הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בזמן אמת, שני צבעים מגורה Raman פיזור הדמיה של מוח עכבר לאבחון רקמות

3.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63484

⸱

1 בפברואר 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Washington

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) היא טכניקת הדמיה עוצמתית, לא פולשנית ונטולת תוויות. יישום מתפתח אחד הוא היסטולוגיה של ראמאן, שבה הדמיית SRS בשני צבעים במעברי החלבון והשומנים ראמאן משמשת ליצירת תמונות פסאודו-המטוקסילין ואוזין. כאן אנו מדגימים פרוטוקול להדמיית SRS בשני צבעים בזמן אמת לאבחון רקמות.

תקציר

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) התגלתה כטכניקת הדמיה אופטית רבת עוצמה לאבחון רקמות. בשנים האחרונות, הוכח כי SRS בשני צבעים מסוגל לספק תמונות שוות ערך להמטוקסילין ו-eosin (H&E) המאפשרות אבחון מהיר ואמין של סרטן המוח. יכולת כזו אפשרה יישומים מרגשים לאבחון סרטן תוך ניתוחי. הדמיית SRS בשני צבעים של רקמה יכולה להיעשות עם מקור לייזר פיקוז-שניות או פמטו-שניות. לייזרי Femtosecond נהנים מהיתרון בכך שהם מאפשרים מצבי הדמיה גמישים, כולל הדמיה היפרספקטרלית מהירה והדמיית SRS דו-צבעית בזמן אמת. גישה של מיקוד ספקטרלי עם פולסי לייזר מצייצים משמשת בדרך כלל עם לייזרים פמטו-שניות כדי להשיג רזולוציה ספקטרלית גבוהה.

ניתן לממש רכישת SRS בשני צבעים באמצעות אפנון אורתוגונלי וזיהוי נעילה. המורכבות של ציוץ דופק, אפנון ואפיון היא צוואר בקבוק לאימוץ נרחב של שיטה זו. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט כדי להדגים את היישום והאופטימיזציה של SRS המתמקד בספקטרלי והדמיה בזמן אמת בשני צבעים של רקמת המוח של העכבר במצב epi-mode. פרוטוקול זה יכול לשמש למגוון רחב של יישומי הדמיית SRS הממנפים את המהירות הגבוהה ואת יכולת ההדמיה הספקטרוסקופית של SRS.

מבוא

אבחון רקמות מסורתי מסתמך על פרוטוקולי צביעה ולאחר מכן בדיקה תחת מיקרוסקופ אופטי. אחת משיטות ההכתמה הנפוצות בהן משתמשים פתולוגים היא צביעת H&E: המטוקסילין מכתים גרעיני תאים בכחול ארגמני, ואוזין מכתים את המטריצה החוץ-תאית ואת הציטופלסמה בוורוד. צביעה פשוטה זו נותרה תקן הזהב בפתולוגיה עבור משימות רבות של אבחנות רקמות, במיוחד אבחון סרטן. עם זאת, להיסטופתולוגיה של H&E, במיוחד לטכניקת החתך הקפואה המשמשת במסגרת תוך ניתוחית, עדיין יש מגבלות. הליך ההכתמה הוא תהליך מייגע הכולל הטבעת רקמות, חתך, קיבוע וכתם1. זמן ההסבה הטיפוסי הוא 20 דקות או יותר. ביצוע H&E במהלך חתך קפוא יכול לפעמים להפוך למאתגר יותר כאשר מקטעים מרובים מעובדים בבת אחת בשל הצורך להעריך תכונות תאיות או דפוסי גדילה בתלת-ממד לצורך הערכת שוליים. יתר על כן, טכניקות היסטולוגיות תוך ניתוחיות דורשות טכנאים וקלינאים מיומנים. הגבלה במספר הפתולוגים המוסמכים בבתי חולים רבים היא אילוץ להתייעצות תוך ניתוחית במקרים רבים. ניתן להקל על מגבלות כאלה עם תחומי העניין המתפתחים במהירות בפתולוגיה דיגיטלית ובאבחון מבוסס בינה מלאכותית2. עם זאת, תוצאות צביעת H&E משתנות, בהתאם לניסיון של הטכנאי, מה שמציב אתגרים נוספים לאבחון מבוסס מחשב2.

ניתן להתמודד עם אתגרים אלה באמצעות טכניקות הדמיה אופטית ללא תוויות. טכניקה אחת כזו היא מיקרוסקופיית SRS. SRS משתמש בלייזרים מסונכרנים עם פולסים – משאבה וסטוקס – כדי לעורר תנודות מולקולריות ביעילות גבוהה3. דיווחים אחרונים הראו כי הדמיית SRS של חלבונים ושומנים יכולה ליצור תמונות שוות ערך ל-H&E (הידועות גם בשם היסטולוגיה של ראמאן מגורה או SRH) עם רקמה טרייה שלמה, אשר עוקפת את הצורך בכל עיבוד רקמות, מקצרת באופן משמעותי את הזמן הדרוש לאבחון, והותאמה תוך ניתוחית4. יתר על כן, הדמיית SRS יכולה לספק תמונות תלת מימד, מה שמציע מידע נוסף לאבחון כאשר תמונות דו-ממדיות אינן מספיקות5. SRH אינו משוחד ומייצר תמונות דיגיטליות הזמינות בקלות לאבחון מבוסס מחשב. הוא מתגלה במהירות כפתרון אפשרי לאבחון סרטן תוך ניתוחי ולניתוח שולי גידול, במיוחד בסרטן המוח 6,7,8. לאחרונה, הדמיית SRS של שינויים כימיים של רקמות הוצעה גם כדי לספק מידע אבחוני שימושי שיכול לעזור עוד יותר לקלינאים לריבוד סוגי סרטן שונים או שלבים9.

