הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פענוח מנגנון מולקולרי של הרכבת היסטון בטכניקת מסך DNA

2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63501

⸱

9 במרץ 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ulsan National Institute of Science and Technology, 2Center for Genomic Integrity, Institute for Basic Science (IBS)

במאמר זה

סיכום

מסך DNA, טכניקת הדמיה של מולקולות בודדות בתפוקה גבוהה, מספק פלטפורמה להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות חלבון-דנ"א מגוונות. הפרוטוקול הנוכחי משתמש בטכניקת מסך הדנ"א כדי לחקור את התפקיד הביולוגי והמנגנון המולקולרי של Abo1, סכיזוסקרומיצס פומבה ברומודומיין המכיל AAA+ ATPase.

תקציר

כרומטין הוא מבנה מסדר גבוה יותר שאורז דנ"א אאוקריוטי. הכרומטין עובר שינויים דינמיים בהתאם לשלב מחזור התא ובתגובה לגירויים סביבתיים. שינויים אלה חיוניים לשלמות הגנומית, לוויסות אפיגנטי ולתגובות מטבוליות של DNA כגון שכפול, שעתוק ותיקון. הרכבת הכרומטין חיונית לדינמיקה של הכרומטין והיא מזורזת על ידי מלווים של היסטון. למרות מחקרים מקיפים, המנגנונים שבאמצעותם מלווים בהיסטון מאפשרים הרכבת כרומטין נותרו חמקמקים. יתר על כן, התכונות הגלובליות של נוקלאוזומים המאורגנים על ידי מלווים היסטון אינן מובנות היטב. כדי להתמודד עם בעיות אלה, עבודה זו מתארת טכניקת הדמיה ייחודית של מולקולה בודדת בשם מסך DNA, המאפשרת לחקור את הפרטים המולקולריים של הרכבת נוקלאוזומים על ידי מלווים היסטון. מסך DNA היא טכניקה היברידית המשלבת נזילות שומנים, מיקרופלואידיקה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM) כדי לספק פלטפורמה אוניברסלית להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות חלבון-דנ"א מגוונות. באמצעות וילון DNA נחקרת פונקציית מלווה ההיסטון של Abo1, סכיזוסקרומיצס פומבה ברומודומיין המכיל AAA+ ATPase, ומתגלה המנגנון המולקולרי העומד בבסיס הרכבת ההיסטון של Abo1. וילון DNA מספק גישה ייחודית לחקר דינמיקת הכרומטין.

מבוא

דנ"א אאוקריוטי ארוז במבנה מסדר גבוה יותר המכונה כרומטין 1,2. נוקלאוזומים הם היחידה הבסיסית של כרומטין, המורכבת מכ-147 bp DNA העוטפים את אבני הליבה האוקטמריות 3,4. כרומטין ממלא תפקיד קריטי בתאים אאוקריוטים; לדוגמה, המבנה הקומפקטי מגן על הדנ"א מפני גורמים אנדוגניים ואיומים אקסוגניים5. מבנה הכרומטין משתנה באופן דינמי בהתאם לשלב מחזור התא ולגירויים סביבתיים, ושינויים אלה שולטים בגישה לחלבונים במהלך עסקאות DNA כגון שכפול, שעתוק ותיקון6. דינמיקה של כרומטין חשובה גם ליציבות גנומית ולמידע אפיגנטי.

הכרומטין מווסת באופן דינמי על ידי גורמים שונים, כולל שינויים בזנב היסטון ומארגני כרומטין כגון משפצי כרומטין, חלבונים מקבוצת פוליקומב ומלווי היסטון7. מלווים היסטון מתאמים את ההרכבה והפירוק של נוקלאוזומים באמצעות שיקוע או ניתוק של אבני ליבה 8,9. פגמים במלווים היסטון גורמים לאי יציבות גנומית וגורמים להפרעות התפתחותיות וסרטן 9,10. מלווי היסטון שונים אינם זקוקים לצריכת אנרגיה כימית כמו הידרוליזה ATP כדי להרכיב או לפרק נוקלאוזומים 9,11,12,13. לאחרונה, חוקרים דיווחו כי ATPases המכיל ברומודומיין AAA+ (ATPase הקשור לפעילויות תאיות מגוונות) ממלאים תפקיד בדינמיקה של כרומטין כמו מלווים היסטון 14,15,16,17. ATAD2 אנושי (חלבון המכיל תחום AAA ממשפחת ATPase 2) מקדם את נגישות הכרומטין כדי לשפר את ביטוי הגנים18. כמווסת שעתוק משותף, ATAD2 מווסת את הכרומטין של גורמי שעתוק אונקוגניים14, וביטוי היתר של ATAD2 קשור לפרוגנוזה גרועה בסוגים רבים של סרטן19. Yta7, ההומולוג Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) של ATAD2, מפחית את צפיפות הנוקלאוזומים בכרומטין15. לעומת זאת, Abo1, ההומולוג Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) של ATAD2, מגביר את צפיפות הנוקלאוזומים16. באמצעות טכניקת הדמיה ייחודית של מולקולה בודדת, וילון DNA, השאלה אם Abo1 תורם להרכבת נוקלאוזומים או פירוקו מטופלת17,20.

