הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור קריו-קונסרבציה של הציאנובקטריום הנימה פורמידיום לקונה

2.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63470

⸱

1 בפברואר 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

במאמר זה

סיכום

פורמידיום לקונה (שם מדעי: Phormidium lacuna ) הוא ציאנובקטריום נימה שבודד מסלעים ימיים. מאמר זה מתאר את הבידוד של חוטים ממקורות טבעיים, מיצוי DNA, ריצוף גנום, טרנספורמציה טבעית, ביטוי של sfGFP, קריוקונסרבציה ושיטות תנועתיות.

תקציר

ציאנובקטריה הם המוקד של מחקר בסיסי ופרויקטים ביוטכנולוגיים שבהם אנרגיה סולארית מנוצלת לייצור ביומסה. פורמידיום לקונה (שם מדעי: Phormidium lacuna ) הוא ציאנובקטריום נימה שבודד לאחרונה. מאמר זה מתאר כיצד ניתן לבודד ציאנובקטריה נימה חדשה מבורות סלעים ימיים. הוא גם מתאר כיצד ניתן לחלץ דנ"א מחוטים וכיצד ניתן לרצף את הגנומים. אף על פי שהטרנספורמציה נוצרת עבור מינים חד-תאיים רבים, היא מדווחת בתדירות נמוכה יותר על ציאנובקטריה נימה. שיטה פשוטה לטרנספורמציה הטבעית של P. lacuna מתוארת כאן. P. lacuna הוא החבר היחיד במסדר מתנדים שעבורו נוצרת טרנספורמציה טבעית. מאמר זה גם מראה כיצד טרנספורמציה טבעית משמשת לביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק בעל קיפול יתר (sfGFP). מקדם cpcB אנדוגני גרם לביטוי חזק בערך פי 5 מאשר מקדמי cpc560, A2813 או psbA2 מ- Synechocystis sp. PCC6803. יתר על כן, הוקמה שיטה לשמירת ההקפאה של P. lacuna ו - Synechocystis sp.CPP 6803, ותוארו שיטות להערכת תנועתיות בתווך נוזלי ועל משטחי אגר ופלסטיק.

מבוא

ציאנובקטריה הם אורגניזמים פרוקריוטים המשתמשים בפוטוסינתזה כמקור אנרגיה 1,2. המחקר מתמקד יותר ויותר במינים ציאנובקטריאליים. ניתן לשנות מספר ציאנובקטריה באמצעות DNA3. גנים יכולים להיות מופלים או ביטוי יתר במינים אלה. עם זאת, השינוי מוגבל למינים בודדים 4,5,6,7,8,9,10,11, וזה יכול להיות קשה לבסס טרנספורמציה בזנים מאוספי תרבויות או 8 בטבע. זנים של המין הנימה Phormidium lacuna (איור 1) בודדו מבורות סלעים ימיים, שבהם התנאים הסביבתיים, כגון ריכוזי מלחים או טמפרטורה, משתנים עם הזמן. ציאנובקטריה נימה זו יכולה לשמש כאורגניזמים לדוגמה לסדר Oscillatoriales12 שאליו הם שייכים.

במהלך ניסויים שבדקו העברת גנים על ידי אלקטרופורציה13,14 נמצא כי P. lacuna יכול להשתנות על ידי טרנספורמציה טבעית15. בתהליך זה, הדנ"א נקלט באופן טבעי על ידי תאים מסוימים. בהשוואה לשיטות אחרות של טרנספורמציה16,17, לטרנספורמציה טבעית יש יתרון בכך שאינה דורשת כלים נוספים שעלולים לסבך את ההליך. לדוגמה, אלקטרופורציה דורשת cuvettes תקין, חוטים שלמים, ובחירת המתח הנכון. P. lacuna הוא כיום חבר המתנדים היחיד הרגיש לטרנספורמציה טבעית. מכיוון שהפרוטוקול המקורי מבוסס על פרוטוקולי אלקטרופורציה, הוא עדיין כלל מספר שלבי כביסה שעשויים להיות מיותרים. גישות שונות נבדקו כדי לפשט את הפרוטוקול, מה שהוביל לפרוטוקול הטרנספורמציה שהוצג כאן.

רצף הגנום חיוני למחקרים מולקולריים נוספים המבוססים על נוקאאוט גנים או ביטוי יתר. למרות שניתן להשיג רצפי גנום עם מכונות ריצוף מהדור הבא תוך תקופות קצרות, מיצוי הדנ"א יכול להיות קשה ותלוי במין. עם P. lacuna נבדקו מספר פרוטוקולים. לאחר מכן הוקמה שיטה שונה המבוססת על צטיל טרימתיל אמוניום ברומיד (CTAB), וכתוצאה מכך נוצרה טוהר מקובל של דנ"א ותפוקות DNA של כל מחזור טיהור להמשך העבודה במעבדה. ניתן לרצף את הגנום של חמישה זנים באמצעות פרוטוקול זה. שלב הטרנספורמציה ההגיונית הבא היה לבסס ביטוי חלבונים ב-P. lacuna.

