מאמר שיטה

אופטיקה לא ליניארית ללא תווית לחקר פגמים תלויי טובולין במיאלין המרכזי

2.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63449

⸱

24 במרץ 2023

 ,  ,  ,  , 
1Centro de Investigaciones en Óptica A.C. (CIO), 2Division of Sciences and Engineering, Department of Chemical, Electronic, and Biomedical Engineering, Universidad de Guanajuato, 3Institute of Physiology, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 4Dirección General de Desarrollo Internacional, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

במאמר זה

סיכום

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי אוליגודנדרוציטים טעונים במיקרוטובולים במודל של טובולינופתיה באמצעות גישה פשוטה וחדשנית של מיקרוסקופיה הרמונית מהדור השני.

תקציר

ההדמיה המשביעת רצון של מרכיבים ציטוסקטליים במוח היא מאתגרת. ההתפלגות בכל מקום של רשתות של מיקרוטובולים, מיקרופילמנטים וחוטי ביניים בכל הרקמות העצביות, יחד עם השונות בתוצאות של אסטרטגיות היתוך חלבונים פלואורסצנטיים ויישומם המוגבל למחקרים דינמיים של נוגדנים ותרופות ככלי כרומופור, הופכים את הגישות האופטיות הקלאסיות ללא יעילות כמו עבור חלבונים אחרים. כאשר יש צורך לחקור טובולין, הדור ללא תווית של הרמוניות שניות הוא אופציה מתאימה מאוד בשל הארגון הלא צנטרוסימטרי של המולקולה. טכניקה זו, כאשר מצומדים למיקרוסקופיה, יכולה לתאר באופן איכותי את ההתפלגות הנפחית של צרורות מקבילים של מיקרוטובולים בדגימות ביולוגיות, עם היתרון הנוסף של עבודה עם רקמות טריות שאינן מסודרות ובלתי מנוצלות. עבודה זו מתארת כיצד לדמות טובולין עם מערך מיקרוסקופיה הרמוני מסחרי מהדור השני כדי להדגיש מיקרוטובולים במבנים המועשרים בטובולינים של האוליגודנדרוציטים, כמו בהיפומיאלינציה עם ניוון של הגרעינים הבסיסיים וטובולינופתיה של המוח הקטן (H-ABC), הפרעת מיאלין שתוארה לאחרונה.

מבוא

ההדמיה האופטית של מבנים ציטוסקטליים ברקמות ובהכנות איברים אינה משימה קלה. חוטים ציטוסקטליים נמצאים בכל מקום, כך שאם מבוצעת צביעה גנרית, למשל, נגד אלפא-טובולין או בטא-אקטין או אולי קרטין בדגימת אפיתל, סביר להניח שהאות יופץ בצורה הומוגנית למדי בכל רחבי הדגימה. כדי להגביל את הכתמים לתת-קבוצה משמעותית יותר של רכיבים תאיים, ניתן להשתמש בעכברים מהונדסים עם ביטוי ממוקד1 או לתכנן להשתמש בנוגדנים ספציפיים לאיזופורם. בעוד שמעט מאוד מהאחרונים נמצאים בשוק (ומעטים מאוד קיימים בכלל 2,3,4), מודל של בעלי חיים מהונדסים עשוי להיות זמין. עם זאת, הוא צריך להירכש על ידי המעבדה ולשכן אותו כראוי, עם כל ההוצאות הכרוכות בתהליך. נוגדנים או כימיקלים מסוימים, לדוגמה, תרופות מצומדות פלואורופור כמו פלואידין או פקליטקסל, עשויים להיות לא תואמים באופן חלקי או מלא לשימוש בתאים חיים או ברקמות, ובכך להגביל את תחולתם רק למחקרים של דגימות קבועות.

