המאמר מסביר כיצד להסיר באופן כירורגי עיניים מזחלי דגי זברה חיים כצעד ראשון לקראת חקירת האופן שבו קלט רשתית משפיע על צמיחת והתפתחות של טקטום אופטי. בנוסף, המאמר מספק מידע על הרדמה של זחלים, קיבוע וכריתת מוח, ולאחר מכן אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקלית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הסרת עיניים בזחלי דגי זברה חיים לבחינת גדילה והתפתחות תלויי עצבנות של מערכת הראייה
במאמר זה
סיכום
תקציר
דגי זברה מפגינים יכולות צמיחה והתחדשות יוצאות דופן לאורך כל החיים. לדוגמה, נישות מיוחדות של תאי גזע שהוקמו במהלך העובריות תומכות בצמיחה מתמשכת של מערכת הראייה כולה, הן בעין והן במוח. צמיחה מתואמת בין הרשתית לבין טקטום אופטי מבטיחה מיפוי רטינוטופי מדויק כאשר נוירונים חדשים מתווספים לעיניים ולמוח. כדי לענות על השאלה אם אקסונים של הרשתית מספקים מידע חיוני לוויסות התנהגויות של גזע טקטלי ותאי אב כגון הישרדות, התפשטות ו/או התמיינות, יש צורך להיות מסוגלים להשוות אונות טקטליות מופנמות ומנוכרות בתוך אותה חיה ובין בעלי חיים.
הסרה כירורגית של עין אחת מדגי זברה זחליים חיים ולאחר מכן תצפית על טקטום אופטי משיגה מטרה זו. הסרטון הנלווה מדגים כיצד להרדים זחלים, לחדד באופן אלקטרוליטי מחטי טונגסטן ולהשתמש בהם כדי להסיר עין אחת. לאחר מכן הוא מראה כיצד לנתח מוחות מזחלי דגי זברה קבועים. לבסוף, הסרטון מספק סקירה כללית של הפרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה והדגמה כיצד להרכיב עוברים מוכתמים באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה לצורך מיקרוסקופיה.
מבוא
מטרת שיטה זו היא לחקור כיצד קלט רשתית משפיע על הגדילה וההתפתחות של טקטום אופטי, מרכז העיבוד החזותי במוח דגי הזברה. על ידי הסרת עין אחת ולאחר מכן השוואת שני הצדדים של טקטום אופטי, ניתן לצפות ולנרמל שינויים טקטליים בתוך אותה דגימה, מה שמאפשר השוואה בין דגימות מרובות. גישות מולקולריות מודרניות בשילוב עם טכניקה זו יניבו תובנות על המנגנונים העומדים בבסיס הצמיחה וההתפתחות של מערכת הראייה, כמו גם על ניוון והתחדשות אקסונאלית.
מערכות חושיות - חזותיות, שמיעתיות וסומטוסנסוריות - אוספות מידע מאיברים חיצוניים ומעבירות את המידע הזה למערכת העצבים המרכזית, ויוצרות "מפות" של העולם החיצוני על פני המוח האמצעי 1,2
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
השיטות במאמר זה נערכו בהתאם להנחיות ולאישור הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של ריד קולג' ויוניברסיטי קולג' בלונדון. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על זני דגי זברה ששימשו במחקר זה.
1. הכינו חומרים וכלים
- הכינו פתרונות.
- הפוך את העובר לבינוני (E314) על ידי דילול מלאי של פי 60 (300 mM NaCl, 10.2 mM KCl, 20 mM CaCl 2-דיהידרט, ו-20 mM MgCl2-הקסהידרט במים שעברו דה-יוניזציה, אוטוקלאבים ומאוחסנים בטמפרטורת החדר). הוסיפו 160 מ"ל של 60x E3 עד 10 ליטר מים שעברו דה-יוניזציה. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
- צרו אגרוז נקודת התכה נמוכה של 1% (LMP)....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי לוודא אם הסרת העיניים הושלמה ולהעריך כיצד הטקטום האופטי משתנה, בוצעו ניתוחים בזן Tg[atoh7:RFP], המסמנת את כל ה-RGCs עם RFP ממוקד ממברנה, וכך גם את כל האקסונים המקרינים מהרשתית ויוצרים את עצב הראייה24. למרות ששימוש בזן זה אינו הכרחי לחלוטין, הוא מאפשר תצפית והדמיה פשוטה של עצב הראייה בנוירופיל טקטום אופטי. גישות אחרות לתיוג עצב הראייה, כגון מעקב אחר אקסון עם צבעי DiI ליפופיליים או DiO25,26 או תיוג מולטיספקטרלי עם brainbow
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הטכניקות המתוארות במאמר זה ממחישות אחת מגישות רבות לחקר התפתחות מערכת הראייה של בעלי חוליות בדגי זברה. חוקרים אחרים פרסמו שיטות לנתח את הרשתית העוברית ולבצע ניתוחי ביטוי גנים19 או לדמיין פעילות עצבית בטקטום אופטי30. מאמר זה מספק גישה לבחינת האופן שבו קלט רשתית דיפרנציאלי עשוי להשפיע על התנהגויות תאים בטקטום האופטי.