ניתן לזהות את ה-sfGFP המשמש כחלבון סמן בפרוטוקול זה באמצעות כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כל היזמים שנבדקו יכלו לשמש לביטוי P. lacuna sfGFP. המספר ההולך וגדל של זנים הנובעים מטרנספורמציה הביא לצורך בשיטה לאחסון התרבויות. שיטות כאלה הוקמו עבור Escherichia coli וחיידקים רבים אחרים18. בפרוטוקולים סטנדרטיים, תרביות גליצרול מוכנות, מועברות בחנקן נוזלי ומאוחסנות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. שיטה זו דורשת רק כמה צעדים והיא אמינה מאוד עבור אותם מינים שעבורם היא הוקמה. הפרוטוקול הסטנדרטי לא היה אפשרי עבור P. lacuna מכיוון שלא ניתן היה לשחזר תאים חיים בכל המקרים. עם זאת, כאשר הגליצרול הוסר לאחר ההפשרה, תאים של כל הניסויים שרדו. שיטות פשוטות מוצגות לניתוח תנועתיות של P. lacuna, אשר ניתן לשלב עם מוטגנזה נוקאאוט כדי לחקור סוג IV pili או את התפקיד של photoreceptors. מבחנים אלה שונים מאלו של ציאנובקטריה חד-תאית 19,20,21 ויכולים להיות שימושיים גם עבור תנודות אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. בידוד מהסביבה הטבעית

הערה: ניתן לבודד אצות ירוקות, דיאטומים, ציאנובקטריה נימה ומיקרו-אצות אחרות. הפרוטוקול יכול לשמש עבור כל מיני מיקרו-אלגה מבורות סלעים הגדלים בתנאי מעבדה. ציאנובקטריה נימה השייכת לתנודות ניתן לזהות בקלות על ידי תנועתם וצורתם החוטית. ניתן לזהות את המין במצב חצי-פורה על ידי ריצוף גנום או ריצוף 16S rRNA.

  1. העברת דגימות מי ים נוזליים מבורות סלע ימיים (כלומר, חללים בחוף הסלעי) לצלוחיות של 50 מ"ל. עבור כל בקבוקון, שים לב למיקום המדויק או לקואורדינטות של המקור הטבעי. במידת האפשר, סנן את התוכן דרך רשתות של 50 מיקרומטר כדי להפחית את כמויות הזואופלנקטון. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה לאחסן אותן בתת-תרבות.
  2. מעבירים תרביות של 1 מ"ל ל-10 ס"מ צלחות פטרי המכילות 3% בקט-אגר ב-f/2 בינוני 22,23 (ראו טבלת החומרים). הכן עד 20 צלחות. מטפחים תחת אור לבן של 50 מיקרומול m-2 s-1.
    הערה: ניתן להשתמש בעוצמות אור גבוהות יותר לטיפוח. עוצמה של עד 400 מיקרומול m-2 s-1 יכולה לשמש עבור P. lacuna, אם כי מינים אחרים עשויים להיות רגישים יותר לאור.
  3. לאחר שבוע, מעבירים את התאים הרצויים לצלחות אגר טריות באמצעות מלקחיים סטריליים. לבודד את התאים תחת מיקרוסקופ דו-עיני בתנאים סטריליים. אחסנו את צלחת האגר הישנה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שהתאים יופיעו ויגדלו על צלחת האגר החדשה.
  4. חזור על שלב העברה זה מדי שבוע כדי למנוע זיהום. השתמש בעין בלתי לאיתור זיהום כבד ובמיקרוסקופ עם הגדלה של פי 400 לבדיקות נוספות לזיהום.
  5. אם דגימה נראית נקייה מזיהום, בדוק זיהום חיידקי או פטרייתי על צלחות אגר. מעבירים שבריר מהתרבית עם לולאת חיסון ללוח אגר LB24 (קוטר 10 ס"מ), שומרים על הצלחת בטמפרטורת החדר, ובודקים את צמיחת המזהמים במשך 1-3 ימים.
  6. אם מתקבל מין ציאנובקטריאלי נימה סטרילי, השתמש בו לעבודת תרבית נוספת. טפחו P. lacuna בנוזל או על צלחות בקטו-אגר. השתמש בצלוחיות של 250 מ"ל עם 50 מ"ל של f/2 בינוני או f/2+ בינוני לתרבית נוזלית.