במקרה של טובולין, יש לקחת בחשבון היבט נוסף, שהוא הרגישות של הפולימר לקיבוע. קיבוע כימי קונבנציונלי עם פורמלדהיד ידוע בכך שאינו מספיק לשמירה אופטימלית על שלמות המיקרוטובולים5. בנוסף, דו"ח שפורסם לאחרונה מאשר כי הצלבת פורמלדהיד גורמת לשינויים עדינים במבנה האולטרה-מבנה של המיקרוטובול, בדומה למה שקורה עם קשירה של תרופות מסוימות או מולקולות פיזיולוגיות כגון GTP6.

ההדמיה הישירה של מיקרוטובולים בדגימות לא מוכתמות ולא מתוקנות היא, אם כן, רצויה לעתים קרובות. כדי להשיג זאת, פתרון טכני אחד הוא מיקרוסקופיה שנייה של הדור ההרמוני (SHG)7, המבוססת על היכולת של צרורות של מיקרוטובולים מקבילים לפעול כהרמונופורים ולפלוט אור כפול תדר כאשר הוא מואר כראוי בלייזר אינפרא אדום אינטנסיבי ופועם. למרות שניתן להפיק אות הרמוני שני חזק ויציב יותר מקולגן וממיוזין, שהם שני החומרים הביולוגיים האחרים היחידים הידועים כבעלי יכולת להכפיל תדרים, האות מטובולין שימש עד כה בעיקר לחקר סידור מחדש של צירים מיטוטיים 8,9,10 ומורפולוגיה של מיקרוטובולים אקסונאליים11,12,13.

בעבודה זו, אנו מציגים שימוש חדשני במיקרוסקופיית SHG ככלי אבחון להבחנה בין רקמות מערכת העצבים המרכזית (CNS) המושפעות מטובולין בטא 4 A (TUBB4A) טובולינופתיה לבין עמיתיהן הבריאים14. חלק מהמוטציות המתרחשות באיזופורם העצבי הזה של טובולין, כמו אלה הגורמות להיתמיאלינציה וניוון של הגרעינים הבסיסיים והמוח הקטן (H-ABC), גורמות למילוי יתר של מיקרוטובול באוליגודנדרוציטים15,16; השינויים הציטוסקטליים, בתורם, קשורים להשפעות במורד הזרם כמו דיסמיאלינציה, עם פגיעה עמוקה במסלולים המוטוריים והחושיים16,17,18,19. מודל הטייפ מורין המשמש בעבודה זו מציג תכולת מיקרוטובולים חריגה באוליגודנדרוציטים ומשחזר את רוב הסימפטומים החושיים-מוטוריים של חולי H-ABC17. הפרוטוקול מסביר כיצד לדמות מבנים כמו קורפוס קלוסום והמוח הקטן, שהם בדרך כלל מאוד מיאלינים ואשר מושפעים קשות בחולים אנושיים, כמו גם בחולדה taiep 19, כדי להדגיש את ההבדלים באותות SH בין רקמות בריאות ומוטנטיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים המתוארים נעשו בהתאם לחוקים ולקודים שאושרו בכותרת השביעית של תקנת חוק הבריאות הכללי בנוגע למחקר בריאותי של ממשלת מקסיקו (NOM-062-ZOO-1999) ובהתאם להמלצות מדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות ניסוי ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לביואתיקה במחקר של אוניברסיטת גואנחואטו ובנמריטה אוניברסידד אוטונומה דה פואבלה.

1. הגדרות מיקרוסקופ

  1. הפעל את מערכת המיקרוסקופיה.
  2. הפעל את הלייזר הפועם כדי להבטיח שהוא יהיה מוכן ללזיה ברמת הספק אופטימלית ויציבה לאחר מיצוי הדגימה והכנתה.
  3. כוונן את הלייזר ל-810 ננומטר. כדי ללמוד microtubules tissular, 10%-20% של כוח הלייזר הזמין משמש, אשר, במערכת המתוארת, מתאים 13-26 mW נמדד במישור המוקד האחורי של המטרה.
  4. ודא שהמיקרוסקופ מיושר על ידי Köhler (קובץ משלים 1), במטרה שתשמש להדמיית SHG.
    הערה: זה חשוב מכיוון שבמערך המסחרי המשמש בעבודה זו, הזיהוי מתבצע במצב שידור ודרך המעבה.
  5. הסר מסננים לא רצויים מנתיב הגילוי האופטי (איור 1A).
  6. ודא שדיאפרגמה המעבה פתוחה במלואה כדי להבטיח שאף אור לא ייעצר שלא לצורך ברמה זו.
  7. הכינו יעד טבילת שמן עם מפתח צמצם מספרי (NA) של 25x/0.8 עם טיפה קטנה של שמן טבילה בעדשה.
    הערה: מטרה זו שימשה כדי להתאים בצורה הטובה ביותר את המעבה NA, שהיה 0.55 (באופן אידיאלי,NA cond≥NA obj).