למרות הפוטנציאל העצום שלה ביישומי אבחון רקמות, הדמיית SRS מוגבלת בעיקר למעבדות אקדמיות המתמחות באופטיקה בשל המורכבות הקשורה לפלטפורמת ההדמיה, הכוללת לייזרים מהירים במיוחד, מיקרוסקופ סריקת לייזר ואלקטרוניקה מתוחכמת לזיהוי. פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה מפורטת להדגמת השימוש במקור לייזר femtosecond נפוץ להדמיית SRS דו-צבעית בזמן אמת וליצירת תמונות פסאודו-H&E מרקמת המוח של עכבר. הפרוטוקול יכסה את ההליכים הבאים:

יישור ואופטימיזציה של ציוץ
רוב תוכניות ההדמיה של SRS משתמשות בלייזרים פיקוז-שניות או פמטו-שניות כמקור העירור. עם לייזרים femtosecond, רוחב הפס של הלייזר הוא הרבה יותר גדול מאשר קו Raman. כדי להתגבר על מגבלה זו, נעשה שימוש בגישת מיקוד ספקטרלי כדי לצייץ את לייזרי הפמטו-שניות לציר את ציר הזמן של פיקוז-שניות כדי להשיג רזולוציה ספקטרלית צרה10. רזולוציה ספקטרלית אופטימלית מושגת רק כאשר הציוץ הזמני (הידוע גם בשם פיזור השהיית הקבוצה או סתם פיזור) מותאם כראוי למשאבה וללייזרים של סטוקס. הליך היישור והצעדים הדרושים כדי לייעל את פיזור קרני הלייזר באמצעות מוטות זכוכית בעלי פיזור גבוה מודגמים כאן.

כיול תדרים
יתרון של מיקוד ספקטרלי SRS הוא שניתן לכוונן במהירות את עירור הראמן על ידי שינוי השהיית הזמן בין המשאבה ללייזרים של סטוקס. כוונון כזה מאפשר הדמיה מהירה ורכישה ספקטרלית אמינה בהשוואה לכוונון אורכי גל לייזר. עם זאת, הקשר הליניארי בין תדירות העירור לעיכוב בזמן דורש כיול חיצוני. ממיסים אורגניים עם פסגות ראמאן ידועות משמשים לכיול תדר ראמאן למיקוד ספקטרלי SRS.

הדמיה בזמן אמת, בשני צבעים
חשוב להגביר את מהירות ההדמיה ביישומי אבחון רקמות כדי לקצר את הזמן הדרוש לניתוח דגימות רקמות גדולות. הדמיית SRS דו-צבעית סימולטנית של שומנים וחלבונים מייתרת את הצורך לכוונן את הלייזר או את השהיית הזמן, מה שמגדיל את מהירות ההדמיה ביותר מפי שניים. זה מושג על ידי שימוש בטכניקת אפנון אורתוגונלית חדשנית ודמודולציה דו-ערוצית עם מגבר נעילה11. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לאפנון אורתוגונלי ולרכישת תמונה דו-ערוצית.

דימות SRS במצב אפי
רוב הדמיית ה-SRS המוצגת עד כה מבוצעת במצב שידור. הדמיה במצב אפי מזהה פוטונים מרוסקים מרקמות12. עבור יישומים פתולוגיים, דגימות כירורגיות יכול להיות גדול למדי. עבור הדמיה במצב שידור, חתך רקמות הוא לעתים קרובות הכרחי, אשר באופן בלתי רצוי דורש זמן נוסף. לעומת זאת, הדמיה במצב אפי יכולה לעבוד עם דגימות כירורגיות שלמות. מכיוון שאותה מטרה משמשת לאיסוף אור מרוסק לאחור, אין גם צורך ביישור מעבה בעל צמצם מספרי גבוה הנדרש להדמיית שידור. מצב אפי הוא גם האפשרות היחידה כאשר חיתוך רקמות קשה, כגון עם עצם. בעבר הוכחנו כי עבור רקמת המוח, הדמיה במצב אפי מציעה איכות הדמיה מעולה לעובי הרקמה > 2 מ"מ13. פרוטוקול זה משתמש במפצל קרן מקטב (PBS) כדי לאסוף פוטונים מפוזרים שעברו דה-פולריזציה על ידי רקמה. ניתן לאסוף יותר פוטונים עם גלאי טבעתי על חשבון המורכבות של הרכבה מותאמת אישית של גלאי12. גישת PBS פשוטה יותר ליישום (בדומה לפלואורסצנציה), כאשר הפוטודיודה הסטנדרטית כבר משמשת לזיהוי מצבי שידור.

יצירת תמונות פסאודו-H&E
לאחר איסוף תמונות SRS בשני צבעים, ניתן לצבוע אותן מחדש כדי לדמות את צביעת H&E. מאמר זה מדגים את הנוהל להמרת תמונות ליפידים וחלבון SRS לתמונות פסאודו-H&E SRS עבור יישומי פתולוגיה. פרוטוקול הניסוי מפרט שלבים קריטיים הדרושים ליצירת תמונות SRS באיכות גבוהה. ההליך המוצג כאן אינו ישים רק לאבחון רקמות, אלא גם יכול להיות מותאם ליישומי הדמיית SRS היפרספקטרליים רבים אחרים כגון הדמיית תרופות והדמיה מטבולית14,15.

דרישות מערכת כלליות
מערכת הלייזר של פרוטוקול זה חייבת להיות מסוגלת להפיק 2 קרני לייזר מסונכרנות של femtosecond. מערכות כוללות באופן אידיאלי מתנד פרמטרי אופטי (OPO) לכוונון אורכי גל רחבים של אחת מקרני הלייזר. ההתקנה בפרוטוקול זה משתמשת במערכת לייזר מסחרית Insight DS+ המפיקה שני לייזרים (קרן קבועה אחת ב-1,040 ננומטר וקרן אחת מבוססת OPO הניתנת לכוונון, הנעה בין 680 ל-1,300 ננומטר) עם קצב חזרה של 80 מגה-הרץ. מיקרוסקופים לסריקת לייזר, בין אם מיצרני מיקרוסקופים גדולים או שנבנו בבית, יכולים לשמש להדמיית SRS. המיקרוסקופ המנוצל הוא מיקרוסקופ סריקת לייזר זקוף הבנוי על גבי מסגרת מיקרוסקופ זקופה מסחרית. זוג מראות גלבו 5 מ"מ משמשות לסריקת קרן הלייזר. עבור משתמשים הבוחרים לאמץ מיקרוסקופ סריקת לייזר ביתי, עיין בפרוטוקול שפורסם בעבר לבניית מיקרוסקופ סריקת לייזר16.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים בבעלי חיים נערכו עם 200 מיקרומטר, מוחות עכברים קבועים ומחוטרים, בהתאם לפרוטוקול (# 4395-01) שאושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון (IACUC) של אוניברסיטת וושינגטון. עכברים מסוג בר (זן C57BL/6J) מורדמים באמצעות CO2. לאחר מכן, מתבצעת קרניוטומיה כדי לחלץ את מוחם לקיבוע ב-4% פרפורמלדהיד במי מלח עם מאגר פוספט. המוחות משובצים בתערובת של 3% אגרוז ו-0.3% ג'לטין ומחולקים לפרוסות בעובי 200 מיקרומטר על ידי ויברטום.