באופן מסורתי, התכונות הביוכימיות של ביומולקולות נבדקו על ידי ניסויים בתפזורת כגון בדיקת שינוי ניידות אלקטרופורטית (EMSA) או קו-אימונומשקעים (co-IP), שבהם נבדקים מספר רב של מולקולות, ותכונותיהן הממוצעות מאופיינות21,22. בניסויים בתפזורת, תת-מצבים מולקולריים מוסווים על ידי אפקט ממוצע האנסמבל, וחקירת אינטראקציות ביומולקולריות מוגבלת. לעומת זאת, טכניקות של מולקולות בודדות עוקפות את המגבלות של ניסויים בתפזורת ומאפשרות אפיון מפורט של אינטראקציות ביומולקולריות. בפרט, נעשה שימוש נרחב בטכניקות הדמיה של מולקולות בודדות כדי לחקור אינטראקציות DNA-חלבון וחלבון-חלבון23. טכניקה אחת כזו היא מסך DNA, טכניקת הדמיה ייחודית של מולקולה אחת המבוססת על מיקרופלואידיקה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM)24,25. במסך דנ"א, מאות מולקולות דנ"א בודדות מעוגנות לדו-שכבה השומנית, המאפשרת תנועה דו-ממדית של מולקולות דנ"א עקב נזילות השומנים. כאשר זרימה הידרודינמית מופעלת, מולקולות דנ"א נעות לאורך הזרימה על הדו-שכבה ונתקעות במחסום דיפוזיה, שם הן מיושרות ונמתחות. בעוד שהדנ"א מוכתם בחומרים משתלבים, חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי מוזרקים, ו-TIRFM משמש לדמיין אינטראקציות חלבון-דנ"א בזמן אמת ברמת מולקולה בודדת23. פלטפורמת מסך הדנ"א מאפשרת תצפית על תנועות חלבונים כגון דיפוזיה, טרנסלוקציה והתנגשות 26,27,28. יתר על כן, וילון DNA יכול לשמש למיפוי חלבונים על דנ"א עם מיקומים, כיוונים וטופולוגיות מוגדרות או מיושם לחקר הפרדת פאזה של חלבונים וחומצות גרעין 29,30,31.

בעבודה זו, טכניקת מסך הדנ"א משמשת כדי לספק ראיות לתפקודם של מלווים באמצעות הדמיה ישירה של חלבונים ספציפיים. יתר על כן, מכיוון שמסך DNA הוא פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה, הוא מאפשר איסוף נתונים בהיקף מספיק לאמינות סטטיסטית. כאן, הוא מתואר כיצד לבצע את בדיקת מסך ה- DNA בפירוט כדי לחקור את התפקיד המולקולרי של S. pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase Abo1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תא הזרימה

