הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

In vivo טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים לחשיפת דפוסי פעילות המושרים על ידי גירוי מוחי עמוק בחולדות

2.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63478

⸱

23 במרץ 2022

 ,  ,  ,  , 
1Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Laboratorio de Imagen Médica, Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón, 3Departamento de Bioingeniería e Ingeniería Aeroespacial, Universidad Carlos III de Madrid, 4CIBER de Salud Mental (CIBERSAM), 5High Performance Research Group in Physiopathology and Pharmacology of the Digestive System (NeuGut), Universidad Rey Juan Carlos

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים שיטה ניסיונית פרה-קלינית להערכת נוירומודולציה מטבולית המושרה על-ידי גירוי מוחי עמוק חריף באמצעות in vivo FDG-PET. כתב יד זה כולל את כל השלבים הניסיוניים, החל מניתוח סטריאוטקסי ועד ליישום הטיפול בגירוי ורכישה, עיבוד וניתוח של תמונות PET.

תקציר

גירוי מוחי עמוק (DBS) היא טכניקה נוירוכירורגית פולשנית המבוססת על יישום פולסים חשמליים למבנים מוחיים המעורבים בפתופיזיולוגיה של המטופל. למרות ההיסטוריה הארוכה של DBS, מנגנון הפעולה והפרוטוקולים המתאימים שלו עדיין אינם ברורים, ומדגישים את הצורך במחקר שמטרתו לפתור את החידות הללו. במובן זה, הערכת ההשפעות in vivo של DBS באמצעות טכניקות הדמיה תפקודית מייצגת אסטרטגיה רבת עוצמה כדי לקבוע את ההשפעה של גירוי על הדינמיקה במוח. כאן מתואר פרוטוקול ניסיוני למודלים פרה-קליניים (חולדות Wistar), בשילוב עם מחקר אורך [18F]-פלואורודוקסיקלוקוז טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (FDG-PET), כדי להעריך את ההשלכות החריפות של DBS על חילוף החומרים במוח. ראשית, בעלי חיים עברו ניתוח סטריאוטקטי להשתלה דו-צדדית של אלקטרודות בקליפת המוח הקדם-מצחית. סריקת טומוגרפיה ממוחשבת (CT) לאחר ניתוח של כל חיה נרכשה כדי לאמת את מיקום האלקטרודות. לאחר שבוע של התאוששות, נרכש FDG-PET סטטי ראשון של כל חיה שנותחה ללא גירוי (D1), ויומיים לאחר מכן (D2), נרכש FDG-PET שני בזמן שבעלי החיים היו מגורה. לשם כך, האלקטרודות חוברו לממריץ מבודד לאחר מתן FDG לבעלי החיים. לפיכך, בעלי חיים היו מגורה במהלך תקופת ספיגת FDG (45 דקות), רישום ההשפעות החריפות של DBS על חילוף החומרים במוח. בהתחשב באופי החקרני של מחקר זה, תמונות FDG-PET נותחו על ידי גישה חכמה של ווקסל המבוססת על מבחן T זוגי בין מחקרי D1 ו- D2. באופן כללי, השילוב של DBS ומחקרי הדמיה מאפשר לתאר את ההשלכות של נוירומודולציה על רשתות עצביות, ובסופו של דבר עוזר לפענח את הבלבול סביב DBS.

מבוא

המונח גירוי עצבי מקיף מספר טכניקות שונות שמטרתן לעורר את מערכת העצבים עם מטרה טיפולית1. ביניהם, גירוי מוחי עמוק (DBS) בולט כאחת האסטרטגיות הנפוצות ביותר לגירוי עצבי בקליניקה. DBS מורכב מגירוי של גרעיני מוח עמוקים עם פולסים חשמליים המועברים על ידי נוירוסטימולטור, המושתלים ישירות לגוף המטופל, באמצעות אלקטרודות הממוקמות לתוך המטרה המוחית כדי להיות מווסת על ידי ניתוח סטריאוטקטי. מספר המאמרים המעריכים את ההיתכנות של יישום DBS בהפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות שונות גדל בהתמדה2, אם כי רק חלקם אושרו על ידי איגוד המזון והתרופות (FDA) (כלומר, רעד חיוני, מחלת פרקינסון, דיסטוניה, הפרעה אובססיבית-קומפולסיבית ואפילפסיה עקשן מבחינה רפואית)3 . יתר על כן, מספר רב של מטרות מוחיות ופרוטוקולי גירוי נמצאים תחת מחקר לטיפול DBS בהרבה יותר פתולוגיות ממה שאושר רשמית, אך אף אחת מהן אינה נחשבת סופית. חוסר עקביות זה במחקר DBS ובהליכים קליניים עשוי לנבוע בחלקו מחוסר הבנה מלאה של מנגנון הפעולה שלו4. לכן, נעשים מאמצים אדירים לפענח את השפעות ה-in vivo של DBS על הדינמיקה של המוח, שכן כל התקדמות, קטנה ככל שתהיה, תסייע לשכלל את פרוטוקולי ה-DBS להצלחה טיפולית גדולה יותר.

