מסך DNA, טכניקת הדמיה של מולקולות בודדות בתפוקה גבוהה, מספק פלטפורמה להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות חלבון-דנ"א מגוונות. הפרוטוקול הנוכחי משתמש בטכניקת מסך הדנ"א כדי לחקור את התפקיד הביולוגי והמנגנון המולקולרי של Abo1, סכיזוסקרומיצס פומבה ברומודומיין המכיל AAA+ ATPase.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פענוח מנגנון מולקולרי של הרכבת היסטון בטכניקת מסך DNA
במאמר זה
סיכום
תקציר
כרומטין הוא מבנה מסדר גבוה יותר שאורז דנ"א אאוקריוטי. הכרומטין עובר שינויים דינמיים בהתאם לשלב מחזור התא ובתגובה לגירויים סביבתיים. שינויים אלה חיוניים לשלמות הגנומית, לוויסות אפיגנטי ולתגובות מטבוליות של DNA כגון שכפול, שעתוק ותיקון. הרכבת הכרומטין חיונית לדינמיקה של הכרומטין והיא מזורזת על ידי מלווים של היסטון. למרות מחקרים מקיפים, המנגנונים שבאמצעותם מלווים בהיסטון מאפשרים הרכבת כרומטין נותרו חמקמקים. יתר על כן, התכונות הגלובליות של נוקלאוזומים המאורגנים על ידי מלווים היסטון אינן מובנות היטב. כדי להתמודד עם בעיות אלה, עבודה זו מתארת טכניקת הדמיה ייחודית של מולקולה בודדת בשם מסך DNA, המאפשרת לחקור את הפרטים המולקולריים של הרכבת נוקלאוזומים על ידי מלווים היסטון. מסך DNA היא טכניקה היברידית המשלבת נזילות שומנים, מיקרופלואידיקה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM) כדי לספק פלטפורמה אוניברסלית להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות חלבון-דנ"א מגוונות. באמצעות וילון DNA נחקרת פונקציית מלווה ההיסטון של Abo1, סכיזוסקרומיצס פומבה ברומודומיין המכיל AAA+ ATPase, ומתגלה המנגנון המולקולרי העומד בבסיס הרכבת ההיסטון של Abo1. וילון DNA מספק גישה ייחודית לחקר דינמיקת הכרומטין.
מבוא
דנ"א אאוקריוטי ארוז במבנה מסדר גבוה יותר המכונה כרומטין 1,2. נוקלאוזומים הם היחידה הבסיסית של כרומטין, המורכבת מכ-147 bp DNA העוטפים את אבני הליבה האוקטמריות 3,4. כרומטין ממלא תפקיד קריטי בתאים אאוקריוטים; לדוגמה, המבנה הקומפקטי מגן על הדנ"א מפני גורמים אנדוגניים ואיומים אקסוגניים5. מבנה הכרומטין משתנה באופן דינמי בהתאם לשלב מחזור התא ולגירויים סביבתיים, ושינויים אלה שולטים בגישה לחלבונים במהלך עסקאות DNA כגון שכפול, שעתוק ותיקון6. דינמיקה של כרומטין חשובה גם ליציבות גנומית ולמידע אפיגנטי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת תא הזרימה
- הכינו שקופית סיליקה מאוחה מנוקה המכילה תבניות ננו-תעלות בהתאם לדוח25 שפורסם בעבר.
- קדחו שני חורים בקוטר 1 מ"מ במגלשת סיליקה מאוחה נקייה (איור 1A) באמצעות מקדח מצופה יהלום (ראו טבלת חומרים).
- הפקד 250 ננומטר של אלומיניום עבה (Al) על המגלשה באמצעות מרזב DC32 (ראה טבלת חומרים) עם 10 mTorr של גז ארגון.
- יש לצפות שכבה בעובי 310 ננומטר של 4% פולי(מתיל מתקרילט) (PMMA) (ראו טבלת חומרים) ב-4,000 סל"ד למשך דקה אחת ולאפות על פלטה חמה בטמפרטורה של 180°C במשך 3 דקות.