1. יישור ראשוני

הערה: ודא שגודל הקרן והסטייה של שתי הזרועות מותאמים לרגישות ולרזולוציה הטובות ביותר. רכזו את המשאבה ואת קרני הסטוקס והתאימו את הגדלים שלהן לפני שהן נכנסות למיקרוסקופ סריקת הלייזר. לשם כך, השתמש בזוג עדשות אכרומטיות עבור כל קרן לפני שילובן על המראה הדיכרואית. הרכיב תמיד משקפי לייזר מתאימים ליישור קרן.

  1. התנגשות קרן
    1. התקן זוג עדשות אכרומטיות עבור קרן המשאבה. כנקודת התחלה, השתמש בעדשת 100 מ"מ ובעדשת 200 מ"מ כדי להגדיל את גודל קרן הלייזר פי 2. ודאו שהמרחק של שתי העדשות הוא כ-300 מ"מ. יישרו את קרן המשאבה דרך מרכז שתי העדשות.
    2. הניחו מראה אחרי העדשה השנייה כדי לשלוח את הקורה לכיוון הקיר (במרחק של >1 מ'). היזהר בעת שליחת הקרן למרחקים ארוכים. עקבו אחר הקורה מהמראה אל הקיר באמצעות כרטיס IR ובדקו אם הקרן משתנה בגודלה. רכז את הקרן אם הקרן משתנה בגודלה כפונקציה של מרחק.
      1. אם הקרן מתכנסת (הקטנת גודלה עם התפשטות), הזיזו את שתי העדשות קרוב יותר.
      2. אם הקרן מתפצלת (מגדילה את הגודל עם ההתפשטות), הרחיקו את שתי העדשות זו מזו. התאם את המרחק עד להתנגשות הקרן.
    3. חזור על שלבים 1.1.1 ו- 1.1.2 עבור קרן סטוקס כדי לרכז את הקורה.
  2. התאמת גודל הקרן
    1. אם פרופיל קרן זמין, מדוד את גודל הקרן המתנגשת עבור כל קרן. לחלופין, הערך את גודל הקרן באמצעות כרטיס IR וסרגל כדי לקבל קוטר קרן של 4-5 מ"מ.
    2. אם גודל הקרן קטן מדי או גדול מדי, שנה את זוג העדשות שבו נעשה שימוש בשלב 1.1. התאימו את זוג העדשות עד ששתי הקורות יהיו בקוטר של 4-5 מ"מ.
      הערה: הגדלת הקרן היא היחס בין אורך המוקד של העדשה השנייה לעדשה הראשונה (f2/f1).
  3. חפיפה מרחבית
    הערה: הדמיית SRS דורשת ששתי קרני הלייזר ישולבו במרחב ובזמן כדי לעורר תנודות מולקולריות. שרטוט של הדמיית ה-SRS הממוקדת בספקטרלית מוצג באיור 1.
    1. שלבו את שתי קרני הלייזר על ידי התקנת מראה דיכרואית עם מספר מראות היגוי להתאמה. מטב את החפיפה המרחבית של המשאבה ושל סטוקס על ידי ניטור אלומות אחרי המראה הדיכרואית בשתי עמדות שונות רחוקות זו מזו (כ-1 מ'). כוונון איטרטיבי של מראת ההיגוי לפני המראה הדיכרואית והמראה הדיכרואית כדי ליישר את קרן סטוקס עם קרן המשאבה.
      הערה: אם שתי הקורות חופפות מרחבית בשני המיקומים, הן חופפות מספיק.
    2. ודא שהקורות המשולבות נשלחות למרכז מראות הסריקה של מיקרוסקופ סריקת הלייזר על ידי התאמת זוג מראות היגוי כאשר מראות הסריקה נמצאות במצב החונה. ודא ששתי הקורות עוברות דרך מרכז מטרת המיקרוסקופ והמעבה.
    3. לאחר המעבה, השתמש בזוג עדשות נוסף עם אורכי מוקד של 100 מ"מ ו -30 מ"מ, בהתאמה, כדי להעביר את הקרן המועברת אל הפוטודיודה. ודא ששתי הקורות נמצאות בתוך הפוטודיודה והתקין שני מסננים במעבר נמוך כדי לחסום את קרן סטוקס המאופננת.

