הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד וסינון מהמגוון הביולוגי בקרקע עבור פטריות המעורבות בהתדרדרות של חומרים סרבנים

5.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63445

⸱

16 במאי 2022

 ,  , 
1Laboratory of Mycology, Department of Earth and Environmental Sciences, University of Pavia

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבדיקת המגוון הביולוגי בקרקע כדי לחפש זנים פטרייתיים המעורבים בפירוק של חומרים סרבנים. ראשית, זנים פטרייתיים המסוגלים לגדול על חומצות הומיות או ליגנוצלולוז מבודדים. פעילותם נבדקת לאחר מכן הן במבחנים אנזימטיים והן במזהמים כגון פחמימנים ופלסטיק.

תקציר

זיהום סביבתי הוא בעיה הולכת וגוברת, וזיהוי פטריות המעורבות בתהליך הביו-רמדיה הוא משימה חיונית. אדמה מארחת מגוון מדהים של חיים מיקרוביאליים ויכולה להיות מקור טוב לפטריות ביולוגיות אלה. עבודה זו נועדה לחפש פטריות אדמה עם פוטנציאל שיקום ביולוגי באמצעות בדיקות סינון שונות. מדיית תרביות מינרלים בתוספת חומרים סרבנים כמקור הפחמן היחיד שימשה כמבחני גדילה. ראשית, דילול הקרקע צופה על צלחות פטרי עם מדיום מינרלי מתוקן עם חומצות הומיות או lignocellulose. המושבות הפטרייתיות הגדלות בודדו ונבדקו על מצעים שונים, כגון תערובות מורכבות של פחמימנים (פטרולאטום ושמן מנוע משומש) ואבקות של פולימרים פלסטיים שונים (PET, PP, PS, PUR, PVC). בדיקות אנזימטיות איכותיות נקשרו לבדיקות הגדילה כדי לחקור את הייצור של אסטרזות, לקאזות, פרוקסידאזות ופרוטאזות. אנזימים אלה מעורבים בתהליכי הפירוק העיקריים של חומר סרבני, וההפרשה המכוננת שלהם על ידי הזנים הפטרייתיים שנבדקו עשויה להיות בעלת פוטנציאל להיות מנוצל לצורך רה-שיקום ביולוגי. יותר מ-100 זנים בודדו ונבדקו, ונמצאו כמה מבודדים עם פוטנציאל שיקום ביולוגי טוב. לסיכום, בדיקות הסינון המתוארות הן שיטה קלה ובעלות נמוכה לזיהוי זנים פטרייתיים עם פוטנציאל לשיקום ביולוגי מהקרקע. בנוסף, ניתן להתאים את בדיקות הסינון למזהמים שונים, על פי הדרישות, על ידי הוספת חומרים סרבניים אחרים למדיה תרבותית מינימלית.

מבוא

אדמה היא מרכיב בסיסי בחיים על פני כדור הארץ והיא הבסיס למערכות אקולוגיות רבות. המינרלים, החומר האורגני והמיקרואורגניזמים בקרקע יכולים להיחשב כמערכת אחת, עם קשרים הדוקים ואינטראקציות המתרחשות ביניהם. לאינטראקציות של תרכובות אלה יש השפעה חשובה על תהליכים יבשתיים, איכות הסביבה ובריאות המערכת האקולוגית1. זיהום קרקע מציב בעיות סביבתיות חמורות ברחבי העולם. ליישום חסר ההבחנה, ארוך הטווח והמופרז של חומרים סרבנים ורעילים, כגון חומרי הדברה, מוצרי נפט, פלסטיק וכימיקלים אחרים, יש השפעות חמורות על האקולוגיה של הקרקע, וכתוצאה מכך, הוא יכול לשנות את המיקרוביוטה של הקרקע. קהילות מיקרוביאליות בקרקעות מורכבות ממגוון רחב של אורגניזמים במצבים פיזיולוגיים שונים, כאשר רובם הם חיידקים ופטריות. לרבים מהמזהמים בקרקעות יש יציבות לטווח בינוני עד ארוך, וההתמדה שלהם עלולה להוביל לפיתוח מנגנוני הסתגלות המאפשרים למיקרואורגניזמים להשתמש בחומרים סרבנים כחומרים מזינים 2,3. מיקרואורגניזמים אלה יכולים, אם כן, להיחשב עבור טכניקות bioremediation.