  1. הכינו שקופית סיליקה מאוחה מנוקה המכילה תבניות ננו-תעלות בהתאם לדוח25 שפורסם בעבר.
    1. קדחו שני חורים בקוטר 1 מ"מ במגלשת סיליקה מאוחה נקייה (איור 1A) באמצעות מקדח מצופה יהלום (ראו טבלת חומרים).
    2. הפקד 250 ננומטר של אלומיניום עבה (Al) על המגלשה באמצעות מרזב DC32 (ראה טבלת חומרים) עם 10 mTorr של גז ארגון.
    3. יש לצפות שכבה בעובי 310 ננומטר של 4% פולי(מתיל מתקרילט) (PMMA) (ראו טבלת חומרים) ב-4,000 סל"ד למשך דקה אחת ולאפות על פלטה חמה בטמפרטורה של 180°C במשך 3 דקות.
    4. צייר את תבניות ננו-תעלה על שכבת PMMA בין שני החורים באמצעות ליתוגרפיית קרן אלקטרונים (אלומה)33 עם זרם 0.724 nA ב- 80 kV.
      הערה: הארכיטקטורה והממדים של תבניות ננו-תעלות מוצגים באיור 1A.
    5. הסר את PMMA החשוף לאלומה על ידי השריית השקופיות בתמיסה המתפתחת (יחס של 1:3 של מתיל איזובוטיל קטון ואיזופרופנול, ראה טבלת חומרים) למשך 2 דקות.
    6. תחריט שכבות Al עם תחריט יונים תגובתי פלזמה מצומד אינדוקטיבי (ICP-RIE) באמצעות כלור (Cl2) וגזי בורון טריכלוריד (BCl 3).
      הערה: שני גזים אלה יכולים להסיר את ה-Al מאזורים החשופים לאלומות.
    7. חצבו ננו-תעלות במגלשות באמצעות גזי גופרית טטרה-פלואוריד (SF4), טטרה-פלואורומתאן (CF4) וגזי חמצן (O2) (ראו טבלת חומרים).
    8. הסר את שכבת Al הנותרת על ידי השריית השקופיות ב- Al etchant (מפתח AZ 300 GIF, ראה טבלת חומרים) למשך 10 דקות.
    9. לאחר הייצור, שטפו את המגלשות במים נטולי יונים, ובצעו סוניקציה באצטון למשך 30 דקות באמצעות סוניק מסוג אמבטיה.
    10. נקו את המגלשות בתמיסת Hellmanex III 2% (ראו טבלת חומרים) למשך יום אחד לפחות עם ערבוב מגנטי.
    11. החליקו את המגלשות באצטון במשך 30 דקות וב-1 M NaOH במשך 30 דקות ברציפות.
    12. יש לשטוף את המגלשות במים שעברו דה-יוניזציה ולייבש בגז חנקן (N2).
  2. שים נייר נקי (5 מ"מ x 35 מ"מ) על מרכז סרט דו-צדדי. חבר את סרט הדבק מעל השקופית כדי לכסות את שני החורים ואת תבניות הננו עם הנייר.
  3. הבלו על הנייר באמצעות להב נקי (איור 1A).
  4. הניחו כיסוי זכוכית על גבי סרט הדבקה דו-צדדי ושפשפו את הכיסוי באמצעות קצה פיפטה כדי ליצור תא מיקרופלואידי (איור 1A).
  5. מקם את תא הזרימה המורכב בין שתי שקופיות מיקרוסקופ וגזור אותן.
  6. אופים את תא הזרימה בתנור ואקום בטמפרטורה של 120 מעלות למשך 45 דקות.
  7. חבר את מחבר הנוזל (Nanoport) עבור ניתוחים מבוססי שבב (ראה טבלת חומרים) לכל חור פתוח באמצעות אקדח דבק חם וחבר את שני הקווים של צינורות נעילת Luer.
  8. חברו מזרק Luer lock המכיל 3 מ"ל מים נטולי יונים, ושטפו את החדר.
  9. שטפו את התא עם 3 מ"ל של חיץ שומנים (20 מילימול של Tris-HCl, pH 8.0 ו-100 מילימול של NaCl) באמצעות חיבור טיפה אחר טיפה.
    הערה: חיבור טיפה אחר טיפה מקשר את כל המזרקים לתא הזרימה כדי למנוע הזרקת בועות אוויר לתא.
  10. הזריקו 1 מ"ל של 0.04x שומן ביוטינילציה בחיץ שומנים לתוך התא בשתי יריות עם 5 דקות דגירה לכל זריקה.
    הערה: הכנת מלאי שומנים 1x biotinylated מתואר בדוחשפורסם בעבר 34.
  11. שטפו את התא עם 3 מ"ל של חיץ שומנים ודגרו במשך 20 דקות כדי ששכבת השומנים תתבגר על משטח המגלשה.
  12. הוסף 1 מ"ל של מאגר BSA (40 מ"מ של Tris-HCl, pH 8.0, 50 מילימול של NaCl, 2 מילימול של MgCl2 ו- 0.2 מ"ג/מ"ל של BSA) ודגור במשך 5 דקות כדי להפוך את משטח המגלשה לפסיבי.
    הערה: שלב זה יכול להפחית את הקישור הלא ספציפי של חלבונים למשטח השקופית.
  13. הזריקו 0.025 מ"ג/מ"ל סטרפטאווידין ב-1 מ"ל של חיץ BSA עם שתי יריות ו-10 דקות דגירה לכל זריקה.
  14. שטפו את שאריות הסטרפטאווידין עם 3 מ"ל של מאגר BSA.
  15. הזריקו ~300 pM (30 μL) של DNA פאג' למבדה ביוטינילציה ב-1 מ"ל של חיץ BSA לתוך התא עם שתי יריות ו-10 דקות דגירה לכל ירייה.
    הערה: הכנת DNA של למבדה ביוטינילציה מתוארת בדו"ח34 שפורסם בעבר.