2. זיהוי אותות SRS

  1. אפנון אלקטרואופטי (EOM)
    הערה: EOM של 20 MHz משמש לווסת את המשרעת של סטוקס. כפי שיפורט בהמשך, ה-EOM נגזר מרכבת פולס הלייזר של 80 מגה-הרץ, הנדרשת לאפנון אורתוגונלי. ניתן להשתמש בתדרי אפנון אחרים אם מבוצע רק SRS בצבע יחיד או היפרספקטרלי. במקרה כזה, סינכרון של תדר אפנון לתדר לייזר הוא מיותר. ניתן להשתמש בגנרטור תדרים עם מגבר כוח RF כדי להניע את ה- EOM. כתוצאה מכך, ניתן לדלג על שלבים 2.1.1-2.1.4.
    1. הניחו דוגם קרן בנתיב הקרן של סטוקס כדי לקלוט 10% מהקרן ושלחו אותה לפוטודיודה מהירה כדי לזהות את רכבת הדופק של 80 מגה-הרץ.
      הערה: אות הפוטודיודה נשלח למחיצת תדרים כדי ליצור פלט TTL של 20 MHz. פלט זה נשלח גם למאגר מאווררים כדי לשכפל את הפלט לארבע יציאות זהות של 20 מגה-הרץ. אחד הפלטים משמש להפעלת האוסצילוסקופ.
    2. קח את אחד הפלטים של מאגר המאווררים וסנן אותו באמצעות מסנן bandpass כדי לקבל גל סינוסואידלי של 20 מגה-הרץ. השתמש במנחת RF כדי להתאים את מתח השיא לשיא של היציאה ל~ 500 mV.
    3. שלח את הפלט המתקבל למשנה פאזה, המאפשר התאמה עדינה של פאזת ה- RF עם מקור מתח. שלח פלט זה למגבר כוח RF וחבר את הפלט של המגבר ל- EOM.
    4. בטל את החסימה של קרן סטוקס ובצע אופטימיזציה של עומק המודולציה של EOM1 על ידי הצבת פוטודיודה בנתיב הקרן. התאימו את מתח ה-EOM ואת לוחית רבע הגל עד שעומק המודולציה (יחס עמק לשיא) ייראה משביע רצון.
      הערה: במודולציה של 20 מגה-הרץ (1/4 מקצב חזרת הלייזר), צפויים שני פולסים כל 50 ns.
  2. חפיפה זמנית
    הערה: חפיפה טמפורלית של המשאבה וסטוקס מושגת על ידי עיכוב אחת משתי רכבות פולס הלייזר עם רפלקטור רטרו המורכב על שלב השהיה (איור 1 מראה את הסטוקס מתעכב). חפיפה גסה מנוטרת עם האוסצילוסקופ, וחפיפה עדינה מנוטרת על ידי אות SRS. ניתן להשיג חפיפה טמפורלית עדינה גם עם מתאם אוטומטי במידת האפשר.
    1. הניחו פוטודיודה אחרי המראה הדיכרואית כדי לזהות את קרן הלייזר. חסום תחילה את הקורה של סטוקס. התקרבו לאחת משיאי דופק המשאבה באוסצילוסקופ. מקם סמן אנכי כדי לסמן את המיקום הזמני של שיא זה עם האוסצילוסקופ.
    2. חסום את קרן המשאבה ובטל את החסימה של קרן סטוקס. תרגם את שלב ההשהיה כך שיתאים באופן זמני את מיקום השיא באוסצילוסקופ למיקום המסומן בשלב הקודם. ראו איור 2 לתצוגה של החפיפה הזמנית של שתי אלומות.
      1. (אופציונלי) אם התרגום של שלב ההשהיה אינו מספיק כדי להתאים באופן זמני לשתי הקורות, הזז את שלב ההשהיה לאמצע טווח התנועה שלו.
      2. חשב את מרחק ההשהיה הנדרש כדי להתאים לשתי האלומות על ידי לקיחת ההפרש הזמני בין שתי האלומות והכפלת ההפרש במהירות האור כדי למצוא את כמות המרחק הדרושה כדי להתאים לשתי האלומות באופן זמני.
      3. להאריך את נתיב הקרן של הקרן המהירה יותר או לקצר את נתיב הקרן של הקרן האיטית יותר כדי להתאים בערך את ההשהיה הזמנית בהתאם.
    3. הכינו דגימת שקופיות של מיקרוסקופ עם DMSO וסרט דו-צדדי כמרווח כדי להחזיק את הדגימה בין השקופית לכיסוי.
    4. הניחו את הדגימה על המיקרוסקופ כשצד הכיסוי פונה אל מטרת המיקרוסקופ. שנה את המיקרוסקופ להארת שדה בהיר והתבונן בדגימה מהעינית. מצא את המוקד של הדגימה על ידי מציאת המוקד הן בשכבה העליונה והן בשכבה התחתונה של בועות האוויר בממשק הזכוכית-סרט, ולאחר מכן הזז את המיקוד להיות בין שתי שכבות הסרט.
      הערה: ודא שקרני הלייזר חסומות לפני שתסתכל לתוך העינית.
    5. הגדר את פלט הקרן הניתן לכוונון ל- 798 ננומטר. בהתבסס על התפוקה האופטית של המעבה, התאם את ההספק האופטי כך שיהיה ~ 40 mW כל אחד עבור המשאבה ואלומות סטוקס במוקד המטרה.
    6. פתח את ScanImage ב- MATLAB (או בתוכנת סריקה אחרת השולטת במיקרוסקופ) ולחץ על הכפתור שכותרתו FOCUS כדי להתחיל בסריקה.
      הערה: קרני הלייזר ייסרקו באמצעות רסטר דרך הדגימה כדי ליצור תמונה. יציאת האות בתדר נמוך מהפוטודיודה (<100 קילוהרץ) נשלחת ישירות לערוץ 1 של כרטיס איסוף הנתונים (המכונה ערוץ DC). פלט התדר הגבוה (>100 קילוהרץ) מהפוטודיודה נשלח לתוך מגבר הנעילה, ויציאת ה- X של אות מגבר הנעילה נשלחת לערוץ 2 של כרטיס רכישת הנתונים (המכונה ערוץ AC).
    7. התאם את מראת ההיגוי לפני סורק ה-galvo כדי למרכז את אות ה-DC בצג ערוץ 1. הזז את שלב ההשהיה הממונע וצפה מקרוב בפלט הנעילה המוצג בתצוגת ערוץ 2 (כלומר, ערוץ AC).
      הערה: כאשר המשאבה וסטוקס חופפים בזמן, אות יופיע בערוץ AC. כדאי להתאים את סולם הצבעים של ערוץ AC כדי להציג את שינוי העוצמה הקטן.
    8. מקסם את עוצמת האות AC על-ידי כוונון עדין של השהיית הזמן. התאם את המראה הדיכרואית למרכז אות ה- SRS בערוץ AC (תוך שמירה על ערוץ DC ממורכז). התאם את הפאזה של מגבר הנעילה כדי למקסם את האות. ראו איור 3 עבור אות משביע רצון.

3. אופטימיזציה של רזולוציה ספקטרלית

הערה: המשאבה ואלומות סטוקס המגיעות לדגימה צריכות לכלול את אותה כמות של פיזור השהיה קבוצתית (GDD) כדי למקסם את הרזולוציה הספקטרלית. הפיזור תלוי במידה רבה במערך הניסוי. המערך הניסיוני המתואר כאן משתמש בפולסים של femtosecond ב-1,040 ננומטר ו-800 ננומטר כ-Stokes ו-pump, בהתאמה. מוטות זכוכית צור צפופים (H-ZF52A) משמשים כמדיום מתיחת הדופק.

