומענק המכונים הלאומיים לבריאות GM110552 (הוענק ל- DBO).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
490 ננומטר LEDלייזר Horiba1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO AlkyneLife TechnologiesA20347
AgarDifcoDF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO AlkyneLife TechnologiesA10254
Alexa Fluor 488 DIBO AlkyneLife TechnologiesS10904
Alexa Fluor 647 DIBO AlkyneLife TechnologiesS10906
Amicon Ultra­ 4 מסנן צנטריפוגלי (50kDa MWCO)SigmaUFC805008
Dodecylmaltoside (DDM)AnatraceD310
E. coli פפטיד אות פוספטאז אלקליין SP22ביומולקולות המערב התיכוןN/Aפריט מותאם אישית מסונתז
פפטיד אות מורחב SP41ביומולקולות המערב התיכוןN/Aפריט מותאם אישית מסונתז
FluorEssenceHoribaגרסה 2.4תוכנית רכישה ספקטרלית עבור ספקטרופלואורומטר פלואורומקס4 ספקטרופלואורומטר
פלואורומקס 4HoribaN/A
GlobalsWEמעבדה לדינמיקה פלואורסצנטית, אוניברסיטת קליפורניה, תוכניתניתוח ספקטרלי אירווין
H­ 4 וביישן; אזידו וביישן; ביישן; OHBACHEM4020250.0001
LB (מילר) מרקפישר סיינטיפיקBP9723
Ludox HS-40 סיליקה קולואידית (40% משקל השעיה ב-H2O)420816 של סיגמא-אולדריץ'כדי ליצור פתרון פיזור נכון
PTI Felix GXHoribaגרסה 4.1.0.4096תוכנית רכישה ספקטרלית עבור PTI Time Master Instrument
PTI Time Master מכשירHoribaNA
Pymol תוכנית גרפיקה מולקולריתSchrodingerגרסה 2.4
אמבט מיםThermo ScientificNESLAB RTE 10
לדעיכות שנפתרו בזמןיש צורך בדילול

מקורות

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochemistry. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. Scientific, T. F. R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes - Table 1.6. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021).
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), Basel, Switzerland. 1488(2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, Clifton, N.J. 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492(2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140(2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433(2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622(2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), New York, N.Y. 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872(2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021).
  44. Click Chemistry - Section 3.1. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021).
  45. Correction Factor. AAT Bioquest. , Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019).
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011).
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific. , Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011).
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochemistry. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4. , Schrodinger, LLC. New York. Available from: https://pymol.org/2/ (2021).
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , The Royal Society of Chemistry. 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

FRETDNASecA SecYEG
מיפוי העברת אנרגיית תהודה של Förster: מתודולוגיה חדשה להבהרת תכונות מבניות גלובליות
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.