בהקשר זה, טכניקות הדמיה מולקולרית פותחות חלון ישיר להתבוננות בהשפעות נוירומודולטוריות in vivo של DBS. גישות אלה מספקות הזדמנות לא רק לקבוע את ההשפעה של DBS בזמן שהוא מיושם, אלא גם לפענח את אופי ההשלכות שלו, למנוע תופעות לוואי לא רצויות ושיפור קליני, ואף להתאים פרמטרים של גירוי לצרכי המטופל5. בין שיטות אלה, טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) באמצעות 2-deoxy-2-[18F]fluoro-D-glucose (FDG) מעניינת במיוחד מכיוון שהיא מספקת מידע ספציפי ובזמן אמת על מצב ההפעלה של אזורי מוח שונים6. באופן ספציפי, הדמיית FDG-PET מספקת הערכה עקיפה של הפעלה עצבית המבוססת על העיקרון הפיזיולוגי של צימוד מטבולי בין נוירונים לתאי גליה6. במובן זה, מספר מחקרים קליניים דיווחו על דפוסי פעילות מוחית מווסתת DBS באמצעות FDG-PET (ראוסקירה 3 ). עם זאת, למחקרים קליניים יש בקלות מספר חסרונות כאשר הם מתמקדים בחולים, כגון הטרוגניות או קשיי גיוס, המגבילים מאוד את פוטנציאל המחקר שלהם6. הקשר זה מוביל חוקרים להשתמש במודלים של בעלי חיים של מצבים אנושיים כדי להעריך גישות ביו-רפואיות לפני התרגום הקליני שלהן, או, אם כבר מיושם בפועל קליני, כדי להסביר את המקור הפיזיולוגי של יתרונות טיפוליים או תופעות לוואי. לפיכך, למרות המרחקים הגדולים בין הפתולוגיה האנושית לבין המצב המעוצב בחיות מעבדה, גישות פרה-קליניות אלה חיוניות למעבר בטוח ויעיל לפרקטיקה קלינית.

כתב יד זה מתאר פרוטוקול DBS ניסיוני למודלים של מורין, בשילוב עם מחקר אורך FDG-PET, על מנת להעריך את ההשלכות החריפות של DBS על חילוף החומרים במוח. התוצאות המתקבלות עם פרוטוקול זה עשויות לעזור לפענח את דפוסי המודולציה המורכבים המושרים על פעילות המוח על ידי DBS. לכן, ניתנת אסטרטגיה ניסיונית מתאימה לבחינת השלכות הגירוי in vivo , המאפשרת לקלינאים לצפות השפעות טיפוליות בנסיבות ספציפיות ולאחר מכן להתאים פרמטרים של גירוי לצרכי המטופל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הליכים ניסיוניים בבעלי חיים נערכו על פי הנחיית מועצת הקהילות האירופית 2010/63/EU, ואושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של בית החולים גרגוריו מראניון. סיכום גרפי של פרוטוקול הניסוי מוצג באיור 1A.

1. לוקליזציה של מטרות המוח על ידי הדמיה מוחית in vivo

  1. הכנת בעלי חיים
    הערה: חולדות Wistar זכרים של ~ 300 גרם שימשו.
    1. הכניסו את החיה לקופסת אינדוקציה להרדמה ואטמו את החלק העליון.
    2. הפעל את מאדה sevoflurane (5% עבור אינדוקציה ב 100% O2). כאשר החולדה מורדמת, העבירו את זרימת הגז לאף. אשר את מצב ההרדמה על ידי צביטה של כף החולדה.
    3. הנח את החיה על מיטת ה- CT, תוך שמירה על הרדמה sevoflurane (3% לתחזוקה ב 100% O2).
  2. הדמיית CT
    הערה: בחירת האמפר, המתח, מספר ההקרנות, מספר היריות ורזולוציית הווקסל תלויה בסורק ה-CT. כאןנעשה שימוש בפרמטרים הבאים: 340 mA, 40 KV, 360 הקרנות, 8 יריות ורזולוציה של 200 מיקרומטר 7,8,9.
    1. הדקו את מסכת הפנים או את חרוט האף לחולדה.
    2. אבטחו את גוף החולדה בראש, בכתפיים, בירכיים ובזנב בעזרת סרט משי כדי לספק מספיק איפוק ללא נזק.
    3. עקבו אחר החולדה באופן רציף.
    4. אתר את הראש במרכז שדה הראייה של סורק ה- CT.
    5. המשך לרכוש את תמונת ה- CT באמצעות פרמטרי רכישה בהתאם למפרטי הסורק.
    6. לאחר 10 דקות, כאשר סריקת ה-in vivo CT הושלמה, עצרו את זרימת ה-sevoflurane והכניסו את החולדה לסורק ה-MRI.
  3. הדמיית MR
    הערה: מפרטי רכישת הסריקה משתנים בין סורקים, כולל מערכות תוכנה שונות וחשוב מכך, שאלת המחקר הספציפית. כאן נעשה שימוש בסורק 7 טסלה. נעשה שימוש ברצף ספין-הד משוקלל T2 7,8,9 עם TE = 33 ms, TR = 3732 ms, ועובי פרוסה של 0.8 מ"מ (34 פרוסות), גודל מטריצה של 256 x 256 פיקסלים עם FOV של 3.5 x 3.5 ס"מ2 שימש.
    1. הניחו את שכיבה של החיה על מיטת ה-MRI, תוך שמירה על הרדמה של sevoflurane (3% לתחזוקה ב-100% O2).
    2. הצמידו את הראש למסגרת סטריאוטקטית הממוקמת על מיטת הסורק כדי למנוע תנועות ראש במהלך רכישת MRI. כמו כן, לאבטח את שאר הגוף חולדה עם סרט משי.
    3. מקם את הראש במרכז שדה הראייה של סורק ה- MRI.
    4. לאחר שהעמדה נכונה, המשך לרכוש את תמונת ה- MRI.
    5. בסיום סריקת ה-MRI in vivo, עצרו את זרימת ה-sevoflurane והכניסו את החולדה לכלוב שלה.
    6. אתרו מנורת חימום ליד הכלוב מכיוון שחולדות בדרך כלל מורידות את טמפרטורת הגוף שלהן במהלך הסריקה.
    7. עקוב אחר החולדה עד להתאוששות מההרדמה.
  4. חישוב לוקליזציה משותפת של אטלס וקואורדינטות יעד
    1. לאחר שתמונות CT ו-MRI נרכשות ומשוחזרות בהתאם להמלצות הסורק, רשום במשותף את תמונות ה-CT וה-MRI.
    2. השתמש בתוכנת עיבוד הדמיה כדי לנרמל מרחבית CT ו- MRI באמצעות אלגוריתם רישום קשיח אוטומטי המבוסס על מידע הדדי10.
    3. מקם את קו Bregma בתמונה הרשומה במשותף, ומדוד את המרחק בציר הקדמי/אחורי (AP: +3.5 מ"מ), קו האמצע/לרוחב (ML: +0.6 מ"מ) והדורסו-בנטרלי (DV: -3.4 מ"מ) מברגמה למטרה (כלומר, קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית, mPFC), על פי אטלס המוח של חולדות פקסינוס ווטסון11.
      הערה: הקואורדינטות מברגמה ליעד עשויות להיות שונות בין חולדות כאשר המשקל, הגודל, המין והגזע שונים.