2. חיבור תא זרימה למערכת המיקרופלואידית והטענתו על המיקרוסקופ

  1. הכן מאגר הדמיה Abo1 (50 mM של Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM של NaCl, 1 mM של DTT, 1 mM של ATP, 2 mM של MgCl2, 1.6% גלוקוז, ו 0.1x של gloxy, ראה טבלה של חומרים).
    הערה: Gloxy היא מערכת לניקוי חמצן המפחיתה את ההלבנה של צבעים פלואורסצנטיים. הכנת מלאי גלוקסי 100x עם גלוקוז אוקסידאז וקטלאז מתוארת בהפניה35.
  2. חבר מזרק המכיל 10 מ"ל של חיץ הדמיה למשאבת מזרק והסר בועות בכל קווי הצינור במערכת המיקרופלואידית.
  3. חברו את תא הזרימה המוכן למערכת המיקרופלואידית באמצעות חיבור טיפה לטיפה כדי למנוע הזרקת בועות לתוך תא הזרימה (איור 1B).
  4. הרכיבו את מחזיקי תאי הזרימה ותאי הזרימה והרכיבו את המכלול על מיקרוסקופ TIRF שנבנה במיוחד (איור 1C).
    זהירות: כאשר מכניסים את תא הזרימה מתחת למיקרוסקופ, קבעו בזהירות את גובה עדשת המטרה. אסור שתא הזרימה ייגע בעדשת המטרה. זה יכול להזיק לעדשה.
  5. הורידו שמן תואם אינדקס במרכז תא הזרימה והניחו מנסרת יונה בהתאמה אישית (ראו טבלת חומרים) על טיפת השמן.

3. הרכבת היסטון על ידי Abo1 באמצעות וילון DNA

  1. ערבבו 5 ננומטר של Abo1 ו-12.5 ננומטר של דימר היסטון H3-H4 עם תווית Cy5 (Cy5-H3-H4) (ראו טבלת חומרים) ב-150 מיקרוליטר של מאגר הדמיה. כל החלבונים הוכנו בעקבות דו"ח17 שפורסם בעבר.
  2. דוגרים על התערובת על קרח במשך 15 דקות.
    הערה: כדי למנוע הלבנה של Cy5, הדגירה חייבת להיעשות בחושך.
  3. הזריקו ~20 pM (2 μL) של צבע YOYO-1 במאגר הדמיה דרך לולאת דגימה של 100 μL כדי להכתים מולקולות DNA של למדא.
  4. הפעל תוכנת הדמיה (ראה טבלת חומרים) והפעל את הלייזר של 488 ננומטר כדי לבדוק אם וילונות הדנ"א בנויים היטב.
    הערה: אם וילונות הדנ"א בנויים היטב, מולקולות הדנ"א, המוכתמות ב-YOYO-1, מוצגות כקווים מיושרים במחסום בנוכחות זרימה. הקווים המתוחים נרתעים ומתרחקים מהמכשול כאשר הזרימה כבויה.
  5. הזריקו 2 מ"ל של מאגר מלח גבוה (200 מילימול של NaCl ו-40 מילימול של MgCl2) כדי לסלק את צבע YOYO-1 מהדנ"א.
  6. לאחר הסרת צבע YOYO-1, יש להזריק את דגימת החלבון שהודגרה מראש.
  7. כאשר החלבונים מגיעים לווילון הדנ"א, כבו את משאבת המזרק, כבו את שסתום הסגירה ודגרו 15 דקות על העמסת היסטון על ידי Abo1.
  8. שטפו את חלבוני ה-Abo1 וההיסטון הלא קשורים למשך 5 דקות.
  9. הפעל את שסתום הכיבוי וחדש את הזרקת הזרימה.
  10. הפעל את הלייזר של 637 ננומטר וצלם את החלבונים הפלואורסצנטיים בזמן שזרימת המאגר מופעלת.
  11. כבו באופן זמני את זרימת החיץ כדי לבדוק אם חלבוני היסטון נטענים על דנ"א (איור 2C).
  12. אסוף תמונות מסך DNA באמצעות תוכנית לרכישת תמונות (ראה טבלת חומרים).
    הערה: כאשר זרימת החיץ נפסקת באופן זמני, הדנ"א נרתע מהשדה האוונסנטי של השתקפות פנימית כוללת, וחלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי הקשורים לדנ"א נעלמים.