2. בקרות ראשוניות במיקרוסקופ

הערה: בצע את פקדי המיקרוסקופ הראשוניים פעם אחת, אלא אם כן ההתקנה תשתנה.

  1. תמונה עמילן תירס יבש דחוק בין שקופיות זכוכית עם פרמטרים SHG כדי ליצור תמונות SHG החושפות את כיוון קיטוב הלייזר. בצע את השלבים המדווחים בקובץ משלים 2, למעט עוצמת הלייזר, שהיא פחות מ-5% עבור עמילן תירס.
  2. צלם תמונה אחת של גרגרי עמילן תירס דלילים, וסמן את הכיוון של אונות SHG במישור x-y. כיוון זה מתאים לכיוון הלייזר (איור 2A).
  3. כבקרה, צלם תמונה נוספת של אותה דגימה, והכנס לנתיב האופטי לוח חצי גל (מיקום המוצג באיור 1A) כדי לשנות את כיוון התנודה של הלייזר. התמונה המתקבלת מציגה אונות אות SHG מסובבות (איור 2B, C).
  4. אם אתם משתמשים בסוג אחר של מסנן פסים עבור SHG, ודאו שיש לו תכונות שידור אופטימליות על-ידי השוואת התמונות (איור 2D, E) ועוצמות האות פיקסל אחר פיקסל לאורך סריקת קו (איור 2F).

3. מיצוי רקמות

הערה: השתמש תמיד בכלים נקיים לביצוע ההליכים הכירורגיים.

  1. השתמשו בחולדות טאייפ בנות 6-12 חודשים ובבקרות Sprague-Dawley (WT) תואמות גיל.
  2. הרדימו את בעלי החיים בהזרקת i.p. של תערובת קטמין-קסילזין (0.125 מ"ג/ק"ג ו-5 מ"ג/ק"ג) מדוללת בתמיסת NaCl סטרילית של 0.9%.
    1. בדוק את רפלקסי הכאב, ולהמשיך רק אם הם נעדרים.
  3. להקריב את החיה באמצעות עריפת ראשים.
  4. לאחר בידוד הראש, פתחו בזהירות את עצמות קמרון הגולגולת לאורך קו האמצע, החל מהנקודה הקאודלית ביותר בחלק העליון לכיוון האף, מחללי המסלול לכיוון קו האמצע, ולאחר מכן מהנקודה הקאודלית ביותר אל מתחת למוח ולמוח הקטן.
    הערה: חותכי עצם ורונג'ורס מאפשרים הסרה נכונה של עצמות הראש מבלי לפגוע במבני המוח.
  5. שחררו את המוח ואת המוח הקטן מהעצם. ניתן היה להפריד בין שתי ההמיספרות. אם חצאי הכדור מחולקים, השתמשו בחצי אחד להדמיית SHG, וקבעו את החצי השני ב-3.7% פרפורמלדהיד בתמיסת מלח עם פוספט (PBS) למשך 20 דקות בתוך מכסה מנוע כימי לחיתוך והכתמה הבאים.