2. ניתוח סטריאוטקסי

התראה: יש להשתמש ב-Autoclave בכל החומרים הכירורגיים, השתלים והיחידות הסטריאוטקסיות לפני השימוש, ולחטא את אזור הניתוח כדי למנוע זיהומים וסיבוכים שעלולים להשפיע על רווחת בעלי החיים. השתמש בכפפות כירורגיות סטריליות וכסה את החיה בווילונות דביקים כדי למנוע זיהום.

  1. הכנת בעלי חיים והרדמה
    1. בעלי חיים קיבלו 0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין באופן תוך-צפקי יום לפני הניתוח. הכניסו את החיה לתא תיבת הרדמה ואטמו את החלק העליון.
    2. הפעל את מאדה sevoflurane (5% עבור אינדוקציה ב 100% O2).
    3. כאשר החולדה משכבת, כבו את מכשיר האידוי sevoflurane והוציאו את החולדה מתא הקופסה.
    4. באופן תוך-צפק יש לתת תערובת של קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) כדי להרדים את החיה.
    5. המתן עד שהחיה מורדמת לחלוטין. בדוק את רמת ההרדמה על ידי צביטה של האזור הבין-דיגיטלי.
    6. לגלח את האזור שבין האוזניים לעיניים.
  2. מיקום במסגרת הסטריאוטקטית וקרניוטומיה
    1. הניחו את בעל החיים בתנוחה נוטה על המסגרת הסטריאוטקטית והשתמשו במתאם החזקת הראש לחולדות כדי לשמור על בעל החיים בתנוחה הנכונה במהלך הניתוח.
    2. הקפידו על חוסר תנועה של הראש על ידי שימוש במוטות האוזניים של החולדה. היזהר עם החדרת מוטות האוזניים, שכן החדרה עמוקה מדי עלולה להזיק לעור התוף.
    3. החל ג'ל סיכה עיניים על העיניים כדי למנוע יובש במהלך הניתוח, ולכסות אותם עם גזה סטרילית.
    4. כסו את בעל החיים באמצעות וילונות דביקים כדי למנוע זיהום.
    5. החל פתרון יודופובידון על האזור המגולח ונקה אותו עם גזה סטרילית.
    6. יש למרוח mepivacaine בג'ל על האזור המגולח כדי להרדים את האזור המקומי.
    7. עושים חתך אורכי בעור מעל הגולגולת בין האוזניים, ומשתרעים 1.5-2 ס"מ מלמבדה לברגמה (כלומר, מהקודקוד הגולגולתי לכיוון העיניים).
    8. חשוף את הגולגולת בעזרת 2 או 3 מלחציים. הסר את periosteum עם צמר גפן ולנקות את הדם עם תמיסת מלח כדי לחשוף Bregma ואת התפרים sagittal. הסר את תמיסת מלח עודף עם גזה.
    9. לגרד את פני הגולגולת עם אזמל כדי לשפר את הידבקות מלט שיניים. נקו את האזור עם צמר גפן ספוג במי חמצן.
  3. מיקום אלקטרודות וקיבוע לגולגולת
    1. יישרו את האלקטרודות בפינצטה פלסטית כדי להבטיח מיקום נכון במהלך הניתוח.
      הערה: אלקטרודות פלטינום-אירידיום דו-קוטביות קונצנטריות עם הקרקע משמשות בפרוטוקול זה.
    2. אתר אלקטרודה אחת על מחזיק הזרוע הימנית של המסגרת הסטריאוטקטית.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את המחזיק לאלקטרודה כדי לתקן אותה טוב יותר (ראו איור 1B). ודא שהאלקטרודה מקבילה לציר המחזיק.
    3. הזיזו את הזרוע הימנית המחזיקה את האלקטרודה דרך המסגרת הסטריאוטקסית והניחו את קצה האלקטרודה בדיוק מעל ברגמה. נסו להביא את קצה האלקטרודה קרוב ככל האפשר לגולגולת אך מבלי לגעת בה כדי למנוע עיוות של האלקטרודה, ושימו לב לקואורדינטות המתקבלות עבור ברגמה המסופקות על ידי המסגרת הסטריאוטקסית. לעשות סימן על הגולגולת המציין את המיקום הראשוני של האלקטרודה עם עט כירורגי.