Bioremediation מנסה למתן את ההשפעות של זיהום על ידי שימוש במיקרואורגניזמים ובאנזימים שלהם לפירוק או טרנספורמציה של פסולת לתרכובות פחות רעילות או לא רעילות. מינים שונים של ארכיאה, חיידקים, אצות ופטריות הם בעלי יכולת התחדשות ביולוגית זו4. כתוצאה מהפעולות המתכלות המסוימות שלהם, פטריות הן אורגניזמים מבטיחים במיוחד עבור bioremediation. הם יכולים לתקוף מצעים שונים באמצעות רשת ההיפל שלהם, מה שמאפשר להם לחדור למטריצת הקרקע בצורה יעילה יותר מאשר מיקרואורגניזמים אחרים. בנוסף, הם יכולים להגיע לאינטרסטים בלתי נגישים שבהם קשה להסיר מזהמים5, והם יכולים גם לשרוד רמות לחות נמוכות6. יתר על כן, פטריות מסנתזות קלטות שונות של אנזימים לא ספציפיים, בדרך כלל כדי לפרק חומרים סרבנים טבעיים כגון תאית, ליגנין וחומצות הומיות. אלה שאין להם את מצע המטרה יכולים להיות מעורבים בפירוק של מגוון רחב של מזהמים סרבנים, כגון פחמימנים, פלסטיק וחומרי הדברה 7,8,9,10. לכן, למרות שמינים פטרייתיים רבים כבר דווחו כסוכנים ביולוגיים, יש עניין גובר לחקור מינים שעדיין לא נחקרו כדי לבחור מועמדים לתיקון ביולוגי של חומרים מזהמים סרבניים. המינים שכבר ידועים כבעלי תכונות ביולוגיות שייכים לפילה אסקומיקוטה 11,12,13, באסידיומיקוטה14,15 ומוקורומיקוטה. לדוגמה, הסוגים פניציליום ואספרגילוס ידועים כמעורבים בפירוק של פחמימנים אליפטיים13, פולימרים פלסטיים שונים 16,17,18, מתכות כבדות19 וצבעים20. באופן דומה, מחקרים שבוצעו על פטריות basidiomycetes, כגון Phanerochaete chrysosporium ו- Trametes versicolor, חשפו את מעורבותם בחמצון של חומרים סרבנים כגון פחמימנים ארומטיים13 ופלסטיק21. דוגמה נוספת לפטריות המעורבות בתהליכי ההתכלות הביולוגית הן הזיגומיסטים Rhizopus spp., Mucor spp., ו- Cunninghamella spp.22,23. בפרט, קנינגהם מסוגלת לאקסידאז פחמימנים ארומטיים ונחשבת לאורגניזם מודל לחקר ניקוי רעלים של מוצרים ממגוון רחב של קסנוביוטיקה13.

ישנם מספר אנזימים פטרייתיים המעורבים בתהליכים המשפילים העיקריים של חומרים סרבנים24,25, כגון אסטראז, לקאז, פרוקסידאז ופרוטאז. לקאזות הן אוקסידאזות המכילות נחושת המיוצרות בתא ומופרשות לאחר מכן, המאפשרות חמצון של מגוון תרכובות פנוליות וארומטיות. הם יכולים לפרק אורתו ופרה-דיפנולים, את הפנולים המכילים את קבוצת האמינו, את הליגנין ואת הדיאמינים המכילים את קבוצת האריל26. פרוקסידאזות משתמשות במי חמצן כמתווך כדי לפרק את הליגנין ותרכובות ארומטיות אחרות. ישנם פרוקסידאזות רבות ושונות, אך אלה עם הפוטנציאל הגדול ביותר לפרק חומרים רעילים הם ליגנין פרוקסידאז ומנגן פרוקסידאז27.

אסטרזות ופרוטאזות שייכות לקבוצת האנזימים החוץ-תאיים או האקטו-תאיים, הפועלים מחוץ לתאי המוצא שלהם אך עדיין קשורים אליהם. אנזימים אלה יכולים לזרז את ההידרוליזה של מולקולות סרבניות גדולות למולקולות קטנות יותר. בשל הספציפיות הנמוכה שלהם לסובסטרט, אנזימים אלה יכולים למלא תפקיד מפתח בחידוש ביולוגי של מזהמים שונים, כגון צבעי טקסטיל, שפכים המשתחררים מתעשיות העיסה והנייר ושיזוף עור, מוצרי נפט, פלסטיק וחומרי הדברה 28,29,30.

מספר שיטות סינון לבחירה עבור זנים פטרייתיים ביו-רמדיקטיביים כבר פורסמו. לדוגמה, מדיום אגר מבוסס קש שימש לסינון פטריות ריקבון לבן עם פוטנציאל גבוה בהתפרקות הפחמימנים הארומטיים הפוליציקליים (PAH)31; ופיסות קטנות של עץ נרקב הונחו על אגר תמצית מאלט (MEA) כדי לבודד פטריות נרקבות עץ32. עם זאת, רוב השיטות שכבר הוצעו בוחרות פטריות ספציפיות מאוד לפעילות העניין שלהן. מחקר זה מציע גישה רחבה יותר לבחירת פטריות אדמה עם טווח פעולה רחב יותר. השיטה מסתמכת על ציפוי ראשוני של דילולים סדרתיים של דגימות קרקע על מדיום מתוקן עם חומצות הומיות או lignocellulose מעורבב עם אנטיביוטיקה כדי לבחור פטריות עם היכולת לפרק את החומרים הסרבניים הטבעיים האלה. חומצות הומיות וליגנוצלולוז, למעשה, הן חומרים עמידים מאוד להתכלות ביולוגית מכיוון שיש להם מבנים מולקולריים מורכבים מאוד, וזה מאפשר להם להיות אינדיקטורים מצוינים ליכולת המשפילה של הפטריות שנבדקו33,34. לאחר מכן, הפטריות שנבחרו בבדיקות הראשונות נבדקות כדי לזהות את אלה שיש להן פוטנציאל לפגוע במזהמים ספציפיים כמו פטרולאטום, שמן מנוע משומש ופלסטיק. לבסוף, בדיקות אנזימטיות איכותיות מבוצעות כדי לזהות זנים פטרייתיים המסוגלים לייצר אנזימים המעורבים בתהליכי הפירוק הביולוגי של חומרים סרבנים. לשם כך נערכות בדיקות פרוטאז ואסטראז, בעוד שחומצה גאלית וגואיקול משמשות כאינדיקטורים ללקאז ולייצור אנזים לינינוליטי אחר35,36. מצעים אלה משמשים משום שנמצא מתאם חזק בין יכולתן של פטריות לחמצן אותן לצורתן החומה לבין החזקת היכולת הלינינוליטית 37,38,39.