  1. הכנס 48 ס"מ של מוט זכוכית בעל פיזור גבוה (H-ZF52A או זכוכית צור צפופה שווה ערך) לנתיב הקורה של 800 ננומטר. הערך את ה- GDD באמצעות Eq (1):
    figure-protocol-1 (1)
    הערה: GVD של חומרי זכוכית שונים באורכי גל שונים ניתן למצוא ממשאב מסד הנתונים של מקדם השבירה. לדוגמה, ל-H-ZF52A יש GVD של 220.40 fs2/mm ב-800 ננומטר. ה- GDD הכולל הוא 105792 fs2.
  2. חשב כמה ס"מ של מוט הזכוכית המפזר נדרש להוסיף לנתיב הקרן של 1,040 ננומטר כדי להתאים ל- GDD של המשאבה. הכנס את האורך המתאים של מוטות זכוכית מפוזרים לנתיב הקורה של 1,040 ננומטר כדי להתאים בערך ל- GDD של קרן 800 ננומטר. שים לב כי תוספת של מוטות זכוכית תשנה את החפיפה הטמפורלית של שתי הקורות, וייתכן שיהיה צורך בהתאמת העיכוב.
  3. כיול רזולוציה ספקטרלית
    1. הכינו דגימת שקופיות של מיקרוסקופ עם DMSO. הניחו את המגלשה על המיקרוסקופ ובדקו את עוצמת האלומות היוצאות מתוך מעבה המיקרוסקופ. התאם את ההספק בהתאם כך שיהיה ~ 40 mW כל אחד במיקוד לדוגמה.
    2. פתח את ScanImage מ- MATLAB. מצא את אות ה- SRS המרבי על ידי סריקה דרך שלב ההשהיה, המתאים לשיא 2,913 cm-1 Raman של DMSO. הערך את מיקום הבמה בהתבסס על מיקום השלב הקודם עם אורך הנתיב האופטי המוגבר עקב הכנסת מוטות. יישור מחדש את החפיפה המרחבית של הקרן בגלל הסטייה הקטנה של הקורה כאשר מוסיפים מוטות זכוכית.
    3. שמור סריקת SRS היפרספקטרלית על ידי צילום רציף של סדרה של תמונות SRS תוך כדי הזזת השלב הממונע.
      הערה: טווח סריקת ההשהיה מכסה שתי פסגות ראמאן, המקבילות לפסגות ראמאן של 2,913 ס"מ-1 ו-2,994 ס"מ-1 של DMSO, בהתאמה. שני מעברים אלה נצפים בעת שימוש במשאבה של 800 ננומטר ובלייזר סטוקס של 1,040 ננומטר.
    4. התווה את ספקטרום ה- SRS של פתרון ה- DMSO באמצעות ImageJ או MATLAB. התאם את הפסגה הגדולה של DMSO בגודל 2,913 ס"מ-1 לפונקציה גאוסית או לורנציאנית ב- MATLAB כדי לחשב את הרוחב המלא בחצי מקסימום (FWHM) של הפסגה.
      הערה: תוצאות מייצגות מוצגות באיור 4. אם קיימת רק פסגה רחבה אחת, משמעות הדבר היא שהרזולוציה הספקטרלית ירודה מכדי להבחין בין שתי הפסגות ונדרשים יותר מוטות זכוכית, או שהטווח הסרוק היה קטן מכדי לזהות את הפסגה השנייה. בדרך כלל, DMSO ברזולוציה ספקטרלית מקובלת הוא ~ 20-25 ס"מ-1 כאשר נעשה שימוש במוטות זכוכית באורך של >60 ס"מ. רזולוציה נמוכה יותר משמשת לעתים קרובות להדמיית רקמות כדי לסחור באותות גבוהים יותר עם פולסים קצרים יותר17.
  4. (אופציונלי) השתמש בקורלטור אוטומטי או ב- FROG (Gating אופטי שנפתר בתדר) כדי לקבוע את משך הפולס של כל זרוע כדי לחשב בדיוק את כמות ה- GDD ואת אורך המוטות הדרושים כדי להתאים את ה- GDD בין המשאבה לסטוקס.
  5. חזור על שלבים 3.3.2-3.3.3.4 עבור אורכי מוטות שונים בקרן סטוקס כדי למצוא את הרזולוציה הספקטרלית האופטימלית, מה שאומר שההתאמה הטובה ביותר ל- GDD נמצאה בניסוי. השתמש במספר קבוצות של מוטות זכוכית השונים באורכם כדי להשיג רזולוציה ספקטרלית אופטימלית.

4. אפיון אות לרעש (SNR)

  1. ודא ששלב 4.2 מבוצע לאחר יישור מרחבי וזמני מלא.
  2. רכשו תמונת SRS המתאימה לשיא ראמאן של DMSO בגודל 2,913 ס"מ-1 . פתחו את התמונה ב-ImageJ ובחרו אזור קטן במרכז המסגרת. השתמש בפונקציית המדידה כדי לחשב את הממוצע וסטיית התקן של ערכים באזור שנבחר.
  3. חלק את הערך הממוצע של השטח שנבחר בסטיית התקן כדי למצוא את ערך ה- SNR, כמו ב- Eq (2).
    figure-protocol-2 (2)
    הערה: SNR טוב עבור המערכת (עם קבוע זמן נעילה של 4 μs) באמצעות DMSO ב 40 mw / 40 mww במוקד עבור שתי הזרועות הוא >800. ניתן להשתמש בריכוזים נמוכים יותר של DMSO או בהספק נמוך יותר להערכה מדויקת יותר של ה- SNR אם לכרטיס רכישת הנתונים יש עומק סיביות מוגבל.
  4. אם ה-SNR נמוך מדי, התאם מחדש את פולסי הלייזר כדי למטב את החפיפה המרחבית, החפיפה הטמפורלית, התאמת גודל הקרן/ההתנגשות ו/או התאמת הפיזור. עבור מטרה עם צווארון תיקון סטייה, לייעל את האות על ידי התאמת צווארון התיקון.

5. כיול ציר התדר

הערה: שלב זה מבוצע כדי לקשר את מיקום שלב ההשהיה למעבר Raman הסרוק. בחירה זהירה של ממסים נדרשת כדי ליצור "שליט ראמאן" מתאים. DMSO הוא ממס יעיל לקשרי CH מכיוון שיש לו שתי פסגות ראמאן חדות ב-2,913 ס"מ-1 ו-2,994 ס"מ-1.