    4. העבר את המחזיק לקואורדינטות AP ו- ML המתקבלות בשלב 1.4.3 ועשה סימן על הגולגולת עם עט כירורגי המציין את מיקום מטרת האלקטרודה.
    5. הסר את הזרוע הימנית של המסגרת הסטריאוטקטית המחזיקה את האלקטרודה. היזהר לא לגעת בשום דבר עם האלקטרודה.
    6. השתמש במקדחה חשמלית קטנה כדי ליצור חור דרך הגולגולת (בערך 1-1.5 מ"מ קוטר) במצב המטרה עד שהדורה נראית לעין. עצור כל דימום באמצעות צמר גפן.
    7. קדחו 4 חורים לאורך הגולגולת לאיתור 4 ברגים (רצוי ברגים מנירוסטה באורך 2-3 מ"מ) להגדלת שטח הפנים של המלט הדנטלי ולאיתור הקרקע. חבר את 4 הברגים.
    8. אתר את הזרוע הימנית של המסגרת הסטריאוטקטית עם האלקטרודה הימנית. הזז את הזרוע למצב המחושב, אשר אמור לעלות בקנה אחד עם החור. לאחר מכן, הנמיכו את האלקטרודה עד שהיא נוגעת בדורה מאטר. עמדה זו תשמש כרמה 0 בכיוון DV.
    9. הכנס את קצה האלקטרודה לכיוון DV, באמצעות מיקום DV בשלב 1.4.3. נקו את הדם ואת הנוזל השדרתי סביב אזור האלקטרודה עם צמר גפן.
    10. חברו את הקרקע לאחד הברגים הקרובים ביותר לאלקטרודה.
    11. יש למרוח מלט דנטלי סביב האלקטרודה והברגים תוך הקפדה על עיצוב המלט הדנטלי תוך הימנעות מקצוות חדים, שעלולים לפגוע בבעל החיים. מלט דנטלי מוחל בשכבה למניעת התחממות יתר/פגיעה תרמית ברקמה/גולגולת. שכבות עבות דורשות יותר זמן לריפוי לפני הוספת שכבות נוספות. ודא שהמלט הדנטלי מוקשה לחלוטין לפני הסרת האלקטרודה מהמחזיק.
      אזהרה: הכנת המלט הדנטלי מייצרת פליטת אדים רעילים מהתערובת, המסתיימת בהתמצקות המלט. לכן, יש לעטות מסכת הגנה יעילה נגד גזים כימיים מנקודה זו ועד סוף הניתוח.
    12. חזור על אותו הליך משלבים 2.3.2-2.3.11 עבור ההמיספרה השנייה של המוח.
    13. יש למרוח יותר מלט דנטלי ליצירת מכסה מבלי לכסות את האלקטרודה. חכו עד שהוא יתקשה.
    14. השתמש בתפר משי טבעי קלוע שאינו נספג 1/0, עם מחט משולשת, כדי לתפור מלפנים ומאחורי הכובע. במידת הצורך, הסר את התפרים שאינם נספגים בזמן מסוים בהתאם לאזור הגוף שבו הם נמצאים. השתמש בפתרון יודופובידון לחיטוי אזור הניתוח.
    15. הסר את החולדה מהמסגרת הסטריאוטקטית.
  4. הדמיית CT לאישור מיקום אלקטרודות
    1. בצע את שלבים 1.2.4-1.2.5 וראה איור 1C.
    2. לאחר השלמת סריקת ה-in vivo CT, הכניסו את החולדה לכלוב שלה.
    3. בצע את השלבים 1.3.6. ו-1.3.7.
  5. טיפול לאחר הניתוח
    1. מתן אנטיביוטיקה (ceftriaxone, 100 מ"ג / ק"ג, תת עורית) במשך 5 ימים ומשכך כאבים (buprenorphine, 0.1 מ"ג / ק"ג, intraperitoneal) במשך 3 ימים כטיפול לאחר הניתוח. משטר אנטיביוטי זה עשוי להיות מוארך במשך 5 ימים אם כל סימני זיהום (אדמומיות, נפיחות, exudate) הם נצפו סביב הכובע.
    2. בצע בדיקה חזותית של כל בעל חיים מדי יום, מחפש סימנים של כאב או מצוקה, ולנקות את הכובע עם פתרון יודופובידון.
    3. מתן טיפול נמרץ עד שבוע לאחר הניתוח.

