מאמר שיטה

טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור קריו-קונסרבציה של הציאנובקטריום הנימה פורמידיום לקונה

DOI:

10.3791/63470

⸱

1 בפברואר 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פורמידיום לקונה (שם מדעי: Phormidium lacuna ) הוא ציאנובקטריום נימה שבודד מסלעים ימיים. מאמר זה מתאר את הבידוד של חוטים ממקורות טבעיים, מיצוי DNA, ריצוף גנום, טרנספורמציה טבעית, ביטוי של sfGFP, קריוקונסרבציה ושיטות תנועתיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ציאנובקטריה הם המוקד של מחקר בסיסי ופרויקטים ביוטכנולוגיים שבהם אנרגיה סולארית מנוצלת לייצור ביומסה. פורמידיום לקונה (שם מדעי: Phormidium lacuna ) הוא ציאנובקטריום נימה שבודד לאחרונה. מאמר זה מתאר כיצד ניתן לבודד ציאנובקטריה נימה חדשה מבורות סלעים ימיים. הוא גם מתאר כיצד ניתן לחלץ דנ"א מחוטים וכיצד ניתן לרצף את הגנומים. אף על פי שהטרנספורמציה נוצרת עבור מינים חד-תאיים רבים, היא מדווחת בתדירות נמוכה יותר על ציאנובקטריה נימה. שיטה פשוטה לטרנספורמציה הטבעית של P. lacuna מתוארת כאן. P. lacuna הוא החבר היחיד במסדר מתנדים שעבורו נוצרת טרנספורמציה טבעית. מאמר זה גם מראה כיצד טרנספורמציה טבעית משמשת לביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק בעל קיפול יתר (sfGFP). מקדם cpcB אנדוגני גרם לביטוי חזק בערך פי 5 מאשר מקדמי cpc560, A2813 או psbA2 מ- Synechocystis sp. PCC6803. יתר על כן, הוקמה שיטה לשמירת ההקפאה של P. lacuna ו - Synechocystis sp.CPP 6803, ותוארו שיטות להערכת תנועתיות בתווך נוזלי ועל משטחי אגר ופלסטיק.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ציאנובקטריה הם אורגניזמים פרוקריוטים המשתמשים בפוטוסינתזה כמקור אנרגיה 1,2. המחקר מתמקד יותר ויותר במינים ציאנובקטריאליים. ניתן לשנות מספר ציאנובקטריה באמצעות DNA3. גנים יכולים להיות מופלים או ביטוי יתר במינים אלה. עם זאת, השינוי מוגבל למינים בודדים 4,5,6,7,8,9,10,11, וזה יכול להיות קשה לבסס טרנספורמציה בזנים מאוספי תרבויות או 8 בטבע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בידוד מהסביבה הטבעית

הערה: ניתן לבודד אצות ירוקות, דיאטומים, ציאנובקטריה נימה ומיקרו-אצות אחרות. הפרוטוקול יכול לשמש עבור כל מיני מיקרו-אלגה מבורות סלעים הגדלים בתנאי מעבדה. ציאנובקטריה נימה השייכת לתנודות ניתן לזהות בקלות על ידי תנועתם וצורתם החוטית. ניתן לזהות את המין במצב חצי-פורה על ידי ריצוף גנום או ריצוף 16S rRNA.

  1. העברת דגימות מי ים נוזליים מבורות סלע ימיים (כלומר, חללים בחוף הסלעי) לצלוחיות של 50 מ"ל. עבור כל בקבוקון, שים לב למיקום המדויק או לקואורדינטות של המקור הטבעי. במידת האפשר, סנן את התוכן דרך רשתות של 50 מיקרומטר כדי להפחית את כמויות הזואופלנקטון. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שנ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות השיטות הנ"ל, 5 זנים שונים של P. lacuna בודדו מבורות סלעים ורוצפו (איור 1 וטבלה 1). כל התרבויות היו סטריליות לאחר ~ שנה אחת של תת-תרבות למעט P. lacuna HE10JO. זן זה עדיין מזוהם ב-Marivirga atlantica, חיידק ימי. במהלך טיולי הלגולנד הבאים, ציאנובקטריה נימה אחרים בודדו מבריכות סלעים, השונות מ- P. lacuna ויש לאפיין אותן.