2. מיצוי DNA

הערה: שיטה זו מאומצת מ - 25 26

  1. הכן שני צלוחיות עם 50 מ"ל של f /2 בינוני. חסן כל אחד עם ~ 1 מ"ל של חוטי P. lacuna מתרבויות צומחות אחרות. שמור את התרביות במשך 7 ימים או יותר תחת תסיסה (סיבוב אופקי) ב 50 סל"ד תחת אור לבן (50 μmol m-2 s-1) ב 25 °C (74 °F).
  2. טפלו בתרבית באמצעות אולטרסאונד (ראו את טבלת החומרים) למשך 2 דקות באנרגיה מלאה. מדוד OD ב- 750 ננומטר; בדוק כדי לוודא שזה ~ 0.5. המשך להגדיל את התרבויות אם ה- OD נמוך מדי.
  3. לאסוף את החוטים על ידי 5,000 × גרם, 20 דקות צנטריפוגה. הסר את ה-supernatant. העבר את החוטים עם שאריות נוזלים לחדר של מכבש צרפתי27. הגדר את הלחץ של העיתונות הצרפתית ל-20,000 psi וחלץ את התאים.
    הערה: העיתונות הצרפתית תשקר את כל התאים ותשחרר את הדנ"א; כוחות גזירה חזקים ייצרו 1,500 שברי דנ"א של bp.
  4. צנטריפוגה הדגימה במשך 10 דקות ב 10,000 × g ולהסיר את supernatant.
  5. הוסיפו לכדור 400 μL של מאגר ליזיס (4 M אוריאה, 0.1 M Tris/Cl, pH 7.4) ו-50 μL של פרוטאינאז K (10 מ"ג/מ"ל). מחממים את הדגימה ל-55 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות עם רעידות ב-550 סל"ד.
  6. הוסף 1 מ"ל של מאגר מיצוי DNA (3% CTAB, 1.4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0.1 M Tris/Cl, 1% Sarkosyl, 0.1 M DTT, pH 8) ודגירה במשך 60 דקות ב 55 °C ו 550 סל"ד. העבר את הפתרונות לצינורות צנטריפוגה, והוסף שני נפחים של כלורופורם/איזואמילקוהול (24/1).
  7. לאחר הרעידות, צנטריפוגה הדגימה במשך 5 דקות ב 9,000 × גרם. מעבירים את השלב העליון והמימי לבקבוקוני התגובה ומוסיפים 1 מ"ל של אתנול קר כקרח ו-50 μL של 3 M נתרן אצטט.
  8. סובבו את הדגימה והניחו אותה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת או יותר.
  9. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 10,000 × גרם (4 ° C) ולהשליך את supernatant. לשטוף את הכדור עם 70% אתנול.
  10. צנטריפוגה שוב את המדגם. מוציאים את הסופרנטנט ומייבשים את הכדור למשך הלילה. ממיסים את הדנ"א במים נטולי נוקלאזות. מדוד את ספקטרום הדנ"א כדי לבדוק אם OD 260 ננומטר/OD 280 ננומטר הוא בין 1.6 ל-1.9.
  11. לנתח את גודל הדנ"א על ג'ל אלקטרופורזה אגרוז28.
  12. רוצחו את הדנ"א הגנומי לפי ריצוף הדור הבא במשך 300 מחזורים, עם הגדרת קצה מזווגת ואורך קריאה של 150 בסיסים (ראו טבלאות חומרים).
  13. בצע את ההרכבה עם תוכנית המחשב המתאימה; ראה את הדוגמה שניתנה בטבלת החומרים.
  14. שלח את טיוטת הגנום לשרת RAST לביאור.
    הערה: העלה רצפי דנ"א כדי לקבל ביאור מלא תוך מספר דקות.

3. טרנספורמציה טבעית וביטוי GFP

הערה: הטרנספורמציה מבוססת על וקטור פלסמיד המופץ ב- E. coli; pGEM-T או pUC19 עשויים לשמש כווקטורים של עמוד שדרה. טכניקות שיבוט מבוססות במעבדות רבות; ראה גם פרוטוקולים סטנדרטיים28 והמאמרים על וקטורי טרנספורמציה עבור P. lacuna15,29. דוגמאות לווקטורים לביטוי sfGFP מתוארות בסעיף התוצאות הייצוגיות. פרטים על ארבעה וקטורים שטרם פורסמו מופיעים בקובץ משלים 1.