3. רכישת הדמיית PET/CT

הערה: כל חיה עוברת שני מחקרי PET/CT (כלומר, בהיעדר ובמהלך מתן DBS) בהרדמה בשאיפה כדי להעריך את ההשפעות החריפות הנגרמות על ידי הגירוי החשמלי. שתי הבדיקות עוקבות אחר אותו פרוטוקול רכישת הדמיה, ומבוצעות שבוע לאחר הניתוח (D1, ללא גירוי) ויומיים לאחר מכן (D2, במהלך DBS).

  1. הכנת בעלי חיים והרדמה
    1. הרץ את החולדה במשך 8-12 שעות לפני כל סריקת PET כדי לאפשר ספיגה גבוהה יותר של FDG במוח, ולשפר את יחס האות לרעש12.
    2. הכניסו את החיה לקופסת אינדוקציה להרדמה ואטמו את החלק העליון.
    3. הפעל את מאדה sevoflurane (5% עבור אינדוקציה ב 100% O2).
    4. כאשר החולדה מורדמת, החליפו את שטף הגז לאף.
  2. הזרקת FDG ותקופת ספיגה
    אזהרה: FDG הוא מכשיר רדיו-טראקר, לכן שקול אמצעי הגנה מפני רדיו כדי להימנע מחשיפה לרדיואקטיביות. אשר כי למוסד יש את כל ההרשאה לעבוד עם תרכובות רדיואקטיביות.
    1. יש לשמור את בקבוקון FDG בתוך ארון מרופד בעופרת עד לשימוש כדי למנוע חשיפה לא רצויה לרדיואקטיביות.
    2. מלא מזרק מד קטן (~27G) ב~37 MBq של תמיסת FDG בנפח הפחות אפשרי, כפי שנמדד במפעיל מטר.
    3. הניחו כרית חימום מתחת לזנב החיה או השתמשו באור אינפרא-אדום כדי להרחיב את ורידי הזנב.
    4. ברגע שהוורידים הצדדיים ניכרים בשיא הזנב, נקו את האזור באלכוהול סניטרי (96%).
    5. להזריק את תמיסת FDG דרך אחד הוורידים זנב לרוחב, מתקרב לווריד עם מזרק מקביל למסלול שלה עם השיפוע של המחט פונה כלפי מעלה.
    6. כבו את ההרדמה והחזירו את החיה לכלוב שלה כדי להתאושש לחלוטין תחת מנורת חימום.
    7. אפשר 45 דקות של קליטת radiotracer לפני תחילת הפעלת רכישת התמונה. במהלך תקופה זו, לשמור על החיה ערה בתוך תא מוגן עופרת.
    8. במקרה של מחקר D2, ספק DBS כפי שמוסבר להלן בסעיף 4 (ניהול גירוי חשמלי) במהלך תקופת ספיגת FDG.
  3. רכישה ושחזור הדמיה של PET
    הערה: מפרטי רכישת תמונות PET תלויים בסורק ובזמן הסריקה. עבור פרוטוקול זה, תמונת PET סטטית נרכשה למשך 45 דקות עם סורק PET/CT של בעלי חיים קטנים, באמצעות חלון אנרגיה של 400-700 keV 7,8,9. סקור את המפרטים של ציוד PET/CT לפני תכנון פרוטוקול הרכישה.
    1. 45 דקות לאחר הזרקת FDG, הכניסו את החיה לתיבת אינדוקציה להרדמה ואטמו את החלק העליון.
    2. הפעל את מאדה sevoflurane (5% עבור אינדוקציה ב 100% O2).
    3. מעבירים את בעל החיים למיטת PET/CT ומניחים אותו במצב שכיבה, תוך הצמדת האף לחרוט האף בהרדמה ושמירה על הרדמה סבופלורנית (3% לתחזוקה ב-100% O2). אשר את מצב ההרדמה על ידי צביטה של כף החולדה.
    4. חזור על שלבים 1.2.2 ו- 1.2.3.
    5. מקם את הראש במרכז שדה הראייה של סורק PET.
    6. רכוש את תמונת ה- PET הסטטית באמצעות פרמטרי רכישה בהתאם למפרטי הסורק.
    7. המשך לשחזר את התמונה באמצעות 2D-OSEM (אלגוריתם מקסום ציפיות תת-קבוצה מסודרת) והחל תיקוני דעיכה וזמן מת 7,8,9.
    8. לאחר השלמת סריקת ה- in vivo PET, שמור על זרימת ה- sevoflurane לחולדה על מנת להמשיך לאחר מכן לרכישת ה- CT מבלי לעקור את מיקום הראש של החיה על מיטת הסורק.
  4. רכישת CT
    1. מבלי לשנות את עמדת בעל החיים ביחס לרכישה הקודמת של PET, המשך לרכוש את תמונת ה- CT.
    2. חזור על שלבים 1.2.3-1.2.5.
    3. לאחר השלמת סריקת ה-in vivo CT, עצרו את זרימת ה-sevoflurane והכניסו את החולדה לכלוב המתאים לה לצורך התאוששות.
    4. בצע את השלבים 1.3.6. ו-1.3.7.
    5. החזיקו את החיה בתא מוגן עופרת עד לריקבון רדיואקטיבי מוחלט.

4. ניהול גירוי חשמלי

הערה: גירוי חשמלי מועבר במהלך תקופת ספיגת FDG בפגישת ההדמיה D2. עבור פרוטוקול זה, הגירוי הועבר עם מגרה מבודד, עם גירוי חשמלי בתדר גבוה (130 הרץ) במצב זרם קבוע, 150 μA, ורוחב פולס של 100 μs 7,13,14.

  1. תצורת מגרה DBS
    1. הכינו את הגירוי המבודד ואת החוטים הנדרשים בחדר רחב ושקט, עם מספיק מקום לכלובים של בעלי החיים והשפעה מינימלית של גירויים שעלולים להטריד.
    2. חבר את חוטי הגירוי לסיבובים כדי לאפשר לבעלי חיים לנוע בחופשיות בתוך הכלובים שלהם ולמגרה.
    3. הגדר את פרמטרי הגירוי בהתאם לצרכי המחקר.
    4. השתמש באוסצילוסקופ כדי לבדוק את המצב הנוכחי, התדר ורוחב הפולס. אשרו את צורת הגל הדו-פאזית עם צורת פולס מלבנית (איור 1D).
  2. משלוח DBS
    1. לאחר סשן ההדמיה של D1 ועד לרכישת D2, יש להכפיף את בעלי החיים לפרוטוקול הרגלה יומי (45 דקות ביום) כדי להרגיל אותם למערכת הגירוי ולטיפול המפעיל, תוך הימנעות מתגובות לחץ לא רצויות ב-D2. חבר את מערכת הגירוי לכל חיה, אך מבלי להפעיל את הגירוי.
    2. לאחר הגדרת הממריץ, והחיה הוזרקה עם FDG, חבר את הסיבוב לאלקטרודות והפעל את הממריץ.
    3. לאחר 45 דקות, כבה את הממריץ, נתק את החיה מהסיבוב והעבר אותה במהירות לתא אינדוקציה להרדמה כדי להתחיל בשלב 3.3.

figure-protocol-1
איור 1: תכנון ניסוי . (א) סיכום שלבי הניסוי הבאים בפרוטוקול זה. (B) תמונות מייצגות של התאמת מחזיק לקיבוע טוב יותר של האלקטרודה, עם (משמאל) ובלי (מימין) אלקטרודה. (C) תמונה מתמזגת של MRI עם CT של חיה המופעלת, המראה את מיקום האלקטרודה הנכון בקליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית (mPFC). (D) צילום מסך של מסך האוסצילוסקופ המציג את צורת הגל של הגירוי הדו-פאזי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

5. עיבוד וניתוח תמונה PET

הערה: בצע את אותו עיבוד תמונה בתמונות מ- D1 ו- D2 כדי לקבל נתונים דומים לניתוח סטטיסטי נוסף של ווקסל.