  1. שמור סריקה היפרספקטרלית עם טווח שלבי ההשהיה המכסה את פסגות ה-2,913 ס"מ-1 ו-2,994 ס"מ-1 של ה-DMSO . שמור את מיקומי הבמה המתאימים למערך הנתונים ההיפר-ספקטרלי.
    הערה: הפסגה המרבית העולמית של הספקטרום תואמת את העברת ההילוכים של DMSO 2,913 ס"מ-1 ראמאן והשיא המרבי השני מתאים להזזת DMSO 2,994 ס"מ-1 ראמאן.
  2. בצעו רגרסיה ליניארית לתנוחות הבמה והסטות ראמאן ב-2,913 ס"מ-1 ו-2,994 ס"מ-1. באמצעות משוואת הרגרסיה הליניארית הקושרת את מיקום הבמה להזזת ראמאן, המר את מיקומי ההשהיה לתדרי הראמן המתאימים.

6. אפנון אורתוגונלי והדמיה בשני צבעים

הערה: שלב המודולציה האורתוגונלית נחוץ רק כאשר יש צורך בהדמיה של שני צבעים בזמן אמת. סכמות של סכימה זו מוצגות באיור 5. המודולציה האורתוגונלית משתמשת בזוג EOMs המונעים ברבע מתדר הלייזר (20 מגה-הרץ ללייזר של 80 מגה-הרץ) עם שינוי פאזה של 90° בין השניים. ניתן לדלג על שלב אפנון אורתוגונלי זה להדמיית SRS בצבע יחיד או להדמיית SRS היפרספקטרלית.

  1. אפנון EOM1
    1. התקן PBS (PBS2), לוחית רבע גל (QWP2) ו- EOM שני (EOM2) לנתיב הקרן של סטוקס לאחר ה- EOM הראשון. נתק את כניסת האות ל- EOM2. חבר את קלט האות ל- EOM1 והפעל אותו.
    2. לווסת את קרן סטוקס (הקבועה ב-1,040 ננומטר) ב-20 מגה-הרץ (f0/4) על-ידי שליחת הקרן דרך ה-EOM הראשון. התאם את ההטיה והמיקום של EOM1 כדי להבטיח שהקרן פוגעת ישר ומרוכזת דרך גביש EOM.
    3. עקוב אחר עומק המודולציה על ידי התבוננות בשני הקיטובים היוצאים מ- PBS1 עם שני פוטודיודים והצגת המודולציה על אוסצילוסקופ.
    4. התאם את ה- QWP1, מתח EOM1 והפאזה של הכניסה של 20 MHz (באמצעות מעביר פאזה) כדי למטב את עומק המודולציה של הקרן המועברת כך שיהיה קרוב ל- 100%. ראו איור 2B להמחשה של עומק אפנון טוב.
  2. אפנון EOM2
    1. נתק את EOM1 וחבר את EOM2.
    2. שלח את יציאת המתח הגבוה של המגבר השני ב-20 מגה-הרץ ל-EOM2. התאם את ההטיה והמיקום של EOM2 כדי להבטיח שהקרן פוגעת ישר ומרוכזת דרך גביש EOM.
    3. שוב, עקוב אחר עומק המודולציה על ידי התבוננות בשני הקיטובים היוצאים מ- PBS2 באמצעות אוסצילוסקופ. התאם את QWP2, מתח EOM2 ומעביר הפאזה לפי הצורך כדי להשיג אפנון קרוב ל-100% עבור שני הקיטובים.
    4. ודא שלמודולציית רכבת הדופק יש שינוי פאזה של 90° מהמודולציה הראשונה.
      הערה: אם שתי רכבות הדופק של המשאבה אינן אורתוגונליות של 90°, הצלבה בין שני הערוצים תהיה בעיה.
    5. בדוק את האורתוגונליות של המודולציה על ידי הפעלה וחיבור של EOM1 ו- EOM2. עקוב אחר שני הקיטובים המתפצלים על ידי PBS2 באמצעות אוסצילוסקופ. השתמשו מחדש ב-EOM1 וב-EOM2 בנפרד אם רכבת הדופק אחרי ה-PBS השני אינה דומה לאיור 2C.
    6. התקן גביש קוורץ דו-פרצופי של 20 מ"מ (BRC) ו- HWP במורד הזרם של EOM2. חברו את שני ה-EOMs בבת אחת ועקבו אחר רכבת הדופק כך שהיא תדמה לאיור 2D.
      הערה: עבור הציוץ ששימש בניסוי זה, 20 מ"מ BRC גורם לעיכוב זמן המתאים להסטת ראמאן של 80 ס"מ-1 . ייתכן שיהיה צורך באורך BRC שונה אם נעשה שימוש בציוץ אחר.
  3. כיול
    1. כיול המערכת באמצעות DMSO על ידי זיהוי אותות מיציאת ערוץ הנעילה X ו- Y (נשלח לערוצים 2 ו-3 של כרטיס רכישת הנתונים).
    2. בדוק אם האותות הנוצרים על ידי שיא 2,913 ס"מ-1 מהקיטוב המהיר יותר וכי מהקיטוב האיטי יותר קרובים ל-90° מחוץ לפאזה במגבר הנעילה. אם זה לא המקרה, התאם את יישור ה- EOM עד ששני האותות קרובים ל- 90° מחוץ לפאזה.
    3. לאחר השלמת הכיול, מצאו את מיקום ההשהיה הבוחן את מעבר החלבון ב-2,930 ס"מ-1 עבור אחת מהקורות האורתוגונליות. ודא שהקיטוב האחר בוחן את מעבר השומנים של 2,850 ס"מ-1.

7. הדמיית SRS במצב אפי

הערה: בסכמת ההדמיה של מצב השידור, המטרה ממקדת את הלייזר לתוך הדגימה, ולאחר מכן עדשת מעבה מכוונת את הקרן המועברת לפוטודיודה לצורך זיהוי נעילה. בסכמת ההדמיה של האפי-מוד, אור שנפגע לאחור ומדה-פולריזציה על ידי הדגימה נזכר על ידי מטרת המיקוד ומבודד באמצעות מפצל קרן מקטב. הפוטונים המבודדים והמסוגננים נשלחים לפוטודיודה דרך זוג עדשות ממסר לזיהוי נעילה. איור 6 מתאר את ערכת ההדמיה של מצב האפי.