4. ניתוח נתונים

  1. המר את התמונות שצולמו על-ידי התוכנית לרכישת תמונות לתבנית TIFF כרצפי תמונות.
    הערה: כל הנתונים נותחו באמצעות תמונה J (NIH) כמתואר בהפניה20.
  2. בחרו מולקולת דנ"א בודדת מתוך רצפי התמונות וציירו קימוגרף.
    הערה: הקימוגרף יכול להראות את השינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות של כל חלבון היסטון הקשור למולקולת דנ"א יחידה כפונקציה של זמן.
  3. צור את פרופיל עוצמת הפלואורסצנטיות מהקימוגרף והתאם אותו למספר פונקציות גאוסיות.
  4. אסוף את הקואורדינטות המרכזיות של הפסגות מפרופיל עוצמת הפלואורסצנטיות. בשלב זה, ניתן להשיג את העוצמה המינימלית של פלואורסצנטיות היסטון.
  5. חלק את כל עוצמות השיא שנאספו מהפרופילים בעוצמה מינימלית. מספר הדימרים H3-H4 הקשורים לדנ"א מוערך בשלב זה.
  6. בצע שלבים 4.2-4.5 עבור מולקולות דנ"א אחרות.
  7. צור היסטוגרמה להתפלגות הקישור של דימרים H3-H4 בגודל סל של 1 kbp. מספר המולקולות שנותחו הוא לפחות 300.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עבודה זו מתארת את הליך הכנת תאי הזרימה לבדיקת מסך הדנ"א (איור 1A). בדיקת מסך הדנ"א אפשרה את המחקר של הרכבת דימר היסטון H3-H4 על DNA על ידי Abo1. ראשית, היווצרות מסך הדנ"א נבדקה על ידי צביעת מולקולות דנ"א ב-YOYO-1, צבע מצטלב. קווים ירוקים הוצגו במערכים מקבילים, מה שמצביע על כך ש-YOYO-1 הצטלב למולקולות דנ"א, שהיו מיושרות היטב ונמתחו במחסום דיפוזיה תחת זרימה הידרודינמית (איור 2A). כדי לשלול את האפשרות ש-YOYO-1 מעכב את האינטראקציה של DNA וחלבוני היסטון, YOYO-1 הוסר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כטכניקת הדמיה של מולקולה יחידה, נעשה שימוש נרחב בווילון הדנ"א כדי לחקור תגובות מטבוליות של דנ"א43. וילון DNA הוא מערכת היברידית המשרשרת נזילות שומנים, מיקרופלואידיקה ו-TIRFM. שלא כמו טכניקות אחרות של מולקולות בודדות, מסך DNA מאפשר הדמיה בזמן אמת בתפוקה גבוהה של אינטראקציות חלבון-DNA. לכן, טכניקת מסך הדנ"א מתאימה לחקירת המנגנון מאחורי אינטראקציות מולקולריות, כולל קשר ספציפי לרצף, תנועת חלבונים יחד עם דנ"א, והתנגשות חלבון-חלבון בדנ"א 17,20,26.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מעריכים את התמיכה האדיבה ב- Abo1 וב- Cy5-H3-H4 על ידי פרופסור ג'י-ג'ון סונג, קרול צ'ו, Ph.D. וג'וון ג'אנג, Ph.D., ב- KAIST, דרום קוריאה. עבודה זו נתמכת על ידי מענק הקרן הלאומית למחקר (NRF-2020R1A2B5B01001792), קרן מחקר אינטרמורלית (1.210115.01) של המכון הלאומי למדע וטכנולוגיה של אולסן, והמכון למדע בסיסי (IBS-R022-D1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרק 1 מ"ל luer-lockBecktonDickinson301321
1 'x 3' זכוכית שקופיות סילקה התמזגהG. Finkenbeiner1 אינץ' x 3 אינץ' מלבני ועובי 1 מ"מ
10 מ"ל מזרק luer-lockBecktonDickinson302149
18:1 (Δ 9-Cis) PC (DOPC)Avanti850375זהו מרכיב של מלאי שומנים ביוטיניליים
18:1 כובע ביוטיניל PEAvanti870273זהו מרכיב של מלאי שומנים ביוטיניליים
18:1 PEG2000 PEAvanti880130זהו מרכיב של מלאי שומנים ביוטיניליים
3 מ"ל מזרק לואר-לוקBecktonDickinson302832
שסתום הזרקת דגימה 6 כיווניםIDEXMX סדרה II
950K PMMAAll-Resist671.04
אצטון SAMCHUNA1759
אדנוזין 5'-טריפוספט מלח דיסודיום הידרט (ATP)SigmaA2383
אלומיניום (Al)TASCO, דרום קוריאהקוטר LT50AI4144 אינץ', עובי 1/4 אינץ'
מסנן Amicon Ultra צנטריפוגלי, MWCO 10 kDaMilliporeZ648027
AmpicillinMbcellMB-A4128אנטיביוטיקה
AZ 300 MIF מפתחMerck10454110521משמש להסרת להב אלומיניום
DORCODN5212 מ"מ x 6 מ'