  1. בצע את כל השלבים באמצעות חומר סטרילי בתנאי מעבדה סטריליים (ספסל נקי, כלי זכוכית סטריליים).
  2. חסן 2 x 50 מ"ל של f/2 תווך נוזלי בשני צלוחיות 250 מ"ל עם 2 x 1 מ"ל של חוטי P. lacuna מתרבות ריצה. יש לטפח באור לבן (50 μmol m-2 s-1) תחת תסיסה (סיבוב אופקי, 50 סל"ד) במשך כ-5 ימים ב-25 מעלות צלזיוס.
  3. הכן כ-200 מיקרוגרם של הדנ"א וקטורי של הטרנספורמציה באמצעות ערכת הכנה של midi (ראה טבלת החומרים) בהתאם להוראות היצרן.
  4. הומוגניזציה של 100 מ"ל של תרחיף תא P. lacuna (ראה טבלת החומרים) ב-10,000 סל"ד למשך 3 דקות. מדוד OD ב- 750 ננומטר (ערך רצוי = 0.35).
  5. צנטריפוגה של תרחיף התא למשך 15 דקות ב-6,000 × גרם. הסר את הסופרנטנט, והשעה את הכדור ב- 800 μL (נפח כולל שאריות נוזלים וחוטים) של הנוזל הנותר ושל מדיום f/2+ נוסף.
  6. קח שמונה לוחות f/2+ בקט-אגר (קוטר 10 ס"מ) המכילים 120 מיקרוגרם /מ"ל קנאמיצין. פיפטה 10 מיקרוגרם של דנ"א באמצע כל צלחת אגר. מיד פיפטה 100 μL של תרחיף התא לאמצע כל צלחת אגר (על גבי הדנ"א).
  7. שמור את צלחת האגר ללא מכסה על הספסל הנקי כדי לאפשר לנוזל העודף להתאדות. סגרו את הצלחת וטפחו אותה באור לבן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך יומיים.
  8. פזרו את החוטים של כל צלחת אגר עם לולאת חיסון על מספר צלחות בקט-אגר טריות המכילות 120 מיקרוגרם/מ"ל קנאמיצין. טפחו את הצלחות באור לבן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ובדקו את התרביות באופן קבוע תחת מיקרוסקופ.
  9. זהה חוטים חיים שעברו טרנספורמציה לאחר 7-28 ימים מתחת למיקרוסקופ. חפשו חוטים ירוקים ובריאים (איור 2) השונים מחוטים אחרים. אם ניתן לזהות את החוטים הירוקים האלה, המשך עם השלב הבא; אחרת, שמור את הצלחת עוד 7 ימים.
  10. השתמשו במלקחיים כדי להעביר את החוטים החיים המזוהים האלה ל-50 מ"ל של מדיום f/2+ נוזלי עם קנאמיצין של 250 מיקרוגרם/מ"ל. יש לטפח באור לבן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס על שייקר (סיבוב אופקי, 50 סל"ד). צפו בצמיחה עד ארבעה שבועות.
  11. מעבירים את החוטים בחזרה למדיום אגר המכיל 250 מיקרוגרם/מ"ל קנאמיצין ומחכים שהחוטים יגדלו. לאחר מספר ימים, העבירו חוטים בודדים לצלחת אגר טרייה עם ריכוז גבוה יותר של קנאמיצין, למשל, 500 מיקרוגרם/מ"ל. שמור על הצלחת המקורית.
  12. ודא כי החוטים מופצים בריכוז גבוה של kanamycin בתרבית נוזלית או על אגר. הגדל שוב את ריכוז הקנאמיצין כדי להאיץ את ההפרדה.
    הערה: P. lacuna שעבר טרנספורמציה גדל עד 10,000 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin. ייתכן שמינים אחרים לא יסבלו ריכוזים כה גבוהים.
  13. אם תאים עמידים גדלים ומופצים באופן נרחב על פני צלחת, בדקו את השילוב של התוסף בגנום של P. lacuna על ידי ביצוע PCR עם פריימרים חיצוניים ופנימיים.
    1. השתמש בפריימרים שנועדו לשיבוט ההחדרה כפריימרים פנימיים.
    2. לתכנון הפריימרים החיצוניים, בחרו רצפים שהם 5' ו-3' מאתר ההחדרה המוצע על הגנום של P. lacuna אך מחוץ להחדרה.
    3. לתגובות PCR, השתמשו בפריימרים פנימיים ובפריימרים חיצוניים. השתמשו בזנים העמידים ובסוג הפראי.
      הערה: פריימרים פנימיים מציינים שהתוספת קיימת; פריימרים חיצוניים מראים שהתוספת מוכנסת במוקד הנכון.
  14. עבור כל תגובת PCR, יש להניח כ-10 מ"ג מהחוטים ישירות בצינורות ה-PCR ולבצע PCR בהתאם לפרוטוקולים הסטנדרטיים24. אם לא מתקבל מוצר, לשנות את טמפרטורת החישול ולשטוף את החוטים עם מים.
    הערה: ניתן להשתמש בפולימראזות רבות ושונות ב-PCR. לפולימראזות סטנדרטיות, כגון Taq polymerase, יש שיעור שגיאה גבוה יותר מאשר פולימראזות לבדיקת שגיאות, שהן יקרות יותר. PCR אנליטי זה אינו דורש פולימראז לבדיקת שגיאות. עם זאת, יש לבדוק פולימראז לבדיקת שגיאות אם לא מתקבל מוצר PCR עם פולימראז סטנדרטי.
  15. לנתח את תוצרי ה- PCR של הקו העמיד על אלקטרופורזה אגרוזה24.
    1. השווה את מיקומי הפסים עם סמן והשווה את הסוג הפראי ואת הטרנספורמציה. עם פריימרים פנימיים וחיצוניים , חפשו רצועה גדולה יותר עבור הטרנספורמט מאשר הסוג הפראי (עקב החדרת קלטת ההתנגדות) או שתי רצועות עבור הטרנספורמט: אחת בגודל של רצועה מסוג פרא ואחת גדולה יותר. כפי שהמקרה האחרון מצביע על הפרדה לא שלמה, המשך טיפוח עם ריכוזי קנאמיצין גבוהים.
      הערה: לפרטים נוספים על PCR ואלקטרופורזה, ראה 15,24 או ספרות סטנדרטית אחרת.
  16. לביטוי GFP: שימו לב לחוטים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראו טבלת החומרים) בהגדלה של המטרה שנקבעה על פי 40 או 63x. צלם תמונת שידור בשדה בהיר ותמונת פלואורסצנציה. השתמש בהגדרות הבאות עבור GFP: פס פס של 470 ננומטר לעירור, פס פס של 525 ננומטר לפליטה ומפצל קרן של 495 ננומטר, זמן חשיפה ראשוני של 500 אלפיות השנייה.
  17. התאם את זמן החשיפה לאותות פלואורסצנטיים ברורים, תוך הימנעות מעוצמות רוויות. נסה להשתמש באותה הגדרה עבור כל הדוגמאות.
  18. מכיוון שהחוטים מסוג פרא יציגו גם פלואורסצנציה, צלם תמונות עם אותן הגדרות כמו לעיל עבור פלואורסצנציה ברקע זה.
    הערה: המתח המבטא GFP חייב להיות בעל אות גבוה יותר; אחרת, הוא אינו מבטא GFP.
  19. בהתבסס על זמני החשיפה ועל עוצמות הפיקסלים של תמונות הפלואורסצנציה, חישבו והשוו את תוכן ה-GFP של החוטים השונים.

4. שימור קריו-קונסרבציה

הערה: P. lacuna והציאנובקטריום החד-תאי Synechocystis sp. PCC 6803 משמשים. השיטה הנוכחית עובדת טוב יותר עבור P. lacuna.