  1. התקן HWP לפני שהקרן נכנסת למיקרוסקופ כדי לשנות את הקיטוב של הקרן הנכנסת למיקרוסקופ. מקם PBS מעל המטרה כדי לאפשר לקרן המוחזרת לאחור המדה-קוטבית להגיע לגלאי.
  2. השתמש בזוג עדשות המורכבות מעדשת אכרומט 75 מ"מ ועדשה אספרית של 30 מ"מ כדי להעביר את הפוטונים האחוריים מהפתח האחורי של המטרה אל הפוטו-דטקטור. הרכיבו את הגלאי כדי לאסוף את האור האחורי המכוון על ידי ה-PBS. התקן מסנן כדי לחסום את הקרן המאופננת מלהיכנס לגלאי.
  3. מקם את דגימת הרקמה תחת המטרה. מכיוון שהמעבה אינו נחוץ להדמיה במצב אפי, הסר אותו אם נדרש מקום נוסף.
  4. דימות
    1. חסום את הקורה עם תריס; להאיר מקור אור לבן על הדגימה מהצד; ולהשתמש ב-brightfield כדי למצוא מיקוד אובייקטיבי.
    2. שחררו את החסימה משתי הקורות והשתמשו במיקומי ההשהיה המכוילים מראש כדי להשיג תמונות SRS של שומנים וחלבון מרקמה משתי היציאות של מגבר הנעילה.
    3. התאם את רווח הנעילה ואת גורם סל הפיקסלים כדי להשיג תמונות באיכות טובה.