בורון טריכלוריד (BCl3)UNIONGASטוהר: >99.99%
אלבומין בסרום בקר (BSA)סיגמאA7030
קטלאזסיגמאC40-1gזהו רכיב של 100x גלוקסי מלאי
כלור (Cl2)UNIONGASטוהר: >99.99%
סרט דו צדדי שקוף3M313770
D-(+)-גלוקוזסיגמאG7528
DC מקרטעSoronaSRM-120משמש לתצהיר אלומיניום על מגלשה
מקדח מצופה יהלוםEurotoolDIB-211.00משמש ליצירת חורים במגלשת סיליקה מפוזרת
DL-Dithiothreitol (DTT)SigmaD0632
Dove-prismKorea Electro-Optics Co. Ltd.1906-106מנסרת יונה סיליקה מותכת בהתאמה אישית עם ציפוי נגד השתקפות
מקדחהDremelDremel 3000משמשת ליצירת חורים במגלשת סיליקה מפוזרת
Electron Bean LithographyNanobeam Ltd.NB3
אתילן-דיאמין-חומצה טטראצטית (EDTA)SigmaEDS-1KG
אביזרי אצבעותIDEXF-300הוא מחובר עם "PFA Tubing Natural" ליצירת צינורות נעילת לואר
אגוז זכר ללא אוגןIDEXP-235הוא מחובר עם "PFA Tubing Natural" ליצירת מייבש הקפאה של צינורות luer-lock
, HyperCOOLLabogeneHC3110משמש לליופיליזציה של חלבונים נוזליים
גלוקוז אוקסידאזסיגמאG2133-50KUזהו מרכיב של מלאי גלוקסי 100x
גואנידיניום הידרוכלורידAcros Organics364790025
מזרק המילטוןחברת המילטון80065מזרק זה משמש להזרקת דגימה
Hellmanex IIISigmaZ805939
HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pgCytiva28-9893-36משמש ל- FPLC (אי הכללת גודל)
בוחש פלטה חמהCorningPC-420D
חומצה הידרוכלוריתSigmaH1759משמש לשמן תואם אינדקס Tris-HCl
ZEISS444970-9000-000
תחריט יונים תגובתי פלזמה בשילוב אינדוקטיביTop Technology Ltd.FabStar
איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Glentham Life SciencesGC6586-100gמשמש לאינדוקציה של β-galactosidase
פעילות Lambda פאג'DNA NEBN0311
LB מרקBD difco244610מדיה לצמיחת תאי E.coli
מתאם Luer 10-32IDEXP-659זה מחבר luer-lock מזרק וצינורות
מגנזיום כלוריד הקסהידראטפישר ביוריאגנטיםBP214
מתיל איזובוטיל קטון (MIBK)KAYAKU חומריםהמשמשים לפיתוח מיקרוסקופ תמיסה
(Eclipse Ti2)NikonEclipse Ti2מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך
מיקרוסקופ כיסוי זכוכיתMARIENFELD10114222 x 50 מ"מ (מס' 1)
שקופית מיקרוסקופDURAN GROUPDU.2355013קצה קרקע זכוכית שקופית 45°, רגיל 26 x 76 מ"מ
NanoportIDEXN-333-01
עדשת אובייקטיביתNikonCFI Plan Apochromat VC 60XC WIסוג טבילה: מים, הגדלה: 60x, תיקון: 18, מרחק עבודה: 0.29 (0.31-0.28)
One Shot BL21 (DE3)pLysS מוכשר כימית E. coliThermo Fisher ScientificC6060-03תא מוכשר לביטוי יתר של חלבונים
חמצן (O2)NOBLEGAS, דרום קוריאהטוהר: >99.99%
צינורות PFA טבעייםIDEX1512Lהוא מחובר עם "אביזרי אצבעות" ליצירת צינורות נעילת לואר
פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF)Roche11359061001מעכב
פרוטאזSephacryl S-200 Cytiva ברזולוציה גבוהה17-0584-01משמש עבור FPLC (אי הכללת גודל)
שסתום כיבויIDEXP-732
נתרן אצטטסיגמא791741
נתרן כלורי (NaCl)SigmaS3014
נתרן הידרוקסיד (NaOH)Sigmas5881
צינורות ממברנה מולקולרית ספקטרה/פור, MWCO 6-8 kDaSpectrumlaboratories 132660
StreptavidinThermo Fisher ScientificS888
גופרית טטרלפלואוריד (SF4)NOBLEGAS, דרום קוריאהטוהר: >99.99%
משאבת מזרקKD Scientific78-8210
Tetrafluoromethane (CF4)NOBLEGAS, דרום קוריאהטוהר: >99.99%
TritonX-100SigmaT9284
בסיס TrizmaSigmaT1503משמש עבור Tris-HCl
TSKgel SP-5PWTOSOH14715משמש להרכבת FPLC (חילופי יונים)
איחודIDEXP-760זה מחבר צינורות
אוריאהסיגמהU5378
תנור ואקוםJeio TechOV-11
YOYO-1Thermo Fisher ScientificY3601צבע אינטרקלציה זה מדולל ב-DMSO
&-mercaptoethanol (BME)SigmaM6250
מתקדמים מעכב