  1. רישום מרחבי של תמונות PET
    1. השתמש בתוכנת עיבוד הדמיה מיוחדת. כל זרימת העבודה של הרישום מתוארת באיור 2.
    2. מרכוז וחתוך כל תמונת PET ו- CT לשדה הראייה. רשום את תמונת ה- PET ל- CT שלה באמצעות אלגוריתם רישום קשיח אוטומטי המבוסס על מידע הדדי15.
      הערה: שיטות רישום נוקשות מתאימות רק אם אין הבדלים משמעותיים במשקל הגוף או בגודל בין בעלי החיים. אחרת, שקול להשתמש בשיטות אלסטיות.
    3. רשום כל תמונת CT ל- CT ייחוס הרשום מרחבית לאטלס המוח של חולדות פקסינוס ווטסון11 כמו בשלב 5.1.2. שמור את פרמטרי השינוי שהתקבלו.
    4. החל את פרמטרי ההמרה שהתקבלו בשלב 5.1.3. לכל תמונת PET רשומה המקבלת את תמונת ה- PET הרשומה לתמונת ה- CT המייחסת.
    5. שמור את כל תמונות ה- PET הסופיות בפורמט Nifti.
  2. נורמליזציה והחלקה בעוצמה של תמונות PET
    הערה: נורמליזציה והחלקה של עוצמה מבוצעות עם סקריפטים פנימיים שונים המבוססים על משאבים הזמינים לציבור.
    1. החלק את תמונות ה- PET עם גרעין גאוס איזוטרופי של 2 מ"מ בחצי רוחב מלא (FWHM) כדי לתקן שגיאות רישום אפשריות.
      הערה: גודל מסנן ההחלקה יהיה תלוי ברזולוציה של רכישת PET, אך מומלץ להשתמש במסנן של פי 2-3 מגודל הווקסל של FWHM.
    2. נרמל את עוצמת ערכי הווקסל של PET באמצעות שיטת נורמליזציה מתאימה של אשכול ייחוס16.
    3. פלח מסכת מוח מ- MRI ייחוס הרשום בתמונת ה- CT הייחוס.
    4. החל את מסכת המוח על כל תמונת PET כדי להוציא ווקסלים מחוץ למוח מהניתוח מבחינת ווקסל.
  3. ניתוח חכם של ווקסל
    הערה: הניתוח הסטטיסטי, המורכב מניתוח חכם של נתוני התמונה של PET, בוצע באמצעות תוכנת ניתוח הדמיה מיוחדת17.
    1. השווה בין תמונות D1 ו- D2 PET באמצעות מבחן T זוגי, תוך הגדרת ערכי סף משמעותיים סטטיסטית נאותים.
    2. שקול כתוצאות סופיות של הניתוח רק את האשכולות הגדולים מ-50 ווקסלים סמוכים כדי להפחית שגיאות מסוג I.
    3. מייצגים את התוצאות במפות T על גבי MRI T2, ומראים את השינויים בחילוף החומרים של גלוקוז במוח המושרים על-ידי DBS (צבעים קרים להפחתת FDG וצבעים חמים לתוספת FDG).

figure-protocol-2
איור 2: זרימת עבודה של רישום הדמיה של מיקרו PET/CT. שלבים מפורטים של עיבוד נורמליזציה מרחבית של תמונת PET לניתוח נוסף מבחינת ווקסל עם תוכנת מיפוי פרמטרי סטטיסטי (SPM). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעלי החיים הוקרבו באמצעות CO2 בסוף המחקר או כאשר רווחת החיה נפגעה. דוגמה למחקר PET/CT מלא מבעל חיים שהופעל מוצגת באיור 3. לפיכך, ניתן לראות בבירור את האלקטרודה המוחדרת למוח החולדה בתמונת ה-CT המוצגת באיור 3A. שיטת הדמיה זו מספקת מידע אנטומי טוב ומקלה על הרישום של תמונות FDG-PET, בהתחשב בכך ששיטות פונקציונליות נוטות להיות מטושטשות יותר מתמונות מבניות (איורים 3A,B). בנוסף, תמונה ממוזגת של תמונות FDG-PET ו-C...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בהתחשב בהתקדמות בהבנת תפקוד המוח והרשתות העצביות המעורבות בפתופיזיולוגיה של הפרעות נוירופסיכיאטריות, יותר ויותר מחקרים מזהים את הפוטנציאל של DBS במגוון רחב של פתולוגיות מבוססות נוירולוגיה2. עם זאת, מנגנון הפעולה של טיפול זה עדיין לא ברור. מספר תיאוריות ניסו להסביר את ההשפעות המתקבלות בנסיבות פתולוגיות וגירוי ספציפיות, אך ההטרוגניות של המחקרים המוצעים מקשה מאוד להגיע למסקנות סופיות4. לכן, למרות מאמצים גדולים, אין קונצנזוס אמיתי, אך מספר החולים העוברים התערבות DBS ממשיך לגדול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים בקשר למאמר זה.