באמצעות פרוטוקולים אלה, ניתן לבודד זנים פטרייתיים בעלי פוטנציאל מתכלה גבוה וקשת רחבה של פעולה ישירות מדגימות קרקע. הבידוד של הזנים הפטרייתיים האלה יכול לעזור למצוא מועמדים חדשים למטרות של רה-מדיה ביולוגית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. בחירת זנים פטרייתיים המסוגלים לפרק חומרים סרבנים מהאדמה

  1. הכנת תמיסה אנטיביוטית.
    1. מכניסים לפניצילין (50 מ"ג/ל'), סטרפטומיצין (40 מ"ג/ל'), כלורטטרציקלין (40 מ"ג/ל'), ניאומיצין (100 מ"ג/ל') וכלוראמפניקול (100 מ"ג/ל') לתוך 250 מ"ל של מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה.
    2. לפני הוספת כלורמפניקול לתמיסה האנטיביוטית, ממיסים אותו ל-3 מ"ל של ≥99% אתנול.
    3. מניחים את התמיסה האנטיביוטית על מערבל מגנטי (ללא חום) עם מוט ערבוב מגנטי בתוך התמיסה למשך 10 דקות. אחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת מדיה צמיחה.
    1. שים 1 גרם של חומצה הומית מסחרית, 3.26 גרם של מרק בושנל-האס (BH), ו-15 גרם של אגר לתוך 1 ליטר של מים שעברו דה-יוניזציה והכניס אותו באופן אוטומטי למשך 20 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס (אגר חומצה הומית).
    2. מכניסים את אגר החומצה ההומית לכלי פטרי מתחת לארון זרימה למינרי.
    3. שים 4 גרם של lignocellulose, 3.26 גרם של BH, ו 15 גרם של אגר לתוך 1 L של מים deionized ו autoclaveveed אותו במשך 20 דקות ב 121 °C (lignocellulose agar).
    4. צלחת את האגר lignocellulose לתוך צלחות פטרי תחת ארון זרימה למינרי.
    5. מתחת לארון זרימה למינרי, לאחר שהתקשורת התמצקה בצלחות פטרי, מעבירים 1 מ"ל של תמיסת האנטיביוטיקה על הצלחות המוכנות באמצעות מזרק סטרילי עם מסנן 0.2 מיקרומטר כדי לעקר אותו.
    6. מפזרים את התמיסה האנטיביוטית באופן שווה על משטחי הצלחת באמצעות מפזר תאים חד פעמי סטרילי בצורת L ומניחים לו להתייבש באוויר מתחת לארון הזרימה הלמינרי.
    7. שים 20 גרם של מרק תמצית מאלט ו -15 גרם של אגר לתוך 1 ליטר של מים שעברו דה-יוניזציה ו autoclaveve אותו במשך 20 דקות ב 121 ° C (תמצית מאלט אגר - MEA).
    8. צלחת את ה- MEA לתוך צלחות פטרי מתחת לארון זרימה למינרי.
  3. דגימת קרקע ודילול קרקע.
    1. דוגם את האדמה המעניינת בעומק של 10 ס"מ, מסירים את הצמחים, העשב והעלים המתים מהשכבה העליונה, ומכניסים אותה לשקיות פוליאתילן סטריליות.
    2. לאחר ההגעה למעבדה, מסננים את הקרקע באמצעות רשת 2 מ"מ, תוך הסרת כל השורשים ופסולת הצמחים.
    3. אם לא ניתן להמשיך בניתוח במורד הזרם באופן מיידי, אחסן את דגימות הקרקע המסוננות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    4. בעבודה מתחת לארון זרימה למינרי, הכניסו 1 גרם מהאדמה המסוננת לצינור סטרילי של 15 מ"ל עם 10 מ"ל של מים עבריינים סטריליים (1 x 10-1 דילול). לנער את הצינור אופקית במשך 30 דקות.
    5. מתחת לארון זרימה למינרי, לפני שהמתלים מתיישבים, קחו 1 מ"ל של דילול 1 x 10-1 עם פיפטה סטרילית והעבירו אותה ל-9 מ"ל של מים ריקים שעברו דה-יוניזציה (1 x 10-2 דילול). מערבולת אותו ביסודיות.
    6. לפני שהמתלים מתיישבים, קחו 1 מ"ל של דילול 1 x 10-2 עם פיפטה סטרילית והעבירו אותה ל-9 מ"ל של מים ריקים שעברו דה-יוניזציה (1 x 10-3 דילול). מערבולת אותו ביסודיות.
  4. ציפוי דילולים בקרקע במדיה סלקטיבית.
    1. בעבודה מתחת לארון זרימה למינרי, לאסוף 100 μL של דילול 1 x 10-3 באמצעות micropipette עם נקודה סטרילית ולהעביר אותו על צלחת אגר פטרי humic. עשו זאת עבור לפחות 4 או 5 צלחות פטרי.
    2. מפזרים את הדילול באופן שווה על משטח צלחת פטרי באמצעות מפיץ תאים חד פעמי סטרילי בצורת L.
    3. תנו לו להתייבש באוויר במשך 10-15 דקות מתחת לארון הזרימה הלמינרי.
    4. חזור על שלבים 1.4.1.-1.4.3. באמצעות כלי פטרי ליגנוצלולוז.
    5. דגירה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך למשך 15 יום לכל היותר.
  5. בידוד של מושבות פטרייתיות שגדלו ממדיה סלקטיבית למדיה של צמיחה.
    1. החל מ-3 ימים לאחר ההכנה, בדקו מדי יום את מנות הפטרי הסלקטיביות המוכנות למשך 15 יום לכל היותר.
    2. בדוק את כל המושבות הפטרייתיות הקיימות עבור דמיון. במידת הצורך, הכינו שקופית שתצפה תחת מיקרוסקופ אור.
      הערה: המטרה היא לבודד את המספר הגבוה ביותר של מושבות פטרייתיות, אך יש צורך להימנע מלבודד תמיד את אותו זן פטרייתי מצלחות שונות, ולכן בדיקה זו חשובה מאוד. חפשו מושבות עם מאקרו ומיקרומורפולוגיה שונים.
    3. מתחת לארון זרימה למינרי או במבער בונזן, בודדו כל זן פטרייתי שנבחר על ידי הסרה עדינה של חלק קטן מהתפטיר מהמושבה באמצעות מחט חיסון סטרילית והעברתו לצלחת MEA Petri חדשה.
      הערה: בשלב זה, חשוב מאוד להיות עדין ומדויק מכיוון שקיים סיכון גבוה לזיהום ממושבות פטרייתיות אחרות הקיימות בצלחת פטרי המקורית. אם יותר מזן פטרייתי אחד גדל על צלחת ה-MEA המחוסנת, חזרו על שלב 1.5.3.
    4. דגירה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך למשך 7 ימים. אלה הם הזנים הפטרייתיים שיש לבדוק עוד יותר על חומרים סרבנים ספציפיים.