מקורות

  1. Woodcock, C. L., Ghosh, R. P. Chromatin higher-order structure and dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (5), 000596(2010).
  2. Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure. Molecules and Cells. 42 (7), 512-522 (2019).
  3. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  4. McGhee, J. D., Felsenfeld, G. Nucleosome structure. Annual Review of Biochemistry. 49, 1115-1156 (1980).
  5. Takata, H., et al. Chromatin compaction protects genomic DNA from radiation damage. PLOS One. 8 (10), 75622(2013).
  6. Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
  7. Peterson, C. L., Almouzni, G. Nucleosome dynamics as modular systems that integrate DNA damage and repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), 012658(2013).
  8. Torigoe, S. E., Urwin, D. L., Ishii, H., Smith, D. E., Kadonaga, J. T. Identification of a rapidly formed nonnucleosomal histone-DNA intermediate that is converted into chromatin by ACF. Molecules and Cells. 43 (4), 638-648 (2011).
  9. Gurard-Levin, Z. A., Quivy, J. P., Almouzni, G. Histone chaperones: assisting histone traffic and nucleosome dynamics. Annual Review of Biochemistry. 83, 487-517 (2014).
  10. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  11. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  12. Hammond, C. M., Stromme, C. B., Huang, H., Patel, D. J., Groth, A. Histone chaperone networks shaping chromatin function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (3), 141-158 (2017).
  13. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: an escort network regulating histone traffic. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  14. Zou, J. X., Revenko, A. S., Li, L. B., Gemo, A. T., Chen, H. W. ANCCA, an estrogen-regulated AAA+ ATPase coactivator for ERalpha, is required for co-regulator occupancy and chromatin modification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18067-18072 (2007).
  15. Lombardi, L. M., Davis, M. D., Rine, J. Maintenance of nucleosomal balance in cis by conserved AAA-ATPase Yta7. Genetics. 199 (1), 105-116 (2015).
  16. Gal, C., et al. Abo1, a conserved bromodomain AAA-ATPase, maintains global nucleosome occupancy and organisation. EMBO Reports. 17 (1), 79-93 (2016).
  17. Cho, C., et al. Structural basis of nucleosome assembly by the Abo1 AAA+ ATPase histone chaperone. Nature Communications. 10 (1), 5764(2019).
  18. Morozumi, Y., et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (4), 349-362 (2016).
  19. Zhang, M., Zhang, C., Du, W., Yang, X., Chen, Z. ATAD2 is overexpressed in gastric cancer and serves as an independent poor prognostic biomarker. Clinical and Translational Oncology. 18 (8), 776-781 (2016).
  20. Kang, Y., Cho, C., Lee, K. S., Song, J. J., Lee, J. Y. Single-molecule imaging reveals the mechanism underlying histone loading of schizosaccharomyces pombe AAA+ ATPase Abo1. Molecules and Cells. 44 (2), 79-87 (2021).
  21. Fried, M. G. Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay. Electrophoresis. 10 (5-6), 366-376 (1989).
  22. Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. Journal of Immunology. 115 (6), 1617-1624 (1975).
  23. Lu, H. P. Single-molecule study of protein-protein and protein-DNA interaction dynamics. Methods in Molecular Biology. 305, 385-414 (2005).