  1. טפח P. lacuna או Synechocystissp PCC 6803 במשך 10 ימים לפחות ב-10 מ"ל של f/2+ או BG-11 בינוני, בהתאמה, תחת אור לבן (50 μmol m-2 s-1) ב-25 °C תחת תסיסה (סיבובים אופקיים, 50 סל"ד).
  2. הומוגניזציה של תרבית P. lacuna (ראו טבלת החומרים) ב-10,000 סל"ד למשך 3 דקות או עם מכשיר אולטרסאונד (ראו טבלת החומרים) למשך 2 דקות באנרגיה מלאה. קבע OD 750 ננומטר של כל אחת מהתרביות כדי לבדוק אם הערך הוא בין 1 ל- 7.
  3. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 6,000 × גרם במשך 15 דקות. הסר את ה-supernatant.
  4. השעו את גלולת התא ב-800 μL של מדיום f/2+ או BG-11 (נפח סופי) והעבירו לקריוביטל של 2 מ"ל. הוסף 800 μL של תמיסת 50% גליצרול לתרחיף התא. סגור את הבקבוקון וערבב על ידי היפוך חוזר ונשנה.
  5. מעבירים את הקריוביה לחנקן נוזלי ומאחסנים אותו בקופסת קריובוקס במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. שימו לב למיקום הקופסה בתוך המקפיא ולקואורדינטות של הדגימה בתוך הקופסה.
  6. להתאוששות התאים, מוציאים את הקריוביה ומפשירים את התוכן בטמפרטורת החדר. העבר את התוכן לצינור תגובה של 2 מ"ל.
  7. שטפו את הדגימה פעמיים. עבור שטיפה 1st , צנטריפוגה ב 6,000 × גרם במשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט, והחזיר את הכדור ב-2 מ"ל של f/2+ או BG-11 בינוני. עבור שטיפה2 nd , recentrifuge ב 6,000 × גרם במשך 5 דקות, להסיר את supernatant, ולהשאיל את הכדור ב 2 מ"ל של f/2+ או BG-11 בינוני.
  8. כדי לבדוק את שלמותם של תאים אלה המוכנים לטיפוח, העבירו את הכדור ל-9 מ"ל של מדיום וטיפחו אותם באור לבן (50 מיקרומול m-2 s-1) תחת תסיסה (55 סל"ד). השווה את OD 750 ננומטר של התרבות ביום הראשון ואחרי שבוע אחד.

5. תנועתיות של פורמידיום לקונה

הערה: יתוארו שלושה מבחנים שונים. אותה תרבות משמשת בכל המקרים.