2. מבחני גדילה על חומרים סרבנים

  1. מבחן צמיחה על פטרולאטום.
    1. מעבירים 20 מ"ל של BH נוזלי (3.26 גרם/ליטר של BH) לתוך בקבוקונים של 50 מ"ל ומעקרים אותם על ידי אוטוקלאב בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    2. מעבירים 7 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה לבקבוקוני זכוכית של 15 מ"ל ומוסיפים כמה חתיכות של כיסויי זכוכית שבורים לכל בקבוקון.
    3. לעקר אותם על ידי autoclaving ב 121 °C (66 °F) למשך 20 דקות.
    4. מתחת לארון הזרימה הלמינרי, הוסיפו 1 מ"ל של פטרולאטום לכל בקבוקון 50 מ"ל BH באמצעות פיפטה סטרילית. שמור כמה בקבוקונים עם רק BH כמו שליטה שלילית.
    5. מתחת לארון הזרימה הלמינרי, הסר את התפטיר על פני השטח של המדיום מלוחות MEA עם הזנים הפטרייתיים שנבחרו (שהוכנו בשלב 1.5.3.) באמצעות מחט סטרילית והעבר אותה לבקבוקוני זכוכית של 15 מ"ל עם הכיסויים השבורים.
    6. התסיסו כל בקבוקון על מערבל מערבולת למשך 2 דקות, מה שמאפשר לכיסויים השבורים לחתוך את הקובייה של המושבה הפטרייתית, וליצור תרחיף פטרייתי.
    7. חסן כל בקבוקון פטרולאטום עם 200 μL של תרחיף פטרייתי. הכינו שני שכפולים לכל זן פטרייתי.
    8. עבור השליטה השלילית, לשים 200 μL של תרחיף פטרייתי לתוך בקבוקונים עם רק BH נוזלי. יתר על כן, לשמור על כמה בקבוקונים עם petrolatum ללא כל חיסון פטרייתי כדי לבדוק זיהום במדיום.
    9. דגירו את הבקבוקונים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך ובדקו אותם לאחר 15 יום ו-30 יום מהאינוקולום.
  2. מבחן צמיחה על שמן מנוע משומש.
    1. שים 3.26 גרם של BH ו-15 גרם של אגר לתוך 1 ליטר של מים שעברו דה-יוניזציה והכניס אותו אוטומטית למשך 20 דקות ב-121 מעלות צלזיוס (BHA).
    2. צלחת את ה- BHA לתוך צלחות פטרי מתחת לארון זרימה למינרי.
    3. לאחר שהתמצק, העבירו 500 μL של שמן מנוע משומש על צלחות ה-BHA Petri ופיצו אותו באופן שווה על משטחי הצלחת באמצעות מפזר תאים חד פעמי סטרילי בצורת L.
    4. חסן כל צלחת BHA שמן מנוע משומשת עם כל זן פטרייתי, ואסף את התפטיר מהלוחות שהוכנו בשלב 1.5.3. עבוד במבער Bunsen או מתחת למכסה מנוע זרימה למינרי כדי למנוע זיהום. הכינו שני שכפולים לכל זן פטרייתי.
    5. עבור השליטה השלילית, לחסן את צלחות פטרי עם BHA בלבד. יתר על כן, שמור כמה כלי שמן מנוע משומשים BHA פטרי ללא כל חיסון פטרייתי כדי לבדוק זיהום במדיום.
    6. דגירו את צלחות הפטרי בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך ובדקו אותן לאחר 15 יום ו-30 יום מהאינוקולום.
  3. מבחן גדילה על פלסטיק.
    1. מעבירים 200 μL של תרחיף פטרייתי (שלבים 2.1.5.-2.1.6.) לתוך צלחת של 96 מיקרווול. הכינו שלושה העתקים של שילוב הזן-פלסטיק הפטרייתי.
    2. לכל באר עם ההשעיה הפטרייתית, להוסיף 10 מ"ג של סוג אחר של אבקת פלסטיק (פוליאתילן טרפתלט - PET, פוליוויניל כלוריד - PVC, פוליאתילן בצפיפות גבוהה - HDPE, פוליסטירן - PS, פוליאוריתן - PUR).
    3. עבור הבקרה השלילית, במקום להוסיף את אבקת הפלסטיק, להוסיף 200 μL של תמיסת BH מעוקרת לבאר עם המתלים הפטרייתיים. יתר על כן, עבור כל סוג של אבקת פלסטיק, למלא באר עם 200 μL של תמיסת BH מעוקרת ו 10 מ"ג של כל אבק פלסטיק כדי לבדוק זיהום של המדיום.
    4. דגירה של לוחות המיקרווול בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך ובדקו אותן לאחר 15 יום ו-30 יום מהאינוקולום.