4. חתך ויברטום

  1. הכינו מגש חיץ רטט מלא בתמיסת מלח מאוזנת חמה (37 מעלות צלזיוס) של האנק (HBSS).
  2. הצמידו את המוח לצלחת הדגימה באמצעות דבק ציאנואקרילט באמצעות פיסת סרט מיסוך. החלק/האזור הקאודלי ביותר יוצר קשר עם הדבק כך שניתן לחתוך את החלקים הקורונליים השמישים מהחלק ההפוך, הרוסטרלי.
    1. אפשר ~ 10 s עבור הדבק כדי להתפלמר כדי לקבל חיבור יעיל של הדגימה.
      הערה: התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר המוח מכוון כך שהלהב חותך "מלמעלה למטה" ולא "מצד לצד" (איור 1B).
  3. העבירו את לוחית הדגימה לתמיכה המגנטית שלה בתוך מגש החיץ.
  4. התחילו לחתוך חתכים של 300-500 מיקרומטר עד שהפרוסות המיוצרות יקיפו את כל פני השטח של המוח.
  5. בשלב זה, להקטין את עובי הקטע ל 160 מיקרומטר.
  6. לאחר שחתך שלם של 160 מיקרומטר נחתך ברמה של קורפוס קלוסום, שחזר אותו עם פיפטה פסטר מזכוכית מותאמת עם פתח גדול ובוער (איור 1C).
  7. העבירו אותו לצלחת פטרי נקייה עם HBSS חדש וחם או ישירות על תמיכת הזכוכית למיקרוסקופיה (כיסוי או צלחת תחתית זכוכית).
    הערה: עבור תנאי הניסוי המתוארים, הוספת כיסוי מעל הדגימה מזיקה להדמיה.

5. העברה למיקרוסקופ

  1. אם המיקרוסקופ נמצא בחדר אחר, הכינו קופסה מבודדת עם חבילות ג'ל מחוממות להעברת חלקי הרקמה תוך שמירה על הטמפרטורה. הקופסה משמשת גם כדי לשמור על חום החלקים עד שהם מצולמים.
  2. שים את הדגימה מתחת למיקרוסקופ, וודא שהיא ממוקמת כראוי מתחת למטרה על ידי תצפית ישירה דרך העיניים עם האור המועבר.
    הערה: המטרה היא ליישר את המבנים הפולטים החזויים עם כיוון התנודה של הלייזר כדי למקסם את אות ה- SHG הנפלט (ולכן זוהה).
  3. הסר את עודף HBSS כך שסרט נוזלי דק יכסה את כל הדגימה. בדוק חזותית את הסרט הנוזלי כל כמה דקות כדי למנוע אידוי יתר וייבוש של הדגימה.
    הערה: בתנאים המתוארים, נעשה שימוש בקטע למשך לא יותר מ-20 דקות. ייבוש הדגימה גורם להשפעות ארטיפקטיות דרסטיות (איור משלים 1A). במקום להוסיף עוד HBSS, מומלץ להשרות את החתך במדיום חם וטרי אם יש צורך בזמני הדמיה ארוכים יותר. השימוש בתאי זלוף ודבק או אגרוז נמס נמוך כדי לשתק את הרקמה מומלץ גם כאשר יש לבצע ניסויים ארוכים יותר.
  4. הכינו את שלב המיקרוסקופ להדמיה לא מיואשת, שעשויה לכלול סגירה של כל הדלתות של תא הדגירה הכהה או כיסוי תא הדגירה בבד מצופה פוליאוריתן ניילון שחור.

6. הדמיה

  1. בחר את מצב ההדמיה "non-descanned" לאורך נתיב השידור. בדרך זו, לכידת אות SH חלש של טובולין יהיה מותאם.
  2. בחר את המטרה LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.
  3. הגדר עוצמת לייזר בין 13 mW ל- 26 mW, עם זמן שהייה של פיקסל של 12.6 μs. צלם תמונות בגודל שאינו עולה על 512 פיקסלים x 512 פיקסלים, עם מהירות 5 וממוצע של 2, לזמן רכישה ממוצע של כ-15 שניות.
    הערה: שימוש בעוצמות לייזר גבוהות יותר ו/או זמני שהייה ארוכים יותר עלולים לגרום נזק לדגימה (איור משלים 1B).
  4. צלם תמונות תחילה באמצעות מסנן פס קצר של 485 ננומטר (SP485), ובשלב שני, הוסף מסנן פס פס חד של 405 ננומטר (BP405; איור 3). בצע את השלבים המדווחים בקובץ משלים 2.
    הערה: ניתן לצלם תמונות שדה פסאודו-בהירות דרך אותו גלאי באמצעות אור הלייזר השיורי של קו נראה לעין (לייזרים של 405 ננומטר או 488 ננומטר פועלים בצורה הטובה ביותר).