  1. יש לטפח את P. lacuna במדיום f/2 תחת תסיסה אופקית (50 סל"ד) באור לבן (50 μmol m-2 s-1) במשך כ-5 ימים עד שה-OD המשוער של 750 ננומטר הוא 0.35. אחסנו את הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  2. הומוגניזציה של החוטים (ראו טבלת החומרים) ב-10,000 סל"ד למשך 3 דקות או באמצעות אולטרסאונד (ראו טבלת החומרים) למשך דקה אחת בעוצמה ובמחזור מרביים של 1. מדוד OD 750 ננומטר. אם מעל 0.35, דיללו את השבר עם תווך f/2. השתמש בפתרון זה במבחני תנועתיות בשלבים 5.3, 5.4 ו- 5.5.
  3. בדיקה לתנועה במדיום נוזלי
    1. לתצפית ישירה על תנועתיות, העבירו 8 מ"ל של מדיום המכיל P. lacuna (משלב 5.2) לתוך צלחת פטרי 6 ס"מ. יש להמתין מספר דקות עד שהדגימה תגיע לטמפרטורת החדר. מכסים את צלחת הפטרי בנייר כסף צלופן.
    2. מקם שקופית מיקרוסקופ על שולחן x-y של מיקרוסקופ סטנדרטי עם מצלמה. הפעילו את אור המיקרוסקופ. באופן אידיאלי, השתמש תמיד באותן הגדרות חשמליות ואופטיות עבור התאורה. הזז מטרה של פי 4 או 10x לנתיב האור.
    3. הניחו את צלחת הפטרי על גבי המגלשה. התאם חוטים בודדים או צרורות נימה בתנועות x, y ו-z של הטבלה.
      הערה: בשל הסידור התלת-ממדי, רק חלק מהחלק הרלוונטי יכול להיות בפוקוס. רדיד הצלופן מאפשר להתאים את המיקוד ללא הגבלה.
    4. שימו לב לתנועות של חוטים בודדים או צרורות. ודא שהעדשה האובייקטיבית אינה נוגעת בנוזל. תעדו את תנועות החוטים באמצעות מצלמת מיקרוסקופ סטנדרטית (ראו סרטון משלים S1).
  4. בדיקה לתנועה על פני השטח
    1. לתצפית על תנועתיות נימה על משטחי אגר, הכינו צלחות פטרי 6 ס"מ עם f/2 bacto-agar. ודא שהאגר גבוה מספיק כדי שהעדשה האובייקטיבית תתקרב למשטח האגר. לחלופין, הכינו שכבת אגר בעובי של כ-3 מ"מ ותעדו את החוטים דרך האגר (שמרו על הצלחת הפוכה או השתמשו במיקרוסקופ הפוך).
    2. פיפטה 0.5 מ"ל של תמיסה המכילה P. lacuna (משלב 5.2) על משטח הבקטו-אגר של צלחת פטרי 6 ס"מ. אפשרו לנוזל להיכנס לפני השטח. סגור את צלחת הפטרי והתבונן בתנועת החוטים על פני השטח באמצעות מטרה של 4x או 10x.
    3. ודא שאותן הגדרות חשמליות ואופטיות של המיקרוסקופ משמשות לאורך כל ההקלטה ובהקלטות הבאות.
    4. צלם הקלטות של קיטועי זמן באמצעות מצלמת עיניים ומערכת מיני-מחשב. ודא שמרווח הזמן בין התמונות הבאות הוא 5 s-1 דקות. תכנת את סקריפט הלינוקס של המיני-מחשב כדי לשלוט בהקלטת קיטועי הזמן. ראה קובץ משלים 2 לדוגמה סקריפט ווידאו משלים S2 כדוגמה.
  5. בדיקה לפוטוטקסיס
    1. לניסויים בפוטוטקסיס, הכינו מחזיקי דיודה פולטת אור (LED) (כאן, עם מדפסת תלת-ממד) שבה נוריות ה-LED הנבחרות בקוטר 5 מ"מ מותקנות כדי להקרין שטח של 20 מ"מ2 מלמטה למעלה (איור 3). במידת הצורך, השתמש במחזיקי LED רבים במקביל, תוך חיבור כל נורית LED חשמלית דרך נגד ופוטנציומטר לאספקת חשמל מתכווננת. מדדו והתאימו את עוצמות ה-LED, בהתאם לניסוי. ודאו שהתפאורה כולה נמצאת בחדר חשוך או במיכל חשוך סגור.
    2. מניחים 8 מ"ל של המדיום המכיל P. lacuna (משלב 5.2) לתוך צלחת פטרי 6 ס"מ. התאם את עוצמת האור של נורית ה- LED. סגרו את צלחת הפטרי עם המכסה והניחו אותה על מחזיק LED כך שהנורית תהיה במרכז צלחת הפטרי.
    3. לאחר משך הזמן הרצוי (בדרך כלל יומיים), צלם תמונה של צלחת פטרי עם מצלמת סמארטפון המכוונת ישירות למיקום הטיפול באור. השתמש בלוח LED לבן להקרנה של הדגימה. השתמש בהגדרות הידניות של המצלמה; להימנע מהשתקפויות של אור; התאימו תמיד כדי לקבל את אותו המרחק בין עדשת המצלמה לדגימה. ודא שהגדרות החשיפה מספקות תמונה המתאימה לניתוחים מאוחרים יותר באמצעות ImageJ.
    4. לכמת את הקוטר של המעגל המרכזי של חוטים באמצעות תוכנת ImageJ.
      1. פתח את ImageJ, לחץ על קובץ | פתח, בחר את הקובץ הרצוי ולחץ על Enter.
      2. בחר בלחצן ישר (עם קו ישר). לחץ על לחצן העכבר השמאלי כדי לצייר קו מקצה אחד של צלחת פטרי לקצה הנגדי. ודא שהקו עובר דרך מרכז מעגל החוטים.
      3. הקש Ctrl-K בלוח המקשים או לחץ על נתח | פרופיל העלילה בתפריט ImageJ. חפשו חלון x-y עם עוצמות פיקסלים משורטטות לעומת מרחק - פרופיל חד-ממדי של צלחת פטרי. ודא שעוצמת הפיקסלים הנמוכה ביותר היא מעט מעל 0 והערך הגבוה ביותר נמוך מ- 255.
      4. הערך ממוצע עבור עוצמת הפיקסלים מחוץ למעגל וערך ממוצע נוסף עבור עוצמת הפיקסלים במעגל. במיקום y- בין ערכים אלה, הערך את ערכי x של שני צידי המעגל על ידי הצבעה עם העכבר על מיקומים אלה. שים לב לשני הערכים וחשב את ההפרש.
      5. השג את ערך ה- x הגבוה ביותר על-ידי הפניית העכבר לציר y בצד ימין. שים לב שערך זה e מייצג את הקוטר של צלחת פטרי. אם קוטר זה הוא 5 ס"מ, חשב את קוטר מעגל החוטים המרכזי כ - d/e × 5 ס"מ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעקבות השיטות הנ"ל, 5 זנים שונים של P. lacuna בודדו מבורות סלעים ורוצפו (איור 1 וטבלה 1). כל התרבויות היו סטריליות לאחר ~ שנה אחת של תת-תרבות למעט P. lacuna HE10JO. זן זה עדיין מזוהם ב-Marivirga atlantica, חיידק ימי. במהלך טיולי הלגולנד הבאים, ציאנובקטריה נימה אחרים בודדו מבריכות סלעים, השונות מ- P. lacuna ויש לאפיין אותן.