3. מבחנים אנזימטיים איכותיים

  1. אנזימים ליינינוליטיים איכותיים בדיקת קולורימטריה.
    1. שים 27 גרם של ציר דקסטרוז תפוחי אדמה (PD) ו -15 גרם של אגר לתוך 1 L של מים שעברו דה-יוניזציה ו autoclaveed אותו במשך 20 דקות ב 121 ° C (PDA).
    2. כאשר המדיום התקרר מעט אך עדיין נוזלי, מוסיפים חומצה גאלית (5 גרם/ליטר) מתחת למכסה מנוע זרימה למינרי ומכניסים את המדיום לכלי פטרי.
    3. חסן את לוחות החומצה הגאלית + PDA + עם כל זן פטרייתי, ואסף את התפטיר מהצלחות שהוכנו בשלב 1.5.3. עבוד במבער Bunsen או מתחת למכסה מנוע זרימה למינרי כדי למנוע זיהום.
    4. כבקרה שלילית, מכינים צלחות פטרי עם PDA בלבד (ללא חומצה גאלית) ומחסנים אותן עם הזנים הפטרייתיים (אחד לכל זן פטרייתי), כמו גם צלחת פטרי אחת עם PDA + חומצה גאלית וללא חיסון פטרייתי.
    5. דגירו את צלחות הפטרי בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך ובדקו אותן לאחר 7 ימים מהאינוקולום.
  2. מבחן קולורימטרי איכותי של לקאזות.
    1. שים 27 גרם של PD ו-15 גרם של אגר לתוך 1 ליטר של מים שעברו דה-יוניזציה והכניס אותו אוטומטית למשך 20 דקות ב-121 מעלות צלזיוס (PDA).
    2. כאשר המדיום התקרר מעט אך הוא עדיין נוזלי, מוסיפים גואיאקול (400 μL/L) מתחת למכסה מנוע זרימה למינרי ומצמידים אותו לכלי פטרי.
    3. חסן את לוחות ה- PDA + guaiacol עם כל זן פטרייתי, ואסף את התפטיר מהלוחות שהוכנו בשלב 1.5.3. עבוד במבער Bunsen או מתחת למכסה מנוע זרימה למינרי כדי למנוע כל זיהום.
    4. כבקרות שליליות, הכינו צלחות פטרי עם מחשב כף יד בלבד (ללא גואיאקול) וחסנו אותן עם הזנים הפטרייתיים (אחד לכל זן פטרייתי), כמו גם צלחת פטרי אחת עם PDA + guaiacol וללא חיסון פטרייתי.
    5. דגירו את צלחות הפטרי בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך ובדקו אותן לאחר 7 ימים מהאינוקולום.
  3. בדיקת פרוטאזות איכותיות.
    1. הכן את המדיום של YES על ידי הוספת K2HPO4 (1 גרם/ל' ), KH2PO4 (0.5 גרם/ל' ), MgSO4·7H2O (0.5 גרם/ל'), MnCl2·4H2O (0.001 גרם/ל'), CuCl2·2H2O (1.4 x 10-5 גרם/ל'), ZnCl2 (1.1 x 10-5 גרם/ל' ), CoCl2·6H2O (2 x 10-5 גרם/ל'), Na2MoO4·2H2O (1.3 x 10-5 גרם/ליטר), FeCl3·6H2O (7.5 x 10-5 גרם/ליטר), וג'לטין/פפטון (0.02 גרם/ליטר) למים שעברו דה-יוניזציה.
    2. הניחו את מדיום ה-YES על מערבל מגנטי (ללא חום) עם מוט ערבוב מגנטי בתוך המדיום למשך 10 דקות.
    3. כאשר כל המלחים התמוססו לתוך המדיום, להעביר 5 מ"ל של התמיסה לתוך 20 מ"ל בקבוקוני זכוכית סטריליים autoclaveve אותם autoclaveed אותם במשך 20 דקות ב 121 °C (66 °F).
    4. עבור השליטה השלילית, להכין כ 20 מ"ל בקבוקוני זכוכית סטריליים עם 5 מ"ל של תמיסת BH autoclaveve אותם autoclaveveed אותם במשך 20 דקות ב 121 °C (66 °F).
    5. תחת ארון זרימה למינרי, יש להעביר 200 μL של תרחיף פטרייתי (שלבים 2.1.5.-2.1.6.) עבור כל זן לבקבוקונים המעוקרים הבינוניים של YES (יש ליצור לפחות 2 שכפולים לכל זן פטרייתי). עבור כל זן פטרייתי, יש להוסיף 200 μL של אותה תרחיף פטרייתי לבקבוקונים מעוקרים BH כדי לקבל שליטה שלילית.
    6. דגירה של הבקבוקונים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך למשך 21 יום ובדקו אותם כל 7 ימים.
  4. מבחן אסטרזות איכותיות.
    1. הכן את המדיום Tween 80 על ידי הוספת פפטון (10 גרם /ליטר), NaCl (5 גרם / L), CaCl2 (0.1 גרם / L) ו - 10 מ"ל של Tween 80 עד 1 L של מים deionized.
    2. הניחו את מדיום Tween 80 על מערבל מגנטי (ללא חום) עם מוט ערבוב מגנטי בתוך המדיום למשך 10 דקות.
    3. כאשר הכל נמס בתוך המדיום, להעביר 5 מ"ל של התמיסה לתוך 20 מ"ל בקבוקוני זכוכית סטריליים autoclaveve אותם autoclaveed אותם במשך 20 דקות ב 121 °C (66 °F).
    4. עבור השליטה השלילית, להכין כ 20 מ"ל בקבוקוני זכוכית סטריליים עם 5 מ"ל של תמיסת BH autoclaveve אותם autoclaveveed אותם במשך 20 דקות ב 121 °C (66 °F).