מספר שיטות מיצוי וטיהור דנ"א נבדקו עבור P. lacuna. התוצאות הטובות ביותר .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות שזנים רבים של ציאנובקטריה זמינים מאוספי תרביות 32,33,34,35,36, עדיין יש ביקוש לציאנובקטריה חדשה מהטבע מכיוון שמינים אלה מותאמים לתכונות ספציפיות. P. lacuna נאסף מבורות סלעים והוא מותאם לווריאציות של ריכוזי מלח וטמפרטורה30. זנים של מין זה נמצאו במהלך טיולים בשנים 2008, 2009 ו-2010. עם ההליך המתואר כאן, 5 זנים של P. lac.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה נתמכה על ידי המכון הטכנולוגי של קרלסרוהר.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Autoclave 3870 ELVTuttnauer3870 ELV
Bacto AgarOttoNorwald214010
BG-11 תמיסת מים מתוקיםSigma AldrichC3061
BG-11 בינוניMerck73816-250ML
חומצה בוריתMerck10043-35-3H3BO3
סידן כלוריד דיהידראטCarl Roth10035-04-8CaCl2 · 2 H2O
צלוחיות תרבית תאים Cellstar עם מכסה בורג מסנן, סטרילי, 250 מ"לגריינר658190
צלוחיות תרבית תאים Cellstar עם מכסה בורג מסנן, סטרילי, 50 מ"לגריינר601975
צנטריפוגה LYNX 4000Thermo Scientific75006580ורוטור
צנטריפוגה מיקרוסטאר 17VWR InternationalN/Aעבור עד 13,000 סל"ד
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)PanReac AppliChem57-09-0C19H42BrN
כלורופורם: איזואמיל אלכוהול 24: 1PanReac AppliChem
A1935
קובלט (II) כלוריד הקסהידראטMerck7791-13-1CoCl2 · 6 H2O
נחושת (II) סולפט פנטהידראטMerck7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-ביוטיןקארל רות'58-85-5  C10H16N2O3S
סולם DNA 1 kbניו אינגלנד BiolabsN3232
סולם DNA 100 bpניו אינגלנד BiolabsN3231
עזרה בצנרת חשמלית accujet-pro Sמותג GmbH26360לפיפטינג 1-25 מ"ל
אתנולVWR64-17-5C2H6O
אתילנדיאמין חומצה טטראצטית דיסודיום מלח דיהידרטקארל רוט6381-92-6EDTA-Na2 · 2 H2O
מיקרוסקופ פלואורסצנטי ApoTomeZeiss
מיקרוסקופ פלואורסצנטי Axio Imager 2Zeiss
לחץ Cell PressAmerican Instrument CompanyN/A
מערכת תיעוד ג'ל Saffe ImageInvitrogen
מערכת Gelelctrophoresis Mupid-One/-exuADVANCED
Glassware, שונים
גליצרולקארל רוט56-81-5C3H8O3
Iron(III) כלוריד הקסהידרטMerckברקוד 10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
KanamycinSigma-Aldrich25389-94-0
Kanamycin sulphateCarl Roth25389-94-0C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, מלח נתרן (Sarcosyl)Sigma Aldrich137-16-6C15H28NO3 ·
Na LB Broth (Lennox)Carl RothX964.4
מקור אור, צינור פלורסנט L18W/954 אור יוםOSRAMגידול ציאנובקטריה
מקור אור, פאנל LED XL 6500K 140 WBloom StarN/Aגידול ציאנובקטריה, עד 1,000 ומיקרו; mol m-2 s-1
מגנזיום כלוריד הקסהידרטקארל רות'7791-18-6MgCl2 · 6 H2O
מנגן(II) כלוריד טטרהידראטServa13446-34-9MnCl2 · 4 H2O
מיקרוסקופ DM750Zeiss
ערכת מיצוי פלסמיד הכנה Midi ערכת NucleoBond Xtra Midi ערכתMacherey-NAGEL GmbH & Co. KGREF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 +Conrad Electronics2138863-YDלהקלטת זמן-lapse מצלמת
עיניים EC3Leicaלהקלטה רציפה עד 30 שניות
מצלמת עיניים MikrOkular Full HDBresserלהקלטות זמן-lapse, יחד עם מיני-מחשב Raspberry Pi
צלחות פטרי פוליסטירול, 100 מ"מ x 20 מ"מMerckP5606-400EA
צלחות פטרי פוליסטירול, 60 מ"מ x 15 מ"מMerckP5481-500EA