- צייר א....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עבודה זו מתארת את הליך הכנת תאי הזרימה לבדיקת מסך הדנ"א (איור 1A). בדיקת מסך הדנ"א אפשרה את המחקר של הרכבת דימר היסטון H3-H4 על DNA על ידי Abo1. ראשית, היווצרות מסך הדנ"א נבדקה על ידי צביעת מולקולות דנ"א ב-YOYO-1, צבע מצטלב. קווים ירוקים הוצגו במערכים מקבילים, מה שמצביע על כך ש-YOYO-1 הצטלב למולקולות דנ"א, שהיו מיושרות היטב ונמתחו במחסום דיפוזיה תחת זרימה הידרודינמית (איור 2A). כדי לשלול את האפשרות ש-YOYO-1 מעכב את האינטראקציה של DNA וחלבוני היסטון, YOYO-1 הוסר .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כטכניקת הדמיה של מולקולה יחידה, נעשה שימוש נרחב בווילון הדנ"א כדי לחקור תגובות מטבוליות של דנ"א43. וילון DNA הוא מערכת היברידית המשרשרת נזילות שומנים, מיקרופלואידיקה ו-TIRFM. שלא כמו טכניקות אחרות של מולקולות בודדות, מסך DNA מאפשר הדמיה בזמן אמת בתפוקה גבוהה של אינטראקציות חלבון-DNA. לכן, טכניקת מסך הדנ"א מתאימה לחקירת המנגנון מאחורי אינטראקציות מולקולריות, כולל קשר ספציפי לרצף, תנועת חלבונים יחד עם דנ"א, והתנגשות חלבון-חלבון בדנ"א 17,20,26.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים מעריכים את התמיכה האדיבה ב- Abo1 וב- Cy5-H3-H4 על ידי פרופסור ג'י-ג'ון סונג, קרול צ'ו, Ph.D. וג'וון ג'אנג, Ph.D., ב- KAIST, דרום קוריאה. עבודה זו נתמכת על ידי מענק הקרן הלאומית למחקר (NRF-2020R1A2B5B01001792), קרן מחקר אינטרמורלית (1.210115.01) של המכון הלאומי למדע וטכנולוגיה של אולסן, והמכון למדע בסיסי (IBS-R022-D1).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מזרק 1 מ"ל luer-lock | BecktonDickinson | 301321 | |
| 1 'x 3' זכוכית שקופיות סילקה התמזגה | G. Finkenbeiner | 1 אינץ' x 3 אינץ' מלבני ועובי 1 מ"מ | |
| 10 מ"ל מזרק luer-lock | BecktonDickinson | 302149 | |
| 18:1 (Δ 9-Cis) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | זהו מרכיב של מלאי שומנים ביוטיניליים |
| 18:1 כובע ביוטיניל PE | Avanti | 870273 | זהו מרכיב של מלאי שומנים ביוטיניליים |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | זהו מרכיב של מלאי שומנים ביוטיניליים |
| 3 מ"ל מזרק לואר-לוק | BecktonDickinson | 302832 | |
| שסתום הזרקת דגימה 6 כיוונים | IDEX | MX סדרה II | |
| 950K PMMA | All-Resist | 671.04 | |
| אצטון SAMCHUN | A1759 | ||
| אדנוזין 5'-טריפוספט מלח דיסודיום הידרט (ATP) | Sigma | A2383 | |
| אלומיניום (Al) | TASCO, דרום קוריאה | קוטר LT50AI414 | 4 אינץ', עובי 1/4 אינץ' |
| מסנן Amicon Ultra צנטריפוגלי, MWCO 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
| Ampicillin | Mbcell | MB-A4128 | אנטיביוטיקה |
| AZ 300 MIF מפתח | Merck | 10454110521 | משמש להסרת להב אלומיניום |
| DORCO | DN52 | 12 מ"מ x 6 מ' | |
| בורון טריכלוריד (BCl3) | UNIONGAS | טוהר: >99.99% | |
| אלבומין בסרום בקר (BSA) | סיגמא | A7030 | |
| קטלאז | סיגמא | C40-1g | זהו רכיב של 100x גלוקסי מלאי |
| כלור (Cl2) | UNIONGAS | טוהר: >99.99% | |
| סרט דו צדדי שקוף | 3M | 313770 | |
| D-(+)-גלוקוז | סיגמא | G7528 | |
| DC מקרטע | Sorona | SRM-120 | משמש לתצהיר אלומיניום על מגלשה |
| מקדח מצופה יהלום | Eurotool | DIB-211.00 | משמש ליצירת חורים במגלשת סיליקה מפוזרת |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| Dove-prism | Korea Electro-Optics Co. Ltd. | 1906-106 | מנסרת יונה סיליקה מותכת בהתאמה אישית עם ציפוי נגד השתקפות |
| מקדחה | Dremel | Dremel 3000 | משמשת ליצירת חורים במגלשת סיליקה מפוזרת |
| Electron Bean Lithography | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
| אתילן-דיאמין-חומצה טטראצטית (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