    5. תחת ארון זרימה למינרי, העבירו 200 μL של מתלים פטרייתיים (שלבים 2.1.5.-2.1.6.) עבור כל זן לבקבוקונים המעוקרים הבינוניים Tween 80 (בצעו לפחות 2 שכפולים לכל זן פטרייתי). עבור כל זן פטרייתי, יש להוסיף 200 μL של אותה תרחיף פטרייתי לבקבוקונים מעוקרים BH לשליטה שלילית.
    6. דגירה של הבקבוקונים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך למשך 21 יום ובדקו אותם כל 7 ימים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שיטות המדיה הסלקטיביות (סעיף 1 של הפרוטוקול) אפשרו לסנן את המגוון הביולוגי העשיר של הקרקע ולבחור את הפטריות בעלות פוטנציאל ההשבחה הביולוגי הגבוה. עם החומצה ההומית והליגנוצלולוז, בודדו יותר מ-100 זנים פטרייתיים. פטריות אלה ייצרו אנזימים המעורבים בהתפרקות ביולוגית של חומרים סרבנים טבעיים, בעלי מבנה כימי הדומה למזהמים רבים. עם זאת, הזנים הפטרייתיים שבודדו עם המדיה הסלקטיבית נזקקו לסינון נוסף. באופן ספציפי, הבדיקות הסלקטיביות בודדו את הזנים המסוגלים לפרק חומצות הומיות וליגנוצלולוז, בדיקות הגדילה סקרו את הפטריות המבודדות עבור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המגוון הביולוגי העשיר של האדמה הוא מקור שופע של פטריות בעלות יכולות מטבוליות רבות, שחלקן עשויות להיות מועמדות פוטנציאליות לשיקום ביולוגי. בדיקות מדיה סלקטיביות (סעיף 1 של הפרוטוקול) הן שיטות קלות לביצוע ויעילות לבידוד פטריות המסוגלות לגדול על פולימרים מורכבים טבעיים כמקור הפחמן היחיד שלהן. פטריות יכולות לייצר הידרולזות חוץ-תאיות ולא ספציפיות ואוקסידורדוקטאזות30 כגון האנזימים הליניליטיים לקאזות ופרוקסדזות31. אנזימים אלה יכולים לפרק את הליגנוצלולוז וחומצות הומיות, אך גם קסנוב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לסקואולה די אלטה פורמציונה דוטוראלה (SAFD) מאוניברסיטת פאביה ולפרופסור סולביג טוסי על מתן ההזדמנות לעבודה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
96 צלחת מיקרווולגריינר ביו-וואן650185
אגרVWR84609.05
מרק בושנל-האספלוקהB5051
CaCl2Sigma-AldrichC5670
כלורואמפניקולEurobioGABCRL006Z
כלורטטרציקליןסיגמא-אולדריץ'
CoCl2· 6H2OSigma-AldrichC8661
CuCl2· 2H2OSigma-AldrichC3279
אתנולVWR כימיקלים20821.296
FeCl3· 6 ש'<תת>2Oמסנן 236489 סיגמא-אולדריץ
mWhatman10462200
חומצה גאליתSigma-AldrichG7384
החלקות כיסוי זכוכיתBiosigmaVBS634
בקבוקוני זכוכית 15 מ"לSciLabwareP35467
guaiacolSigma-AldrichG5502
פוליאתילן בצפיפות גבוהה (HDPE)Sigma-Aldrich434272
חומצות הומיותAldrich Chemistry53680
K2HPO4Sigma-AldrichP8281
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
Lignocellulose//פסולת ייצור ביו-אתנול מעוקר
מפזר תאים בצורת LLaboindustria S.p.a21133
בוחש מגנטיA.C.E.F8235
תמצית מאלט מרקסיגמא-אולדריץ'70146
MgSO4· 7H2OSigma-AldrichM2643
Micropipette 1000 μ LGilsonFA10006M
Micropipette 200  μ LGilsonFA10005M
MnCl2· 4H2OSigma-AldrichM5005
Na2MoO4· 2H2O Sigma-AldrichM1651
NaClSigma-AldrichS5886
NeomycinSigma-AldrichN0401000
PenicillinSigma-Aldrich1504489
פפטוןSigma-Aldrich83059
פוליאתילן טרפתלט (PET)GoodfellowES306031
מנות פטריLaboindustria S.p.a21050
פטרולטום (נוזל פרפין)A.C.E.F
009661 מרק דקסטרוז תפוחי אדמהסיגמא-אולדריץ'P6685
פוליסטירן (PS)סיגמא-אולדריץ' 331651
פוליאוריטן (PUR)סיגמא-אולדריץ'GF20677923
פוליוויניל כלוריד ( PVC)Sigma-Aldrich81388
צינור בז סטריליGreiner bio-one227 261
בקבוקוני זכוכית סטריליים 20 מ"לSigma-AldrichSU860051
נקודה סטרילית 1000  μ LGilsonF172511
נקודה סטרילית 200  μ LGilsonF172311
שקיות פוליאתילן סטריליותWHIRL-PAKB01018
קרני מזרק סטריליות5523CM25
StreptomycinSigma-AldrichS-6501
Tween 80Sigma-AldrichP1754
שמן מנוע משומש//תערובת מורכבת של פחמימנים, תוספי מנוע ומתכות, המסופקת על ידי חברה פרטית איטלקית
בקבוקונים 50 מ"לSigma-Aldrich33108-U
ZnCl2Sigma-AldrichZ0152
Y0001451' 0.2 ומיקרו;