פוטומטר Nanodrop ND-1000Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XSGoebel Instrumentelle Analytik GmbH
פיפטמן 100-1,000 ומיקרו; LGilsonמק"ט: FA10006M
Pipetman 10-100 ומיקרו; לגילסוןמק"ט: FA10004M
פיפטות פלסטיק 10 מ"ל,סטרילית גריינר607107
סטרילית, סטרילית, שפופרת188271גריינר
ל, סטרילית, 50 מ"לגריינר227261
אשלגן ברומידקארל רוט7758-02-3KBr
אשלגן כלוריקרל רוט7447-40-7ספק כוח KCl
Statron 3252-1Statron Gerä tetechnik GmbH
ספק כוח וולטקראפט PPS 16005קונרד אלקטרוניקהעבור LED
פרוטאינאז KPromegaMC500Cממקסוול 16 miRNA ערכת רקמות AS1470
Q5 פולימראזניו אינגלנד BiolabsM0491S
ערכת ריצוף הבאSeq 500/550 v2.5Illumina
הבאSeq 550 SY-415-1002Illumina
Shaker Unimax 2010מכשיריהיידולף לגידול
נתרן אצטטקארל רוט127-09-3NaCH3COO
נתרן כלוריקארל רוט7647-14-5NaCl
נתרן דימימן פוספט מונוהידרטקארל רוט10049-21-5NaH2PO4 · H2O
נתרן פלואורידCarl Roth7681-49-4NaF
נתרן מימן פחמתיCarl Roth144-55-8NaHCO3נתרן
מוליבדט דיהידראטServa10102-40-6Na2MoO4 · 2 H2O
נתרן חנקתיMerck7631-99-4NaNO3
נתרן גופרתיCarl Roth7757-82-6Na2SO4
Strontium chloride hexahydrateCarl Roth10025-70-4SrCl2 · 6 H2O
תיאמין הידרוכלורידMerck67-03-8C12H17ClN4OS · HCl
TRISCarl Roth77-86-1C4H11NO3
Ultra מכשיר UP100H עם sonotrode MS3Hielscher טכנולוגיית אולטרסאונדUP100H
Ultraturrax Silent Crusher MHeidolph Instrumentsהומוגנייזר
אוריאהקארל רוט57-13-6CH4<>N2O
ויטמין B12Sigma68-19-9C63H88CoN14O14P
תמיסת0.3 ומיקרו; M thiamin-HCl, 2.1 ננומטר ביוטין, 0.37 ננומטר ציאנוקובלמין
סטילס מים, טיפול במיםטכנולוגיות מים VEOLIAELGA_21001
אבץ סולפט הפטהידראטסיגמא7446-20-0ZnSO4 · 7 H2O
תוכנה, URL
gatb-minia תוכנית להרכבתDNAhttps://github.com/GATB/gatb-minia-pipelineמייצרת פיגומים גדולים מקריאות DNA קצרות,
לעיבוד אימג' (עוצמות פיקסלים, קוטר מעגל)
>
מי ים מלאכותיים0.41 מ' NaCl, 53 מ"מ MgCl<תת>2,28 מ"מ Na2SO4, 10 mM CaCl2, 9 mM  KCl , 2.4 מ"מ NaHCO<תת>3 , 0.84 מ"מ KBr, 0.49 מ"מ H<תת>3BO<תת>3, 90 ומיקרו; M SrCl<תת>2, 72 ומיקרו; M NaF
f/2 - מי ים מלאכותיים בינוניים נוזליים, 0.1% (v/v) תמיסת יסודות קורט, 0.05% (v/v) תמיסת ויטמינים, 0.88 מ"מ NaNO3, 36 µ M NaH2PO4 
f/2+ נוזלי בינוניf/2-בינוני, עם NaNO3 מוגבר פי 10 ו-NaH2PO4 (0.88 מ"מ NaNO3, 36 µ M NaH2PO4
f/2+-agar3% (w/v) bacto agar, מי ים מלאכותיים, 0.1% (v/v) תמיסת יסודות קורט, 0.05% (v/v) תמיסת ויטמינים, 8.8 מ"מ NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar3% (w/v) בקטו אגר, מי ים מלאכותיים, 0.1% (v/v) תמיסת יסודות קורט, 0.05% (v/v) תמיסת ויטמין, 0.88 מ"מ NaNO3, 36 & M NaH2PO4
Trace Element Solution0.36 mM NaH2PO4, 12 µ M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 ומיקרו; M MnCl<תת>2
ויטמין0.3 ומיקרו; M תיאמין-הידרוכלוריד, 2.1 ננומטר ביוטין, 0.37 ננומטר ציאנוקובלמין
French שפופרת פלסטיק פלסטיק 15 מ" מערכת ריצוף ויטמין תוכנת ImageJ מבוססת לינוקס קלט https://rast.nmpdr.org שרת הערות RAST: רצף DNA גנומי, מזהה מסגרות קריאה פתוחות, מפרט רצפי חלבונים ותפקידיהם <חזק>מדיה תרבותית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
  2. Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evalua....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNA

מאמרים קשורים