8. צביעה בצבע כוזב

  1. פתח את ערימת התמונות באמצעות ImageJ.
  2. שלף את שתי התמונות המתאימות למיני השומנים (2,850 ס"מ-1) והחלבון (2,930 ס"מ-1) על ידי לחיצה ימנית על התמונה ולחיצה על שכפול.
  3. שנה את שם תמונת השומנים לשומנים ואת תמונת החלבון לחלבונים.
  4. עבור אל תהליך | תמונה מחשבון ולבצע חלבונים לחסר שומנים.
  5. שלב את התמונות על-ידי מעבר אל תמונה | | צבע מיזוג ערוצים, הגדרת שומנים לירוקים וחלבונים לכחולים. פתיחת הכלי לערוצי תמונות (תמונה | | צבע כלי ערוצים) והתאמת הבהירות והניגודיות (תמונה | התאמת | בהירות/ניגודיות).
  6. התאם את הבהירות והניגודיות עבור כל ערוץ באמצעות כלי הערוצים . עבור תעלת השומנים, התאם את הניגודיות עד שתכונות התאים ייראו כהות. עבור תעלת החלבון, התאם את הניגודיות עד שתכונות התאים יופיעו כחולות. המרת תמונת הערוץ הממוזגת בירוק/כחול לתמונת RGB על-ידי מעבר אל תמונה | סוג | צבע RGB. ייצא תמונה זו לפי קובץ | שמור כ| טיף.
    הערה: עבור צביעת H&E שגויה, ערכת הצבעים מציגה ציטופלסמה ורודה, בעוד שהגרעינים הם כחולים-סגולים כהים.
  7. הורד את הסקריפט HE.m MATLAB ממשאב הסקריפט הכוזב H&E מכתים את טבלת החומרים.
  8. הפעל את הסקריפט HE.m ב- MATLAB. בחר את תמונת RGB המיוצאת מהשלב הקודם כדי ליצור תמונה מוכתמת באופן מלאכותי ב- H&E.
  9. (אופציונלי) נרמל את עוצמת התמונה להדמיית שדה ראייה גדול מכיוון שהתמונה נראית כהה יותר בפריפריה מאשר במרכז.
    1. כדי לבצע נורמליזציה של השדות של התמונות, ממוצע תמונות רבות ככל האפשר. לאחר מכן, הסר את תכונות העוצמה עם ImageJ (תהליך | מסננים | טשטוש גאוסיאן | רדיוס=50).
    2. מדוד את העוצמה המרבית של התמונה המטושטשת (Ctrl+M). חלקו את התמונה המטושטשת בעוצמה המרבית (תהליך | | מתמטיקה לחלק). חלק את תמונת ה-SRS הגולמית בתמונה המטושטשת (תהליך | תמונה | מחשבון).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אופטימיזציה של רזולוציה ספקטרלית:
פיזור דרך חומר מושפע ממדיום הפיזור (אורך וחומר) ומאורך הגל. שינוי אורך מוט הפיזור משפיע על הרזולוציה הספקטרלית ועל גודל האות. זוהי מערכת יחסים של תן וקח שניתן לשקול באופן שונה בהתאם ליישום. המוטות מותחים את פולס הקרן מלהיות רחב בתדר וצר בזמן להיות צר בתדר ורחב בזמן. איור 7 מראה את ההשפעה של אורכי מוט משתנים על הרזולוציה הספקטרלית. איור 7A מדגים רזולוציה ספקטרלית ירודה מאוד; במערך זה אין מוטות ציוץ זכוכית, ושת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ערכת ההדמיה של SRS בשני צבעים המוצגת בפרוטוקול זה תלויה ביישום נכון של הדמיית SRS בצבע אחד. בהדמיית SRS בצבע אחד, השלבים הקריטיים הם יישור מרחבי, יישור זמני, עומק אפנון והסטת פאזה. שילוב מרחבי של שתי הקורות נעשה על ידי מראה דיכרואית. מספר מראות היגוי משמשות להתאמה עדינה בעת שליחת הקורות למראה הדיכרואית. לאחר שילוב הקורות עם המראה הדיכרואית, ניתן לאשר יישור מרחבי על ידי בחירת נתיב הקרן המשולב עם מראה כדי לשלוח לעבר קיר במרחק של >1 מ 'תוך בדיקת הקרן המשולבת כדי לראות אם היא חופפת לכרטיס IR. לאחר יישור מרחבי באמצעות המיקרוס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי NIH R35 GM133435 עד D.F.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עדשה אכרומטית 100 מ"מTHORLABSAC254-100-Bפס רחב, 650 - 1,050 ננומטר, אורך מוקד עדשה אכרומטית, מסנן פס פס 100 מ"מ
20 מגה-הרץמיני-מעגליםBBP-21.4 +מסנן מעבר פס LC גושי, 19.2 - 23.6 מגה-הרץ, 50 ואומגה;
עדשה אכרומטית 200 מ"מTHORLABSAC254-200-Bפס רחב, 650 - 1,050 ננומטר, אורך מוקד עדשה אכרומטית, 200 מ"מ
חצי לוחית גל אכרומטיתאיחוד אופטיWPA2210-650-1100-M25.4חצי לוח גל בפס רחב
רבע לוח גל איחודאופטיWPA4210-650-1100-M25.4פס רחב רבע לוחית
גל דוגם קרןTHORLABSBSN1110:90 Plate Beamsplitter
Dichroic MirrorTHORLABSDMSP1000ניתן להשתמש בדיכרואיקות אחרות עם אורך גל מרכזי בסביבות 1,000 ננומטר.
DMSO (דימתיל סולפוקסיד)ממס 472301 סיגמא אולדריץ'לכיול משמרת ראמאן. ניתן להשתמש בממיסים אחרים עם פסגות ראמאן ידועות.
מודולטור משרעת אלקטרואופטיתTHORLABSEO-AM-NR-C1יש צורך בשני EOMs לאפנון אורתוגונלי והדמיה דו-ערוצית. גרסת תהודה מומלצת כך שניתן להשתמש בנפח נהיגה נמוך יותרtage.
יד כוזבת E Staining ScriptMatlabhttps://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout BufferPRL-414Bמעבדת מחקר דופק1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer ודוחף קו, ליצירת תדר הנהיגה EOM וההתייחסות לגלאי
הפוטודיודה המהירהTHORLABSDET10A2ns Rise
Time DividerPRL-220Aמעבדתמחקר דופקTTL Freq. מחלק (f/2, f/4, f/8, f/16), להפקת 20MHz מפלט הלייזר.
מוטות זכוכית מפזרים במיוחדUnion OpticCYLROD01עדשת מוט H-ZF52A פיזור גבוה 120 מ"מ, עדשת מוט SF11 100 מ"מ
Insight DS+Newportמערכת לייזר המסוגלת להוציא שני לייזרים פולסים מסונכרנים (קרן קבועה אחת ב-1,040 ננומטר וקרן אחת ניתנת לכוונון, הנעה בין 680-1,300 ננומטר) עם קצב חזרה של 80 מגה-הרץ.
מגבר נעילהנוזלייםMoku Labמגבר נעילה לחילוץ אות SRS מהפוטו-דיודה. ניתן להשתמש גם במכשיר ציריך HF2LI או במכשיר דומה.
מראותTHORLABSBB05-E03-10מראה דיאלקטרית בפס רחב, 750 - 1,100 ננומטר. ניתן להשתמש גם במראות כסף.
שלב עיכוב ממונעZaberX-DMQ12P-DE52שלב עיכוב לשליטה עדינה בחפיפה הזמנית של המשאבה והלייזרים של סטוקס. כל שלב ממונע אחר אמור לעבוד.
מעבה טבילה בשמןניקוןCSC10031.4 NA. ניתן להשתמש במעבים אחרים עם NA>1.2.
אוסצילוסקופTektronixTDS7054כל אוסילוסקופ אחר עם פס 400 מגה-הרץ ומעלה אמור לעבוד.
Phase ShifterSigaTekSF50A2להסטת הפאזה של תדר האפנון
דיודת PhotodiodeHamamatsu CorpS3994-01סיליקון PIN עם שטח גדול (10 x 10 ס"מ2). ניתן להשתמש בדיודות אחרות בעלות שטח גדול וקיבול נמוך.
מפצל קרן מקטבאיחוד אופטיPBS9025-620-1000מפצל אלומה מקטב פס
רחב מסד נתוניםrefractiveindex.info
רפלקטור רטרו-רפלקטוראופטיקה אדמונד34-408BBAR פריזמה בזווית ישרה. ניתן להשתמש במנסרות אחרות או ברטרופלקטור.
מגבר כוח RFמיני-מעגליםZHL-1-2W +בלוק רווח, 5 - 500 מגה-הרץ, 50 ואומגה;
סריקת מראותקיימברידג' טכנולוגיות6215Hהשתמשנו בסט מראות 5 מ"מ עם ציפוי כסף
ScanImageVidrio ScanImage תוכנתבקרת מיקרוסקופ סריקת לייזר
מסנן מעבר קצרTHORLABSFESH100025.0 מ"מ מסנן מעבר קצר פרימיום, אורך גל חיתוך: 1,000 ננומטר. לדיכוי יעיל של הסטוקס, ייתכן שיהיה צורך בשני מסננים.
מיקרוסקופ זקוףNikonEclipse FN1ניתן להשתמש בכל מסגרת מיקרוסקופ אחרת. אם קיים מיקרוסקופ סריקת לייזר, ניתן להשתמש בו ישירות. אחרת, היה צורך להוסיף למיקרוסקופ סורק גלבו ועדשת סריקה.
מטרת טבילה במיםאולימפוסXLPLN25XWMP2לאובייקט המולטיפוטון 25X יש NA של 1.05. ניתן להשתמש במטרות דומות אחרות.
Si, 1 מכשירים אינדקס רפאקטיבי בסיסית

מקורות

  1. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  2. Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).
  3. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  4. Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1, 0027(2017).
  5. Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  6. Hollon, T. C., et al. Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks. Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).
  7. Shin, K. S., et al. Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 9 (1), 20392(2019).
  8. Lu, F. -K., et al. Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging. Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).
  9. Shin, K. S., et al. Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes. Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).
  10. Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
  11. Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
  14. Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
  15. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  16. Tsai, P. S., et al. Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging. In Vivo Optical Imaging of Brain. Frostig, R. D., et al. , CRC Press. 113-171 (2002).
  17. Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy. PLoS One. 12 (5), 0178750(2017).
  18. Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
  19. Kong, L., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator. Optics Letters. 38, 145-147 (2013).
  20. He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
  21. Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
  22. Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).
  23. Wright, A. J., et al. Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy. Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

SRSSRS Epi ModePump Probe
בזמן אמת, שני צבעים מגורה Raman פיזור הדמיה של מוח עכבר לאבחון רקמות
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.