מקורות

  1. Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
  2. Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S. Key fungal degradation patterns, enzymes and their applications for the removal of aliphatic hydrocarbons in polluted soils: A review. International Biodeterioration and Biodegradation. 147, (2020).
  3. Asemoloye, M. D., Ahmad, R., Jonathan, S. G. Synergistic action of rhizospheric fungi with Megathyrsus maximus root speeds up hydrocarbon degradation kinetics in oil polluted soil. Chemosphere. 187, 1-10 (2017).
  4. Abatenh, E., Gizaw, B., Tsegaye, Z., Wassie, M. The role of microorganisms in bioremediation - A review. Open Journal of Environmental Biology. 2, 038-046 (2017).
  5. Dix, N. J., Webster, J. Fungal Ecology. , Chapman & Hall. Cambridge, UK. (1995).
  6. Magan, N. Fungi in extreme environment. Environmental and Microbial Relationships. The Mycota. Esser, K., Lemke, P. A. 4, Springer. Berlin, Heidelberg. 99-114 (2007).
  7. Aranda, E. Promising approaches towards biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons with Ascomycota fungi. Current Opinion in Biotechnology. 38, 1-8 (2016).
  8. Hasan, I. F., AI-Jawhari, Role of Filamentous Fungi to Remove Petroleum Hydrocarbons from the Environment. Microbial Action on Hydrocarbons. Kumar, V., Kumar, M., Prasad, R. , Springer. Singapore. (2018).
  9. Daccò, C., et al. Trichoderma: evaluation of its degrading abilities for the bioremediation of hydrocarbon complex mixtures. Applied Sciences. 10 (9), 3152(2020).
  10. Alarcón, A., Davies, F. T., Autenrieth, R. L., Zuberer, D. A. Arbuscular mycorrhiza and petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation of petroleum-contaminated soil. International Journal of Phytoremediation. 10, 251-263 (2008).
  11. Mancera-López, M. E., et al. Bioremediation of an aged hydro-carbon-contaminated soil by a combined system of biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi. International Biodeterioration and Biodegradation. 61, (2008).
  12. Hatami, E., Abbaspour, A., Dorostkar, V. Phytoremediation of a petroleum-polluted soil by native plant species in Lorestan Province, Iran. Environmental Science and Pollution Research. 26, 24323-24330 (2019).
  13. Prenafeta-Boldú, F. X., De Hoog, G. S., Summerbell, R. C. Fungal communities in hydrocarbon degradation. Microbial Communities Utilizing Hydrocarbons and Lipids: Members, Metagenomics and Ecophysiology. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , Springer. Cham. 1-36 (2018).
  14. Gu, J., Ford, T., Mitton, D., Mitchell, R. Microbiological degradation of polymeric materials. Uhlig's Corrosion Handbook. , John Wiley and Sons. 421-438 (2011).
  15. Tuomela, M., Hatakka, A. Oxidative fungal enzymes for bioremediation. Comprehensive Biotechnology: Environmental and Related Biotechnologies. 6, Elsevier. 224-239 (2019).
  16. DSouza, G. C., et al. Fungal biodegradation of low-density polyethylene using consortium of Aspergillus species under controlled conditions. Heliyon. 7 (5), 07008(2021).
  17. El-Sayed, M. T., Rabie, G. H., Hamed, E. A. Biodegradation of low-density polyethylene (LDPE) using the mixed culture of Aspergillus carbonarius and A. fumigates. Environment, Development, and Sustainability. 23 (10), 14556-14584 (2021).
  18. Sepperumal, U., Markandan, M., Palraja, I. Micromorphological and chemical changes during biodegradation of polyethylene terephthalate (PET) by Penicillium sp. Journal of Microbiology and Biotechnology Research. 3 (4), 47-53 (2013).
  19. Leitão, A. L. Potential of Penicillium species in the bioremediation field. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6 (4), 1393-1417 (2009).
  20. Chen, S. H., Ting, A. S. Y. Biosorption and biodegradation potential of triphenylmethane dyes by newly discovered Penicillium simplicissimum isolated from indoor wastewater sample. International Biodeterioration & Biodegradation. 103, 1-7 (2015).
  21. Orhan, Y., Buyukgungor, H. Enhancement of biodegradability of disposable polyethylene in controlled biological soil. International Biodeterioration and Biodegradation. 45, 49-55 (2000).
  22. Deshmukh, R., Khardenavis, A. A., Purohit, H. J. Diverse metabolic capacities of fungi for bioremediation. Indian journal of microbiology. 56 (3), 247-264 (2016).
  23. Viswanath, B., Rajesh, B., Janardhan, A., Kumar, A. P., Narasimha, G. Fungal laccases and their applications in bioremediation. Enzyme research. 2014, 163242(2014).