| אביזרי אצבעות | IDEX | F-300 | הוא מחובר עם "PFA Tubing Natural" ליצירת צינורות נעילת לואר |
| אגוז זכר ללא אוגן | IDEX | P-235 | הוא מחובר עם "PFA Tubing Natural" ליצירת מייבש הקפאה של צינורות luer-lock |
| , HyperCOOL | Labogene | HC3110 | משמש לליופיליזציה של חלבונים נוזליים |
| גלוקוז אוקסידאז | סיגמא | G2133-50KU | זהו מרכיב של מלאי גלוקסי 100x |
| גואנידיניום הידרוכלוריד | Acros Organics | 364790025 | |
| מזרק המילטון | חברת המילטון | 80065 | מזרק זה משמש להזרקת דגימה |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | משמש ל- FPLC (אי הכללת גודל) |
| בוחש פלטה חמה | Corning | PC-420D | |
| חומצה הידרוכלורית | Sigma | H1759 | משמש לשמן תואם אינדקס Tris-HCl |
| ZEISS | 444970-9000-000 | ||
| תחריט יונים תגובתי פלזמה בשילוב אינדוקטיבי | Top Technology Ltd. | FabStar | |
| איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Glentham Life Sciences | GC6586-100g | משמש לאינדוקציה של β-galactosidase |
| פעילות Lambda פאג' | DNA NEB | N0311 | |
| LB מרק | BD difco | 244610 | מדיה לצמיחת תאי E.coli |
| מתאם Luer 10-32 | IDEX | P-659 | זה מחבר luer-lock מזרק וצינורות |
| מגנזיום כלוריד הקסהידראט | פישר ביוריאגנטים | BP214 | |
| מתיל איזובוטיל קטון (MIBK) | KAYAKU חומרים | המשמשים לפיתוח מיקרוסקופ תמיסה | |
| (Eclipse Ti2) | Nikon | Eclipse Ti2 | מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך |
| מיקרוסקופ כיסוי זכוכית | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 מ"מ (מס' 1) |
| שקופית מיקרוסקופ | DURAN GROUP | DU.2355013 | קצה קרקע זכוכית שקופית 45°, רגיל 26 x 76 מ"מ |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| עדשת אובייקטיבית | Nikon | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | סוג טבילה: מים, הגדלה: 60x, תיקון: 18, מרחק עבודה: 0.29 (0.31-0.28) |
| One Shot BL21 (DE3)pLysS מוכשר כימית E. coli | Thermo Fisher Scientific | C6060-03 | תא מוכשר לביטוי יתר של חלבונים |
| חמצן (O2) | NOBLEGAS, דרום קוריאה | טוהר: >99.99% | |
| צינורות PFA טבעיים | IDEX | 1512L | הוא מחובר עם "אביזרי אצבעות" ליצירת צינורות נעילת לואר |
| פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF) | Roche | 11359061001 | מעכב |
| פרוטאזSephacryl S-200 Cytiva ברזולוציה גבוהה | 17-0584-01 | משמש עבור FPLC (אי הכללת גודל) | |
| שסתום כיבוי | IDEX | P-732 | |
| נתרן אצטט | סיגמא | 791741 | |
| נתרן כלורי (NaCl) | Sigma | S3014 | |
| נתרן הידרוקסיד (NaOH) | Sigma | s5881 | |
| צינורות ממברנה מולקולרית ספקטרה/פור, MWCO 6-8 kDa | Spectrum | laboratories 132660 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | S888 | |
| גופרית טטרלפלואוריד (SF4) | NOBLEGAS, דרום קוריאה | טוהר: >99.99% | |
| משאבת מזרק | KD Scientific | 78-8210 | |
| Tetrafluoromethane (CF4) | NOBLEGAS, דרום קוריאה | טוהר: >99.99% | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| בסיס Trizma | Sigma | T1503 | משמש עבור Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | משמש להרכבת FPLC (חילופי יונים) |
| איחוד | IDEX | P-760 | זה מחבר צינורות |
| אוריאה | סיגמה | U5378 | |
| תנור ואקום | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | צבע אינטרקלציה זה מדולל ב-DMSO |
| &-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M6250 |
מקורות
- Woodcock, C. L., Ghosh, R. P. Chromatin higher-order structure and dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (5), 000596(2010).
- Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure.<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