מספר שיטות מיצוי וטיהור דנ"א נבדקו עבור P. lacuna. התוצאות הטובות ביותר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

למרות שזנים רבים של ציאנובקטריה זמינים מאוספי תרביות 32,33,34,35,36, עדיין יש ביקוש לציאנובקטריה חדשה מהטבע מכיוון שמינים אלה מותאמים לתכונות ספציפיות. P. lacuna נאסף מבורות סלעים והוא מותאם לווריאציות של ריכוזי מלח וטמפרטורה30. זנים של מין זה נמצאו במהלך טיולים בשנים 2008, 2009 ו-2010. עם ההליך המתואר כאן, 5 זנים של P. lac...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

העבודה נתמכה על ידי המכון הטכנולוגי של קרלסרוהר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Autoclave 3870 ELVTuttnauer3870 ELV
Bacto AgarOttoNorwald214010
BG-11 תמיסת מים מתוקיםSigma AldrichC3061
BG-11 בינוניMerck73816-250ML
חומצה בוריתMerck10043-35-3H3BO3
סידן כלוריד דיהידראטCarl Roth10035-04-8CaCl2 · 2 H2O
צלוחיות תרבית תאים Cellstar עם מכסה בורג מסנן, סטרילי, 250 מ"לגריינר658190
צלוחיות תרבית תאים Cellstar עם מכסה בורג מסנן, סטרילי, 50 מ"לגריינר601975
צנטריפוגה LYNX 4000Thermo Scientific75006580ורוטור
צנטריפוגה מיקרוסטאר 17VWR InternationalN/Aעבור עד 13,000 סל"ד
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)PanReac AppliChem57-09-0C19H42BrN
כלורופורם: איזואמיל אלכוהול 24: 1PanReac AppliChem
A1935
קובלט (II) כלוריד הקסהידראטMerck7791-13-1CoCl2 · 6 H2O
נחושת (II) סולפט פנטהידראטMerck7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-ביוטיןקארל רות'58-85-5  C10H16N2O3S
סולם DNA 1 kbניו אינגלנד BiolabsN3232
סולם DNA 100 bpניו אינגלנד BiolabsN3231
עזרה בצנרת חשמלית accujet-pro Sמותג GmbH26360לפיפטינג 1-25 מ"ל
אתנולVWR64-17-5C2H6O
אתילנדיאמין חומצה טטראצטית דיסודיום מלח דיהידרטקארל רוט6381-92-6EDTA-Na2 · 2 H2O
מיקרוסקופ פלואורסצנטי ApoTomeZeiss
מיקרוסקופ פלואורסצנטי Axio Imager 2Zeiss
לחץ Cell PressAmerican Instrument CompanyN/A
מערכת תיעוד ג'ל Saffe ImageInvitrogen
מערכת Gelelctrophoresis Mupid-One/-exuADVANCED
Glassware, שונים
גליצרולקארל רוט56-81-5C3H8O3
Iron(III) כלוריד הקסהידרטMerckברקוד 10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
KanamycinSigma-Aldrich25389-94-0
Kanamycin sulphateCarl Roth25389-94-0C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, מלח נתרן (Sarcosyl)Sigma Aldrich137-16-6C15H28NO3 ·
Na LB Broth (Lennox)Carl RothX964.4
מקור אור, צינור פלורסנט L18W/954 אור יוםOSRAMגידול ציאנובקטריה
מקור אור, פאנל LED XL 6500K 140 WBloom StarN/Aגידול ציאנובקטריה, עד 1,000 ומיקרו; mol m-2 s-1
מגנזיום כלוריד הקסהידרטקארל רות'7791-18-6MgCl2 · 6 H2O
מנגן(II) כלוריד טטרהידראטServa13446-34-9MnCl2 · 4 H2O
מיקרוסקופ DM750Zeiss
ערכת מיצוי פלסמיד הכנה Midi ערכת NucleoBond Xtra Midi ערכתMacherey-NAGEL GmbH & Co. KGREF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 +Conrad Electronics2138863-YDלהקלטת זמן-lapse מצלמת
עיניים EC3Leicaלהקלטה רציפה עד 30 שניות
מצלמת עיניים MikrOkular Full HDBresserלהקלטות זמן-lapse, יחד עם מיני-מחשב Raspberry Pi
צלחות פטרי פוליסטירול, 100 מ"מ x 20 מ"מMerckP5606-400EA
צלחות פטרי פוליסטירול, 60 מ"מ x 15 מ"מMerckP5481-500EA
פוטומטר Nanodrop ND-1000Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XSGoebel Instrumentelle Analytik GmbH
פיפטמן 100-1,000 ומיקרו; LGilsonמק"ט: FA10006M
Pipetman 10-100 ומיקרו; לגילסוןמק"ט: FA10004M
פיפטות פלסטיק 10 מ"ל,סטרילית גריינר607107
סטרילית, סטרילית, שפופרת188271גריינר
ל, סטרילית, 50 מ"לגריינר227261
אשלגן ברומידקארל רוט7758-02-3KBr
אשלגן כלוריקרל רוט7447-40-7ספק כוח KCl
Statron 3252-1Statron Gerä tetechnik GmbH
ספק כוח וולטקראפט PPS 16005קונרד אלקטרוניקהעבור LED
פרוטאינאז KPromegaMC500Cממקסוול 16 miRNA ערכת רקמות AS1470
Q5 פולימראזניו אינגלנד BiolabsM0491S
ערכת ריצוף הבאSeq 500/550 v2.5Illumina
הבאSeq 550 SY-415-1002Illumina
Shaker Unimax 2010מכשיריהיידולף לגידול
נתרן אצטטקארל רוט127-09-3NaCH3COO
נתרן כלוריקארל רוט7647-14-5NaCl
נתרן דימימן פוספט מונוהידרטקארל רוט10049-21-5NaH2PO4 · H2O
נתרן פלואורידCarl Roth7681-49-4NaF
נתרן מימן פחמתיCarl Roth144-55-8NaHCO3נתרן
מוליבדט דיהידראטServa10102-40-6Na2MoO4 · 2 H2O
נתרן חנקתיMerck7631-99-4NaNO3
נתרן גופרתיCarl Roth7757-82-6Na2SO4
Strontium chloride hexahydrateCarl Roth10025-70-4SrCl2 · 6 H2O
תיאמין הידרוכלורידMerck67-03-8C12H17ClN4OS · HCl
TRISCarl Roth77-86-1C4H11NO3
Ultra מכשיר UP100H עם sonotrode MS3Hielscher טכנולוגיית אולטרסאונדUP100H
Ultraturrax Silent Crusher MHeidolph Instrumentsהומוגנייזר
אוריאהקארל רוט57-13-6CH4<>N2O
ויטמין B12Sigma68-19-9C63H88CoN14O14P
תמיסת0.3 ומיקרו; M thiamin-HCl, 2.1 ננומטר ביוטין, 0.37 ננומטר ציאנוקובלמין
סטילס מים, טיפול במיםטכנולוגיות מים VEOLIAELGA_21001
אבץ סולפט הפטהידראטסיגמא7446-20-0ZnSO4 · 7 H2O
תוכנה, URL
gatb-minia תוכנית להרכבתDNAhttps://github.com/GATB/gatb-minia-pipelineמייצרת פיגומים גדולים מקריאות DNA קצרות,
לעיבוד אימג' (עוצמות פיקסלים, קוטר מעגל)
>
מי ים מלאכותיים0.41 מ' NaCl, 53 מ"מ MgCl<תת>2,28 מ"מ Na2SO4, 10 mM CaCl2, 9 mM  KCl , 2.4 מ"מ NaHCO<תת>3 , 0.84 מ"מ KBr, 0.49 מ"מ H<תת>3BO<תת>3, 90 ומיקרו; M SrCl<תת>2, 72 ומיקרו; M NaF
f/2 - מי ים מלאכותיים בינוניים נוזליים, 0.1% (v/v) תמיסת יסודות קורט, 0.05% (v/v) תמיסת ויטמינים, 0.88 מ"מ NaNO3, 36 µ M NaH2PO4 
f/2+ נוזלי בינוניf/2-בינוני, עם NaNO3 מוגבר פי 10 ו-NaH2PO4 (0.88 מ"מ NaNO3, 36 µ M NaH2PO4
f/2+-agar3% (w/v) bacto agar, מי ים מלאכותיים, 0.1% (v/v) תמיסת יסודות קורט, 0.05% (v/v) תמיסת ויטמינים, 8.8 מ"מ NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar3% (w/v) בקטו אגר, מי ים מלאכותיים, 0.1% (v/v) תמיסת יסודות קורט, 0.05% (v/v) תמיסת ויטמין, 0.88 מ"מ NaNO3, 36 & M NaH2PO4
Trace Element Solution0.36 mM NaH2PO4, 12 µ M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 ומיקרו; M MnCl<תת>2
ויטמין0.3 ומיקרו; M תיאמין-הידרוכלוריד, 2.1 ננומטר ביוטין, 0.37 ננומטר ציאנוקובלמין
French שפופרת פלסטיק פלסטיק 15 מ" מערכת ריצוף ויטמין תוכנת ImageJ מבוססת לינוקס קלט https://rast.nmpdr.org שרת הערות RAST: רצף DNA גנומי, מזהה מסגרות קריאה פתוחות, מפרט רצפי חלבונים ותפקידיהם <חזק>מדיה תרבותית