  24. Ali, M., Husain, Q., Ishqi, H. M. Fungal peroxidases mediated bioremediation of industrial pollutants. Fungal Bioremediation. , CRC Press. Boca Raton. (2019).
  25. Nousiainen, P., Kontro, J., Manner, H., Hatakka, A., Sipilä, J. Phenolic mediators enhance the manganese peroxidase catalyzed oxidation of recalcitrant lignin model compounds and synthetic lignin. Fungal Genetics and Biology. 72, 137-149 (2014).
  26. Srivastava, S., Kumar, M. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): A sustainable approach. Sustainable Green Technologies for Environmental Management. , Springer. Singapore. (2019).
  27. Wei, R., Zimmermann, W. Microbial enzymes for the recycling of recalcitrant petroleum-based plastics: how far are we. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1308-1322 (2017).
  28. Matsubara, M., Lynch, J. M., De Leij, F. A. A. M. A simple screening procedure for selecting fungi with potential for use in the bioremediation of contaminated land. Enzyme and Microbial Technology. 39 (7), 1365-1372 (2006).
  29. Mann, J., et al. Screening and selection of fungi for bioremediation of olive mill wastewater. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (3), 567-571 (2010).
  30. Andlar, M., Rezić, T., Marđetko, N., Kracher, D., Ludwig, R., Šantek, B. Lignocellulose degradation: an overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18, 768-778 (2018).
  31. Goméz-Toribio, V., García-Martín, A. B., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Guillén, F. Induction of extracellular hydroxyl radical production by white-rot fungi through quinone redox cycling. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3944-3953 (2009).
  32. Belcarz, A., Ginalska, G., Kornillowicz-Kowalska, T. Extracellular enzyme activities of Bjerkandera adusta R59 soil strain, capable of daunomycin and humic acids degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 68 (5), 686-694 (2005).
  33. Stevenson, F. J. Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2nd ed. , Wiley. New York. (1995).
  34. Andlar, M., et al. Lignocellulose degradation: An overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18 (11), 768-778 (2018).
  35. Lee, H., et al. Biotechnological procedures to select white rot fungi for the degradation of PAHs. Journal of Microbiological Methods. 97 (1), 56-62 (2014).
  36. Batista-García, R. A., et al. Simple screening protocol for identification of potential mycoremediation tools for the elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons and phenols from hyperalkalophile industrial effluents. Journal of Environmental Management. 198, 1-11 (2017).
  37. Shleev, S. V., et al. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie. 86 (9-10), (2004).
  38. Kiiskinen, L. L., Rättö, M., Kruus, K. Screening for novel laccase-producing microbes. Journal of Applied Microbiology. 97, (2004).
  39. Kumar, V. V., Rapheal, V. S. Induction and purification by three-phase partitioning of aryl alcohol oxidase (AAO) from Pleurotus ostreatus. Applied Biochemistry and Biotechnology. , 163(2011).
  40. Loredo-Treviño, A., Gutiérrez-Sánchez, G., Rodríguez-Herrera, R., Aguilar, C. N. Microbial enzymes involved in polyurethane biodegradation: a review. Journal of Polymers and the Environment. 20 (1), 258-265 (2012).
  41. Garriga, M., et al. Technological and sensorial evaluation of Lactobacillus strains as starter cultures in fermented sausages. International Journal of Food Microbiology. 32 (1-2), 173-183 (1996).
  42. Zerdani, I., Faid, M., Malki, A. Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp. In microcco. African Journal of Biotechnology. 3 (1), 67-70 (2004).
  43. Nygren, C. M., Edqvist, J., Elfstrand, M., Heller, G., Taylor, A. F. Detection of extracellular protease activity in different species and genera of ectomycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 17 (3), 241-248 (2007).
  44. Asemoloye, M. D., et al. Hydrocarbon degradation and enzyme activities of Aspergillus oryzae and Mucor irregularis isolated from Nigerian crude oil-polluted sites. Microorganisms. 8 (12), 1912(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד וסינון מהמגוון הביולוגי בקרקע עבור פטריות המעורבות בהתדרדרות של חומרים סרבנים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.