7. עיבוד המוח הקטן

  1. ראשית, לחתוך את המוח הקטן עם אזמל לשני חצאי כדור, ולאחר מכן להדביק אותם לתמיכה ויברטום על ידי החלק האמצעי (החלק השטוח המתקבל לאחר חיתוך).
  2. חתך ותמונה של המוח הקטן באותו אופן כפי שתואר עבור המוח (160 מיקרומטר מקטעים, אותן הגדרות ויברטום, אותו להב, אותן הגדרות מיקרוסקופ וכו ').
    הערה: בשל האנטומיה של המוח הקטן, האוריינטציה שלו ברגע החתך אינה קריטית; ברוב הפרוסות הנוצרות מפני השטח, תהיה פוליה חתוכה היטב לתוך החומר הלבן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לתמונות המתקבלות במתודולוגיה זו יש רמת רקע נמוכה מהותית בשל המספר המצומצם מאוד של הרמונופורים הקיימים ברקמות ביולוגיות, וזה אחד היתרונות המשמעותיים של השיטה.

כאשר מדמיינים את הסיבים של קורפוס קלוסום, מבנים קצרים דמויי סיבים ואלמנטים מעוגלים יכולים להימצא באופן עקבי במוח הטאייפ (איור 3B), בעוד שהקורפוס קלוסום של מוח הבקרה מראה אות הרבה יותר הטרוגני ואיזוטרופי בכל אזור המוח (איור 3A). מקורו של האות הדיפרנציאלי טמון באופן ספציפי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מיקרוסקופיית SHG היא חלק מקבוצה של טכניקות אופטיקה לא ליניאריות, הכוללות מיקרוסקופיית עירור של שני פוטונים, מיקרוסקופיה של הדור ההרמוני השלישי ומיקרוסקופיית פיזור קוהרנטית נגד סטוקס ראמאן, שתרמו להרחבת מגוון היישומים של מיקרוסקופיה אופטית קונבנציונלית למדעי החיים20.