מקורות

  1. Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
  2. Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria. Energies. 12 (18), 3515(2019).
  3. Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 1259(2019).
  4. Tandeau de Marsac, N., et al. A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant. Gene. 20 (1), 111-119 (1982).
  5. Porter, R. D. Transformation in cyanobacteria. Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).
  6. Joset, F. Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA. Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).
  7. Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination. Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).
  8. Matsunaga, T., Takeyama, H. Genetic engineering in marine cyanobacteria. Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).
  9. Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation. Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).
  10. Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1. Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).
  11. Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. Transgenic Microalgae as Green Cell. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).
  12. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. Plos One. 15 (6), 0234440(2020).
  13. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).
  14. El Semary, N. A. Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806. Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).
  15. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. PLoS One. 15 (6), 0234440(2020).
  16. Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp. Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).
  17. Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis. Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).
  18. Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiological Research. 236, 126454(2020).
  19. Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP. Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).
  20. Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light. Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).
  21. Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).
  22. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  23. Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. Preparation of artificial seawater. Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Cold Spring Harbor Protocols. CTAB DNA extraction buffer. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).
  26. Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -P., Sinha, R. P. An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).
  27. French, C. S., Milner, H. W. Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion. Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).
  28. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  29. Lamparter, T., et al. The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna. bioRxiv. , (2021).
  30. Nies, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
  31. Kachel, B., Mack, M. Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2). Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).
  32. Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon. Algological Studies. 63, 59-112 (1992).
  33. Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii. Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).
  34. Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin. Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).
  35. Schlosser, U. G., Friedl, T. Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997. Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).
  36. Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).
  37. Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco. Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).
  38. Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells. EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).
  39. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).
  40. Taton, A., et al. The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria. Nature Communications. 11 (1), 1688(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ציאנובקטריה חוטיתשיטת שימור בהקפאהמיצוי DNAמיקרוסקופיה פלואורסצנטיתבדיקת ניידותעמידות לקנמיציןהשוואת פרומוטורים
טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור קריו-קונסרבציה של הציאנובקטריום הנימה פורמידיום לקונה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.