  24. Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24 (18), 10524-10531 (2008).
  25. Kang, Y., et al. High-throughput single-molecule imaging system using nanofabricated trenches and fluorescent DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1640-1648 (2020).
  26. Cheon, N. Y., Kim, H. S., Yeo, J. E., Scharer, O. D., Lee, J. Y. Single-molecule visualization reveals the damage search mechanism for the human NER protein XPC-RAD23B. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8337-8347 (2019).
  27. Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecules and Cells. 54 (5), 832-843 (2014).
  28. Kang, H. J., et al. TonEBP recognizes R-loops and initiates m6A RNA methylation for R-loop resolution. Nucleic Acids Research. 49 (1), 269-284 (2021).
  29. Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
  30. Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (10), 1056-1062 (2009).
  31. Stigler, J., Camdere, G. O., Koshland, D. E., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals a collapsed conformational state for DNA-bound cohesin. Cell Reports. 15 (5), 988-998 (2016).
  32. Thornton, J. A. Sputter Coating- Its Principles and Potential. SAE Transactions. 82, 1787-1805 (1973).
  33. Grigorescu, A. E., Hagen, C. W. Resists for sub-20-nm electron beam lithography with a focus on HSQ: state of the art. Nanotechnology. 20 (29), 292001(2009).
  34. Meir, A., Kong, M., Xue, C., Greene, E. C. DNA curtains shed light on complex molecular systems during homologous recombination. Journal of Visualized Experiments. (160), e61320(2020).
  35. Cold Spring Harbor Protocols. Gloxy. Vol. 2. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  36. Gracey, L. E., et al. An in vitro-identified high-affinity nucleosome-positioning signal is capable of transiently positioning a nucleosome in vivo. Epigenetics Chromatin. 3 (1), 13(2010).
  37. Subtil-Rodriguez, A., Reyes, J. C. BRG1 helps RNA polymerase II to overcome a nucleosomal barrier during elongation, in vivo. EMBO Reports. 11 (10), 751-757 (2010).
  38. Lancrey, A., et al. Nucleosome positioning on large tandem DNA repeats of the '601' sequence engineered in Saccharomyces cerevisiae. bioRxiv. , (2021).
  39. Perales, R., Zhang, L., Bentley, D. Histone occupancy in vivo at the 601 nucleosome binding element is determined by transcriptional history. Molecular and Cellular Biology. 31 (16), 3485-3496 (2011).
  40. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  41. Rossmann, K. Point spread-function, line spread-function, and modulation transfer function. Tools for the study of imaging systems. Radiology. 93 (2), 257-272 (1969).
  42. Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
  43. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  44. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  45. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  46. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  47. Teif, V. B., Rippe, K. Nucleosome mediated crosstalk between transcription factors at eukaryotic enhancers. Physical Biology. 8 (4), 044001(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ATPDNA
פענוח מנגנון מולקולרי של הרכבת היסטון בטכניקת מסך DNA
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.