באופן ספציפי, הכוח והחולשה העיקריים של מיקרוסקופיה SHG מתייחסים לאותו מצב: מחולל האותות אינו צנטרוסימטרי21. מצב אדריכלי ספציפי כזה נמצא לעתים קרובות בתחום הגבישים האנאורגניים והאורגני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) באמצעות המענקים הבאים: infraestructura 226450 ל- VP-CIO, infraestructura 255277 ל- V.P., ו- FORDECYT-PRONACES/194171/2020 ל- V.H. אנו מכירים בתמיכתו של יובנאל הרננדס גווארה במנמ"ר בהפקת הסרטונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
405/10 ננומטר BrightLine(R) מסנן פס פס יחיד סמרוקFF01-405/10-25קוטר 32 מ"מ, עם טבעת דיור
ניילון שחור, בד מצופה פוליאוריתןת'ורלאבסBK55' x 9' (1.5 מ' x 2.7 מ') x 0.005 אינץ' (0.12 מ"מ) עבה 
להבים לוויברטוםכל פרסומת; למשל חרב וילקינסון  סכיני גילוח קלאסיים מנירוסטה עם קצה כפול
כלי תרבית תאים, 35 מ"מכל פרסומת; למשל פלקון351008
מיקרוסקופ קונפוקליצייסLSM710NLO AxioObserver Z1מיקרוסקופ הפוך, המטרה המשמשת היא LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA 
קרירכל מסחריכל קופסת פוליסטירן מבודדת יכולה לעבוד, כדי לשמור על הדגימה בסביבות 37 מעלות; C
תירס סטאקלמשל Maizenaמהסופרמרקט
כיסויים #1.5כל מסחרימלבני
דבק ציאנואקרילטלמשל לוקטיטכדי להדביק את המוח למסקינטייפ
מלקחיים עדיניםכלים מדעיים עדינים11412-11לתפעל קטעי רקמה על ידי טיפול בקרום המוח
מספריים עדיניםכלים מדעיים עדינים14370-22כדי לחתוך את העור 
מספריים עדינים קצה מעוקלכלים מדעיים עדינים14061-09לחתוך לאורך קו האמצע
פורמלדהיד 37%סיגמא-אולדריץ'252549כדי לדלל 1:10 ב-PBS
פרידמן רונגרכלים מדעיים עדינים16000-14לחתוך את העצם
חבילות ג'לכל מסחרימחומם מראש ל -37 מעלות; C, כדי לסייע בשמירה על הטמפרטורה בתוך הצידנית
פיפטת פסטר מזכוכית, שונהכל מסחריכדי להעביר את קטע הרקמה
הנקס ופריים; תמיסת מלח מאוזנת (HBSS)ג'יבקו14025-076ניתן להכין מאבקות
המוסטטים של קליכלים מדעיים עדינים13018-14כדי להפריד את העצם 
סרט מיסוךכל מסחריכדי להגן על פני השטח של לוחית הדגימה
מודול NDD, סוג Cצייס000000-1410-101כדי לזהות את האות, להפחית את אובדן האור. בית סט המסננים 000000-1935-163 עם SP485
ציפורני עצם אופסטכלים מדעיים עדינים16101-10לחתוך את העצם
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)ג'יבקו10010-031ניתן להכין מאבקות או לשוניות
לייזר פועםקוהרנטיזיקית ויז'ן II680– לייזר מתכוונן 1080 ננומטר
אזמלכל מסחרילהב ישר עם חוד חד
מלקחיים בתבנית סטנדרטיתכלים מדעיים עדינים11000-18
מספריים אביביים של Vannasכלים מדעיים עדינים15018-10לחתוך קרומי מוח שנשארים מחוברים הן לפרוסה המתקבלת מחיתוך ויברטום והן לחלק המודבק לצלחת הדגימה.
ויברטוםכל פרסומת; למשל LeicaVT1200

מקורות

  1. Palmiter, R. D., et al. Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene. Cell. 50 (3), 435-443 (1987).
  2. Banerjee, A., et al. A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin. The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).
  3. Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain. The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).
  4. Banerjee, A., et al. Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).
  5. Cross, A. R., Williams, R. C. Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde. Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).
  6. Van Steenbergen, V., et al. Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules. Nature Communications. 10 (1), 3530(2019).
  7. Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy of living cells. Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277(2001).
  8. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
  9. Yu, C. -H., et al. Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation. Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).
  10. Bancelin, S., et al. Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy. Scientific Reports. 7, 6758(2017).
  11. Dombeck, D. A., et al. Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).
  12. Psilodimitrakopoulos, S., et al. Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons. Optics Express. 17 (16), 14418(2009).
  13. Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292(2018).
  14. Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy. Scientific Reports. 12, 14417(2022).
  15. Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect. Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).
  16. Duncan, I. D., et al. A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation. Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).
  17. Garduno-Robles, A., et al. MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy. Frontiers in Neuroscience. 14, 555(2020).
  18. Lopez-Juarez, A., et al. Auditory impairment in H-ABC tubulinopathy. Journal of Comparative Neurology. 529 (5), 957-968 (2021).
  19. Alata, M., et al. Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model. Frontiers in Neurology. 12, 702039(2021).
  20. Parodi, V., et al. Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363(2020).
  21. Lefort, C. A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001(2017).
  22. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  23. vander Knaap, M. S., et al. New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum. American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466(2002).
  24. Stoller, P., Kim, B. -M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon. Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205(2002).
  25. Brown, E. B., et al. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).
  26. Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease. Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים