מאמר שיטה

גישה חוץ גופית לחקר תפקוד לקוי של המיטוכונדריה: מודל Cybrid

DOI:

10.3791/63452

⸱

9 במרץ 2022

 ,  ,  , 
1Unit of Medical Genetics and Neurogenetics, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ציברידים טרנסברוכונדריאליים הם תאים היברידיים המתקבלים על ידי התמזגות של תאים מיטוכונדריאליים מיטוכונדריאליים (mtDNA) מדולדלים (תאי rho0 ) עם ציטופלסטים (תאים מלוכדים) שמקורם בחולים הסובלים מהפרעות מיטוכונדריאליות. הם מאפשרים לקבוע את המקור הגרעיני או המיטוכונדריאלי של המחלה, הערכה של פעילות ביוכימית, ואישור של התפקיד הפתוגנטי של גרסאות הקשורות ל- mtDNA.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחסור בקומפלקסים של שרשרת הנשימה המיטוכונדרית המבצעים זרחון חמצוני (OXPHOS) הוא הסמן הביוכימי של הפרעות מיטוכונדריאליות אנושיות. מנקודת מבט גנטית, ה-OXPHOS מהווה דוגמה ייחודית משום שהוא נובע מהשלמה של שתי מערכות גנטיות נפרדות: דנ"א גרעיני (nDNA) ודנ"א מיטוכונדריאלי (mtDNA). לכן, פגמים ב-OXPHOS יכולים לנבוע ממוטציות המשפיעות על גנים מקודדים גרעיניים ומיטוכונדריאליים.

עבודתם פורצת הדרך של קינג ואטארדי, שפורסמה ב-1989, הראתה כי קווי תאים אנושיים שהתרוקנו מ-mtDNA (הנקראים rho0) יכולים להיות מאוכלסים מחדש על ידי מיטוכונדריה אקסוגנית כדי להשיג את מה שמכונה "ציברידים טרנסטרוכונדריאליים". הודות לציברידים אלה המכילים מיטוכונדריה שמקורם בחולים עם הפרעות מיטוכונדריאליות (MDs) וגרעינים מתאי rho0 , ניתן לוודא אם פגם קשור ל-mtDNA או ל-nDNA. cybrids אלה הם גם כלי רב עוצמה כדי לאמת את הפתוגניות של מוטציה ולחקור את השפעתה ברמה ביוכימית. מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט המתאר יצירת cybrid, בחירה ואפיון.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרעות מיטוכונדריאליות (MDs) הן קבוצה של תסמונות רב-מערכתיות הנגרמות על ידי פגיעה בתפקודים המיטוכונדריאליים עקב מוטציות בדנ"א גרעיני (nDNA) או במיטוכונדריאלי (mtDNA)1. הם בין המחלות המטבוליות התורשתיות הנפוצות ביותר, עם שכיחות של 1:5,000. מחלות הקשורות ל- mtDNA עוקבות אחר הכללים של גנטיקה מיטוכונדריאלית: תורשה אימהית, הטרופלזמה ואפקט סף, והפרדה מיטוטית2. mtDNA אנושי הוא מעגל דנ"א דו-גדילי של 16.6 קילובייט, המכיל אזור בקרה קצר עם רצפים הדרושים לשכפול ושעתוק, 13 גנים המקודדים חלבונים (כולם תת-יחידות של שרשרת הנשימה), 22 tRNA ו-2 גנים rRNA3.

אצל אנשים בריאים, יש גנוטיפ mtDNA אחד ויחיד (homoplasmy), בעוד שיותר מגנוטיפ אחד מתקיים בדו-קיום (הטרופלזמה) בתנאים פתולוגיים. מוטציות הטרופלסמיות מזיקות חייבות להתגבר על סף קריטי כדי לשבש OXPHOS ולגרום למחלות שיכולות להשפיע על כל איבר בכל איבר בכל גיל4. הגנטיקה הכפולה של OXPHOS מכתיבה תורשה: אוטוזומלית רצסיבית או דומיננטית ומקושרת X למוטציות nDNA, אימהית למוטציות mtDNA, בתוספת מקרים ספורדיים הן עבור nDNA והן עבור mtDNA.

בתחילת עידן הרפואה המיטוכונדרית, ניסוי פורץ דרך של קינג ואטארדי5 ביסס את הבסיס להבנת מקורה של מוטציה האחראית על MD על ידי יצירת תאים היברידיים המכילים גרעינים מקווי תאים סרטניים שבהם mtDNA התרוקן לחלוטין (תאי rho0) ומיטוכונדריה מחולים עם MDs. טכניקות ריצוף מהדור הבא (NGS) לא היו זמינות באותה תקופה, ולא היה קל לקבוע אם מוטציה קיימת בגנום הגרעיני או המיטוכונדריאלי. השיטה, שתוארה בשנת 1989, שימשה אז כמה חוקרים שעבדו בתחום הרפואה המיטוכונדרית 6,7,8,9; פרוטוקול מפורט פורסם לאחרונה10, אך עדיין לא נעשה סרטון. מדוע פרוטוקול כזה צריך להיות רלוונטי בימינו כאשר NGS יכול לזהות במדויק ובמהירות היכן נמצאת מוטציה? התשובה היא שדור cybrid הוא עדיין הפרוטוקול החדיש ביותר כדי להבין את התפקיד הפתוגני של כל מוטציה mtDNA חדשה, לתאם את אחוז ההטרופלזמה עם חומרת המחלה, ולבצע חקירה ביוכימית במערכת גרעינית הומוגנית שבה התרומה של הרקע הגרעיני האוטוכטוני של המטופל נעדרת11, 12,13.

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג ציטופלסטים מפיברובלסטים קונפלואנטיים שמקורם בחולים הגדלים בצלחות פטרי 35 מ"מ. צנטריפוגה של הכלים בנוכחות ציטוכלאסין B מאפשרת בידוד של ציטופלסטים משועבדים, אשר לאחר מכן מתמזגים עם תאי rho0 בנוכחות פוליאתילן גליקול (PEG). לאחר מכן מטפחים את הציברידים המתקבלים בתווך סלקטיבי עד שנוצרים שיבוטים. סעיף התוצאות הייצוגיות מציג דוגמה לאפיון מולקולרי של הציברידים המתקבלים כדי להוכיח כי ה-mtDNA זהה לזה של הפיברובלסטים של המטופלים התורמים וכי ה-nDNA זהה לדנ"א הגרעיני של קו תאי ה-rho0 הגידולי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: השימוש בפיברובלסטים אנושיים עשוי לדרוש אישור אתי. פיברובלסטים ששימשו במחקר זה נגזרו מחולי MD ואוחסנו בבנק הביולוגי המוסדי בהתאם לדרישות האתיות. ניתנה הסכמה מדעת לשימוש בתאים. בצע את כל ההליכים של תרבית תאים תחת ארון זרימה למינרי סטרילי בטמפרטורת החדר (RT, 22-25 °C (22-25 °C).22°C). השתמשו בתמיסות מסוננות סטריליות המתאימות לתרביות תאים ולציוד סטרילי. לגדל את כל קווי התאים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. בדיקות Mycoplasma צריכות להתבצע מדי שבוע כדי להבטיח תרבויות ללא מיקופלסמה. ניתן ליצור תאים 143BTK- rho0 כפי שתואר קודם לכן5.

1. תרבית תאים

  1. לפני תחילת כל הליך, ודא את נוכחות המוטציה בפיברובלסטים שמקורם בחולי MD וכמת את אחוז ההטרופלזמה או ההומופלזמה על ידי פולימורפיזם באורך שבר הגבלה (RFLP) ו/או ניתוחי ריצוף mtDNA שלמים14.
  2. פיברובלסטים של זרעים בארבע צלחות פטרי 35 מ"מ, שכל אחת מהן מכילה 2 מ"ל של מדיום תרבית מלאה (טבלה 1). תנו לתאים לגדול עד 80% מפגש (48 שעות).
  3. לגדל 143BTK- rho0 תאים ב 8 מ"ל של תוספת תרבית בינונית (טבלה 1) בצלחת פטרי 100 מ"מ.
  4. שמור על התאים באינקובטור ב 37 °C עם 5% CO2.
  5. בדוק את היעדר mtDNA בתאי rho0 על ידי ריצוף טכניקות14.

2. הטמעה של פיברובלסטים

  1. לעקר ארבעה בקבוקים מתאימים לצנטריפוגה של 250 מ"ל על ידי עיקור אוטוקלאב ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות מחזור. מייבשים אותם בתנור מעבדה או ב-RT.
  2. מחממים מראש את הצנטריפוגה ב-37 מעלות צלזיוס.
  3. שטפו פעמיים את הכלים בקוטר 35 מ"מ המכילים את הפיברובלסטים, תוך שימוש ב-2 מ"ל של 1x מלח עם מאגר פוספט (PBS) ללא (w/o) סידן ומגנזיום.
  4. מנקים את המשטח החיצוני של הכלים עם 70% אתנול ומחכים עד שהאלכוהול יתאדה.
  5. מוציאים את המכסים מהכלים ואת פקקי הברגים מהבקבוקים. מניחים כל מנה, ללא המכסה, הפוכה בתחתית כל בקבוק צנטריפוגה של 250 מ"ל.
  6. לאט לאט מוסיפים 32 מ"ל של Enucleation Medium לכל בקבוק (טבלה 1), ומאפשרים למדיום להיכנס לתבשיל ולבוא במגע עם התאים. מוציאים את כל הבועות מהכלים באמצעות ארוכה פסטר פיפטה, ומעוגלים את הקצה בלהבת בונזן.
    הערה: חשוב להסיר את הבועות כדי לאפשר למדיום להיכנס לצלחת ולבוא במגע עם התאים.
  7. סגור כל בקבוק עם פקק הבורג והעביר אותם לצנטריפוגה.
  8. צנטריפוגה למשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-8,000 × גרם, האצה מקסימלית, האטה איטית. שימו לב כדי לאזן את הצנטריפוגה: משקל נגד כל בקבוק. במידת הצורך, התאם את המשקל על ידי הוספת נפח מתאים של Enucleation Medium.
  9. במהלך צנטריפוגה, השתמשו בריק או פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל כדי לשאוף ולהשליך את המדיום מצלחות התרבית 143BTK- rho0 ולשטוף אותן פעמיים באמצעות 4 מ"ל של 1x PBS עם סידן ומגנזיום.
  10. הוסף 2 מ"ל של טריפסין כדי לכסות את מונולאי התא לחלוטין.
  11. מניחים את הכלים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-2 דקות.
  12. מוציאים את הכלים מהחממה, צופים בניתוק תאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך עבור תאים חיים (מטרות פי 4 או 10x), ומעכבים את פעילות האנזים על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום תרבית משלים.
  13. לשאוף את 4 מ"ל של תרחיף התא בצלחת עם פיפטה 10 מ"ל ולהעביר אותו לצינור חרוטי 15 מ"ל.
  14. ספרו את התאים באמצעות תא המוציטומטר של Burker או מונה אוטומטי.
  15. בסוף הצנטריפוגה (שלב 2.8), שאפו את המדיום מהבקבוקים והשליכו אותו.
  16. מוציאים את הכלים על ידי היפוך הבקבוקים על גזה סטרילית שרוססה בעבר ב-70% אתנול. נקו את המשטח החיצוני של הכלים והמכסים שלהם עם 70% אתנול. המתן עד שהאלכוהול יתאדה, ואז סגור את הכלים.
  17. לפני שתמשיך, בדוק את היווצרות הציטופלסט (רוח רפאים) באמצעות מיקרוסקופ הפוך עבור תאים חיים (מטרה 4x או 10x). חפשו פיברובלסטים מוארכים במיוחד עקב שחול הגרעינים שלהם המושרה על ידי ציטוכלאסין B.
  18. לכל מנה של 35 מ"מ, הוסיפו 1 × 106 מתוך 143BTK- rho0 תאים שעברו החייאה ב-2 מ"ל של 143BTK- rho0 תרבית בינונית בתוספת 5% סרום בקר עוברי (FBS).
  19. השאירו את הכלים למשך 3 שעות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ותנו לתאי 143BTK-rho0 להתיישב על רוחות הרפאים. אל תפריעו לכלים.

3. היתוך של הפיברובלסטים המוטבעים עם תאי rho 0

  1. לאחר 3 שעות של דגירה, לשאוף ולהשליך את המדיום מן הכלים.
  2. שטפו את התאים הדבקים פעמיים עם 2 מ"ל של מדיום הנשר המהונדס (DMEM) של Dulbecco עם גלוקוז גבוה בסרום או עם מדיום חיוני מינימלי (MEM).
  3. לשאוף ולהשליך את המדיום.
  4. הוסף 500 μL של תמיסת PEG (ראה טבלת החומרים) לתאים ודגירה למשך דקה אחת בדיוק.
  5. שאפו והשליכו את פתרון ה-PEG.
  6. שטפו את התאים שלוש פעמים באמצעות 2 מ"ל של DMEM גלוקוז גבוה בסרום או עם MEM.
  7. הוסף 2 מ"ל של Fusion Medium (טבלה 1) ודגירה לילה באינקובטור ב 37 °C עם 5% CO2.

4. בחירה והרחבה של Cybrid

  1. לאחר הדגירה בלילה, מוציאים את הצלחות מהאינקובטור, מנסים את התאים כמתואר לעיל (שלבים 2.9-2.13), ומעבירים את התוכן של כל מנה של 35 מ"מ למנה של 100 מ"מ למנה של 100 מ"מ.
  2. הוסף 8 מ"ל של בחירה בינונית (טבלה 1) והנח את הצלחות באינקובטור ב- 37 °C עם 5% CO2.
  3. שנה את המדיום כל 2-3 ימים.
  4. המתן כ-10-15 ימי סלקציה עד שיופיעו מושבות של תאים.
  5. הקפיאו את אחת מארבע צלחות הפטרי על ידי איסוף כל השיבוטים ויצירת תרבות "מסיבית" כגיבוי לסיברידים, שבסופו של דבר ניתן יהיה לשחזרם ולהשתמש בהם לחקירות נוספות.
  6. נסו את התאים בשאר מנות התרבית, ספרו וזרעו לתוך צלחת פטרי אחת או יותר ב-50-100 תאים/צלחת במדיום התרבית המשלים (טבלה 1) עד להופעת שיבוטים. תנו להם לגדול במשך כמה ימים.
  7. גלול את התאים הנותרים על ידי צנטריפוגה ב-1,200 × גרם למשך 3 דקות ב-RT והשליך את הסופרנאטנט.
  8. חילוץ דנ"א מהכדור (ראו טבלת החומרים).
  9. בצע גנוטיפ לפי מספר משתנה של ניתוח טנדם חוזר (VNTR) כפי שדווח בעבר15.
  10. קחו שיבוטים מצלחת פטרי עם גלילי שיבוט או קצה פיפטה, תוך שימוש בסטריאומיקרוסקופ כדי למנוע איגום של שיבוטים שונים, והעבירו אותם לצלחת של 96 בארות, שכל באר מכילה 200 מיקרול"ל של מדיום תרבית משלים (טבלה 1).
  11. הרחיבו כל שיבוט עד שיהיו מספיק תאים להקפאה ולמיצוי של דנ"א.
  12. אמת את אחוז המוטציה של כל שיבוט על ידי RFLP או שיטות ריצוף אחרות. באופן אידיאלי, נסו להשיג גם שיבוטים עם mtDNA מסוג פראי (0% מוטציה) וגם שיבוטים עם אחוזי מוטציה שונים, שניהם מסתכמים ב-mtDNA של מוטציה הומופלסמית (100% מוטציה). ראו איור 1 עבור דיאגרמה סכמטית של פרוטוקול יצירת cybrid.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יצירת cybrids דורשת 3 ימים של עבודת מעבדה בתוספת תקופת בחירה (~ 2 שבועות) ועוד 1-2 שבועות לצמיחת שיבוטים. השלבים הקריטיים הם איכות הציטופלסטים ותקופת הבחירה. המורפולוגיה של cybrids דומה לזו של התאים התורמים rho0. הקצאה של mtDNA ו- nDNA הנכונים ב- cybrids היא חובה כדי לאשר את זהות התאים. דוגמה לכך ניתנת באיור 2. במקרה זה, יצרנו ציברידים החל מפיברובלסטים שמקורם בחולה הנושא את ההטרופלסמי m.3243A>G, אחת המוטציות הנפוצות ביותר ב-mtDNA הקשורות למיופתיה מיטוכונדריאלית, אנצפלופתיה, חומ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ל-mtDNA יש שיעור מוטציות גבוה מאוד בהשוואה ל-nDNA בגלל היעדר היסטונים מגנים ומיקומה קרוב לשרשרת הנשימה, מה שחושף את המולקולה להשפעות חמצון מזיקות שאינן מנוגדות ביעילות על ידי מערכות התיקון16. המוטציות הפתוגניות הראשונות של mtDNA זוהו בשנת 198817,18, ומאז תוארו מספר רב של מוטציות. טכנולוגיית NGS היא גישה רלוונטית לסינון כל הגנום המיטוכונדריאלי ולזיהוי קל שלגרסאות 14. עם זאת, הערכת התפקיד הפתוגני של מוטציית mtDNA שמעו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה בוצע במרכז לחקר מחלות ילדים מיטוכונדריאליות (http://www.mitopedia.org), במימון קרן מריאני. VT הוא חבר ברשת הייחוס האירופית למחלות נוירומוסקולריות נדירות (ERN EURO-NMD).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5-Bromo-2'-DeoxyuridineSigma-Aldrich (Merck)B5002-500MG
6 באר צלחותקורנינג3516
96 באר צלחותקורנינג3596
ערכת מיצוי DNA תרבית דם ותאיםQIAGEN13323
צנטריפוגהבקמן קולטרAvanti J-257,200 rcf, 37 °
בקבוקי צנטריפוגה C, 250 מ"לבקמן קולטר356011
ציטוכלזין B מ- Drechslera dematioideaSigma-Aldrich (Merck)C2743-200UL
דיאליזה FBSGibco26400-036 100 מ"ל
DMEM גלוקוז גבוה (ללא L-גלוטמין עם נתרן פירובט)EuroCloneECB7501L
תמיסת מלח פוספט חוצץ של Dulbecco - PBS (עם / o סידן ללא מגנזיום)EuroCloneECB4004L
אתנול נטול מים מוחלטCarlo Erba414601
FetalClone III (מוצר סרום בקר)Cytiva - HyClone LaboratoriesSH30109.03
פיפטות פסטור זכוכיתVWRM4150NO250SP4
מיקרוסקופ מחקר הפוך למיקרוסקופ תאים חייםNikonECLIPSE TE200
JA-14 רוטור אלומיניום בזווית קבועהבקמן קולטר339247
מעבדה חיטוי אדים 770Labotech29960014
L-גלוטמין 200 מ"מ (100x)EuroCloneECB 3000D
מינימום חיוני בינוני MEMEurocloneECB2071L
MycoAlert MycoAlert ערכת זיהוי מיקופלזמהLonzaLT07-318
PEG (תמיסת פוליאתילן גליקול)סיגמא-אולדריץ' (Merck)P7181-5X5ML
פניצילין-סטרפטומיצין (תמיסה 100x)EuroCloneECB3001D
Primo TC כלים 100 מ"מEuroCloneET2100
Primo TC כלים 35 מ"מEuroCloneET2035
נתרן פירובט 100 מ"מEuroCloneECM0542D
סטריאומיקרוסקופNikonSMZ1000
טריפסין 2.5% ב-HBSSEuroCloneECB3051D
UridineSigma-Aldrich (Merck)U3003-5G

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).
  2. DiMauro, S., Davidzon, G. Mitochondrial DNA and disease. Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).
  3. El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. Mitochondrial DNA maintenance defects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).
  4. Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
  5. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  6. Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T-->G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
  7. Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
  8. Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
  9. Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95(2006).
  10. Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 - Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
  11. Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
  12. Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749(2021).
  13. Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364(2021).
  14. Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
  15. Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
  16. Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061(2020).
  17. Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
  18. Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
  19. Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
  20. Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214(2018).
  21. Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
  22. Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
  23. Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
  24. Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591(2020).
  25. Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
  26. Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
  27. Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
  28. Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNA

מאמרים קשורים