תודות

אנו מודים לפרופ' כריסטין וינטר, ג'וליה קליין, אלכסנדרה דה פרנסיסקו ויולנדה סיירה על תמיכתן שלא תסולא בפז באופטימיזציה של המתודולוגיה המתוארת כאן. ה-MLS נתמך על ידי המיניסטריו דה סיינסיה א אינובאסיון, מכון סאלוד קרלוס השלישי (מספר פרויקט PI17/01766 ומספר מענק BA21/0030) במימון משותף של הקרן האירופית לפיתוח אזורי (ERDF), "דרך להפוך את אירופה"; CIBERSAM (מספר פרויקט CB07/09/0031); Delegación del Gobierno para el Plan Nacional sobre Drogas (project number 2017/085); Fundación Mapfre; ופונדאסיון אלישיה קופלוביץ.  MCV נתמך על ידי Fundación טטיאנה פרז דה גוזמן אל בואנו כבעלת מלגה של מוסד זה, והתוכנית המשותפת של האיחוד האירופי - מחקר מחלות נוירודגנרטיביות (JPND). DRM נתמך על ידי Consejería de Educación e Investigación, Comunidad de Madrid, במימון משותף של הקרן החברתית האירופית "השקעה בעתיד שלך" (מענק מספר PEJD-2018-PRE/BMD-7899). NLR נתמך על ידי המכון להשקעות סניטריה גרגוריו מאראניון, "Programa Intramural de Impulso a la I+D+I 2019". עבודת MD נתמכה על ידי מיניסטריו דה סינסיה א אינובאסיון (MCIN) ומכון סאלוד קרלוס השלישי (ISCIII) (PT20/00044). ה- CNIC נתמך על ידי מכון סאלוד קרלוס השלישי (ISCIII), המיניסטריו דה סינסיה א אינובאסיון (MCIN) וקרן Pro CNIC, והוא מרכז מצוינות של סברו אוצ'ואה (SEV-2015-0505).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סורק 7-Tesla Biospec 70/20ברוקר, גרמניהSN0021סורק MRI להדמיית בעלי חיים קטנים
BetadineMeda Pharma SL, ספרד644625.6תמיסת יוד (יודופובידון)
Beurer IL 11BeurerSN87318אור אינפרא אדום
כבל דו קוטבי 50 ס"מ עם רשת 50 ס"מ המכסה עד 100 ס"מפלסטיק One, ארה"ב305-305 (ס"מ)
כבל דו קוטבי TT2  50 ס"מ עד 100 ס"מPlastics One, ארה"ב305-340/2כבל דו קוטבי TT2  50 ס"מ עד 100 ס"מ
BuprexSchering-Plough, S.A961425 בופרנורפין (משכך כאבים)
Ceftriaxona Reig Jofré מעבדת IM 1gReig Jofré SA, ספרד624239.1Ceftriaxone (אנטיביוטיקה)
קומוטטורפלסטיק אחד, ארה"בSL2+2C4 ערוצים קומוטטור עבור DBS
אלקטרודות פלטינה-אירידיום דו-קוטביות קונצנטריותפלסטיק אחד, ארה"בMS303/8-AIU/Spcאלקטרודות למקדח DBS
BoshT58704מקדח
FDGCurium Pharma ספרד S.A., ספרד-----2-[18F] fluoro-2-deoxy-D-glucose (PET radiotracer)
כרית חימוםDAGA, ספרד23115כרית חימום
KetolarPfizer SL, ספרד776211.9קטמין (תרופת הרדמה)
ליפולזי 2 מ"ג/גרםבאוש & Lomb SA, ספרד65277ג'ל סיכה
MatLab R2021aתוכנת התמיכה של MathWorks, Inc
MRIcroMcCausland Center for Brain Imaging,  אוניברסיטת דרום קרוליינה, ארה"בv2.1.58-0תוכנה לעיבוד מקדים וניתוח הדמיה
תחנת עבודה רב-מודאלית (MMWKS)BiiG, ספרדתוכנה לעיבוד וניתוח הדמיה
Omicrom VISION VETRGB מכשירים רפואיים, ספרד731100 ReV Bמוניטור קרדיו-נשימתי להדמיה קטנה
Prevex ניצני כותנה Prevex, פינלנד-----ניצני כותנה
SevoraneAbbVie Spain, S.L.U, ספרד673186.4Sevoflurane (הרדמה אינהלצית)
ברגים קטניםMax Witte GmbH1,2 x 2 DIN 84 A2ברגים קטנים
סטריאוטקסי סטנדרטי עם מסגרת U לחולדה, 18° Ear BarHarvard Device, ארה"ב75-1801מסגרת סטריאוטקטית דו-זרועית למיפוי
פרמטרי סטטיסטי של חולדות (SPM12)מרכז וולקאם להדמיה מוחית אנושית, UCL Queen Square Institute of Neurology, בריטניהSPM12תוכנה לניתוח הדמיה חכמה ווקסל
STG1004Multi Channel Systems GmbH, גרמניהSTG1004ממריץ מבודד
סורק SuperArgus PET/CTSedecal, ספרדS0026403סורק NanoPET/CT להדמיית בעלי חיים קטנים
חוט תפר עם מחט, 1/ºלורקה מאר&יאקוטה; n S.A., ספרד55325תפר משי טבעי קלוע שאינו נספג 1/0, עם מחט משולש
Technovit 4004 (אבקה ונוזל)טכניקת קולצר, גרמניה64708471; 64708474צמנט דנטלי אקרילי לברז קרניוטומיה
חולדות Wistar (Rattus norvergicus)נהר צ'ארלס, ספרדמתקן בעלי חייםמודל בעלי חיים בשימוש
XylagesicLaboratorios Karizoo, A.A, ספרד572599-4קסילזין (תרופת הרדמה)
נורמון ס.א., ספרד602910Mepivacaine בג'ל לשימוש מקומי
עיניים עבור SPM12 מכשיר

מקורות

  1. Gildenberg, P. L. Neuromodulation: A historical perspective. Neuromodulation. 1, 9-20 (2009).
  2. Lee, D. J., Lozano, C. S., Dallapiazza, R. F., Lozano, A. M. Current and future directions of deep brain stimulation for neurological and psychiatric disorders. Journal of Neurosurgery. 131 (2), 333-342 (2019).
  3. Casquero-Veiga, M. Preclinical molecular neuroimaging in deep brain stimulation. Complutense University of Madrid. , Faculty of Medicine, Department of Pharmacology (2021).
  4. Blaha, C. D. Theories of deep brain stimulation mechanisms. Deep Brain Stimulation: Indictions and Applications. , Jenny Stanford Publishing. New York. 314-338 (2016).
  5. Fins, J. J. Deep brain stimulation: Ethical issues in clinical practice and neurosurgical research. Neuromodulation. 1, 81-91 (2009).
  6. Desmoulin-Canselier, S., Moutaud, B. Animal models and animal experimentation in the development of deep brain stimulation: From a specific controversy to a multidimensional debate. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 51(2019).
  7. Casquero-Veiga, M., Hadar, R., Pascau, J., Winter, C., Desco, M., Soto-Montenegro, M. L. Response to deep brain stimulation in three brain targets with implications in mental disorders: A PET study in rats. PLOS One. 11 (12), 0168689(2016).
  8. Casquero-Veiga, M., García-García, D., Desco, M., Soto-Montenegro, M. L. Understanding deep brain stimulation: In vivo metabolic consequences of the electrode insertional effect. BioMed Research International. 2018, 1-6 (2018).
  9. Casquero-Veiga, M., García-García, D., Pascau, J., Desco, M., Soto-Montenegro, M. L. Stimulating the nucleus accumbens in obesity: A positron emission tomography study after deep brain stimulation in a rodent model. PLOS One. 13 (9), 0204740(2018).
  10. Pascau, J., Vaquero, J. J., Abella, M., Cacho, R., Lage, E., Desco, M. Multimodality workstation for small animal image visualization and analysis. Scientific Papers. Molecular Imaging and Biology. 8, 97-98 (2006).
  11. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. Sydney. (1998).
  12. Roy, M., et al. A dual tracer PET-MRI protocol for the quantitative measure of regional brain energy substrates uptake in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (82), e50761(2013).
  13. Klein, J., et al. A novel approach to investigate neuronal network activity patterns affected by deep brain stimulation in rats. Journal of Psychiatric Research. 45 (7), 927-930 (2011).
  14. Soto-Montenegro, M. L., Pascau, J., Desco, M. Response to deep brain stimulation in the lateral hypothalamic area in a rat model of obesity: In vivo assessment of brain glucose metabolism. Molecular Imaging and Biology. , 830-837 (2014).
  15. Pascau, J., et al. Automated method for small-animal PET image registration with intrinsic validation. Molecular Imaging and Biology. 11 (2), 107-113 (2009).
  16. Andersson, J. L. R. How to estimate global activity independent of changes in local activity. Neuroimage. 244 (60), 237-244 (1997).
  17. Wellcome Trust Centre for Neuroimaging SPM12-Statitstical Parametric Mapping. , Available from: https://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/software/spm12/ (2022).
  18. Lozano, A. M., et al. Deep brain stimulation: current challenges and future directions. Nature Reviews Neurology. 15 (3), (2019).
  19. Boecker, H., Drzezga, A. A perspective on the future role of brain pet imaging in exercise science. NeuroImage. 131, (2016).
  20. Sprengers, M., et al. Deep brain stimulation reduces evoked potentials with a dual time course in freely moving rats: Potential neurophysiological basis for intermittent as an alternative to continuous stimulation. Epilepsia. 61 (5), 903-913 (2020).
  21. Middlebrooks, E. H., et al. Acute brain activation patterns of high- versus low-frequency stimulation of the anterior nucleus of the thalamus during deep brain stimulation for epilepsy. Neurosurgery. 89 (5), 901-908 (2021).
  22. Ashkan, K., Rogers, P., Bergman, H., Ughratdar, I. Insights into the mechanisms of deep brain stimulation. Nature Reviews Neurology. 13 (9), 548-554 (2017).
  23. Williams, N. R., Taylor, J. J., Lamb, K., Hanlon, C. A., Short, E. B., George, M. S. Role of functional imaging in the development and refinement of invasive neuromodulation for psychiatric disorders. World Journal of Radiology. 6 (10), 756-778 (2014).
  24. Rodman, A. M., Dougherty, D. D. Nuclear medicine in neuromodulation. Neuromodulation in Psychiatry. , John Wiley & Sons. West Sussex, UK. 81-99 (2016).
  25. Albaugh, D. L., Shih, Y. -Y. I. Neural circuit modulation during deep brain stimulation at the subthalamic nucleus for Parkinson's disease: what have we learned from neuroimaging studies. Brain Connectivity. 4 (1), 1-14 (2014).
  26. Mayberg, H. S., et al. Reciprocal limbic-cortical function and negative mood: Converging PET findings in depression and normal sadness. Neurology, and Radiology. 156 (5), 675-682 (1999).
  27. Kennedy, S. H., et al. Differences in brain glucose metabolism between responders to CBT and Venlafaxine in a 16-week randomized controlled trial. American Journal of Psychiatry. 164 (5), 778-788 (2007).
  28. Kennedy, S. H., et al. Changes in regional brain glucose metabolism measured with positron emission tomography after paroxetine treatment of major depression. American Journal of Psychiatry. 158 (6), 899-905 (2001).
  29. Brown, E. C., Clark, D. L., Forkert, N. D., Molnar, C. P., Kiss, Z. H. T., Ramasubbu, R. Metabolic activity in subcallosal cingulate predicts response to deep brain stimulation for depression. Neuropsychopharmacology. 45, 1681-1688 (2020).
  30. Klooster, D. C. W., et al. Technical aspects of neurostimulation: Focus on equipment, electric field modeling, and stimulation protocols. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 65, 113-141 (2016).
  31. Kasoff, W., Gross, R. E. Deep brain stimulation: Introduction and Technical Aspects. Neuromodulation in Psychiatry. , John Wiley & Sons. West Sussex, UK. 245-275 (2016).
  32. Perez-Caballero, L., et al. Early responses to deep brain stimulation in depression are modulated by anti-inflammatory drugs. Molecular Psychiatry. 19, 607-614 (2014).
  33. Solera Ruiz, I., UñaOrejón, R., Valero, I., Laroche, F. Craniotomy in the conscious patient. Considerations in special situations. Spanish Journal of Anesthesiology and Resuscitation. 60 (7), 392-398 (2013).
  34. Casali, M., et al. State of the art of 18F-FDG PET/CT application in inflammation and infection: a guide for image acquisition and interpretation. Clinical and Translational Imaging. 9 (4), 299-339 (2021).
  35. Gonzalez-Escamilla, G., Muthuraman, M., Ciolac, D., Coenen, V. A., Schnitzler, A., Groppa, S. Neuroimaging and electrophysiology meet invasive neurostimulation for causal interrogations and modulations of brain states. NeuroImage. 220, 117144(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דימות FDG-PETמטבוליזם מוחיניתוח סטריאוטקטיקליפת המוח הפרה-פרונטליתהשתלת אלקטרודותפעילות רשת עצביתדימות מוח של חולדהניתוח מבוסס ווקסלים
In vivo טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים לחשיפת דפוסי פעילות המושרים על ידי גירוי מוחי עמוק בחולדות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.