כדי להבטיח הכחדת עיניים מוצלחת והישרדות זחלים לאחר הניתוח, חשוב שהזחלים יהיו בריאים, מורדמים כראוי ומשותקים ב-1% אגרוז. חשוב גם שהמלק.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
המימון לעבודה זו נתמך בעיקר על ידי קרנות סטארט-אפ ממכללת ריד ל-KLC, קרנות מלגת המחקר של הלן סטאפורד ל-OLH, ומלגת מחקר מדעי של מכללת ריד ל-YK. פרויקט זה החל במעבדתו של סטיב וילסון כשיתוף פעולה עם משאבי אנוש, שנתמך על ידי סטודנטית של Wellcome Trust (2009-2014). אנו מודים למט וארגה, סטיב וילסון וחברים אחרים במעבדת וילסון על הדיונים הראשוניים על הפרויקט הזה, ואנו מודים במיוחד לפלורנסיה קאבודאסי וקייט אדוארדס, שהיו הראשונות שלימדו את KLC כיצד להרכיב עוברים באגרוס ולבצע ניתוחי מוח של דגי זברה. אנו מודים גם לגרטה גלובר ולג'יי יואינג על העזרה בהרכבת המכשיר שלנו להשחזת מחט טונגסטן.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ציוד ואספקה: | |||
| קופסאות גידול | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Dow Corning גריז ואקום גבוה | Sigma או ספק שווה ערך | Z273554 | |
| צלוחיות Erlenmeyer (125 מ"ל) | להכנת צלצולים מותאמים של מארק (MMR) עם אנטיביוטיקה לדגירה לאחר הניתוח. | ||
| מלקחיים עדינים - Dumont #5 | Fine Science Tools (FST) | 11252-20 | |
| פיפטות פסטר מזכוכית | DWK Lifescience | 63A53 & 63A53WT | לפיפטינג עוברים וזחלים. |
| שקופיות זכוכית למיקרוסקופיה | VWR או ספק שווה ערך | 48311-703 | ניתן להזמין שקופיות מיקרוסקופ זכוכית סטנדרטיות מספקי מעבדה רבים ושונים. |
| כלי זכוכית כולל בקבוקים מדורגים וצילינדרים מדורגים | לייצור ואחסון תמיסות. | ||
| חומרת ACE שרף אפוקסי 2 חלקים | או ספק שווה ערך אחר של Gorilla Glue או מזרק שווה ערך | של | 0.85 אונקיות |
| https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793 צינור מיקרוצנטריפוגה (1.7 מ"ל) | VWR או ספק שווה ערך | 22234-046 | |
| מחזיק סיכה מצופה ניקל (אורך 17 ס"מ) | כלי מדע עדינים (FST) | 26018-17 | להחזיק חוט טונגסטן בזמן השחזה וביצוע ניתוחים/דיסקציות. |
| מסננת תה רשת ניילון או שווה ערך | עלי אקספרס או שווה ערך | לקטיף ביצי דג זברה לאחר ההטלה; | |
| https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html מהדק | למכשיר להשחזת מחט טונגסטן. | ||
| צלחות פטרי 100 מ"מ | פישר ספק מדעי או שווה ערך | 50-190-0267 | |
| צלחות פטרי 35 מ"מ | ספק מדעי או שווה ערך | 08-757-100A | |
| משאבת פיפטה | SP Bel-Art או שווה ערך | F37898-0000 | |
| אשלגן הידרוקסיד (KOH) | סיגמא | 909122 | עבור מכשיר להשחזת מחט טונגסטן. הכינו תמיסה של 10% w/v של KOH במכסה המנוע על ידי הוספת כדורים למים נטולי יונים. |
| ספק כוח (מתח משתנה) | עבור מכשיר להשחזת מחט טונגסטן. כל ספק כוח עם מתח משתנה יעבוד (אפילו כזה המשמש לאלקטרופורזה בג'ל). | ||
| ערכת אלסטומר Sylgard 184 | Dow Corning | 3097358 | |
| (קוטר 0.125 מ"מ)World | Precision Instruments (WPI)TGW0515 | חידוד להסרת העין וניתוח זחלים. | |
| בלוק חום בטמפרטורה משתנה | מחסן המעבדה או ספק שווה ערך | BSH1001 או BSH1002 | מוגדר ל-40-42 מעלות; C לפני ניסויים. |
| צנצנת זכוכית עם פה רחב עם מכסה (למשל, ריבה נקייה או צנצנת סלסה) | למכשיר להשחזת מחט טונגסטן. | ||
| חוטים עם מובילי | למכשיר השחזת מחט טונגסטן. | ||
| <מיקרוסקופים חזקים>: מיקרוסקופ | |||
| מנתח | כל סוג יעבוד אך עדיף אור משודר מתכוונן על בסיס מראה. | ||
| קונפוקלי לסריקת לייזר | High NA, 20-25x טבילה במים עדשה אובייקטיבית מומלצת. תוכנת בקרת מיקרוסקופ ולכידת תמונות (NIS-Elements by Nikon) משמשת כאן אך כל מיקרוסקופ קונפוקלי יעבוד. | ||
| <חזק>ריאגנטים לניתוחים ודיסקציות: | |||
| סידן כלוריד דיהידראט | סיגמא | C7902 | עבור הצלצולים המותאמים של מארק (MMR) ומדיום העובר (E3). |
| HEPES | Sigma | H7006 | עבור הצלצולים המותאמים (MMR) של מארק. |
| נקודת התכה נמוכה agarose | Invitrogen | 16520-050 | מייצרים 1% במדיום עוברי (E3) או בצלצולים המותאמים של מארק (MMR). |
| מגנזיום כלוריד הקסהידראט | סיגמא | 1374248 | למדיום עוברי (E3). |
| מגנזיום גופרתי | Sigma | M7506 | עבור הצלצולים המותאמים של מארק (MMR). |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | לדלל 8% (w/v) מלאי עם 2x PBS מרוכז (מדולל ממלאי PBS פי 10). |
| פניצילין/סטרפטומיצין | סיגמא | P4333-20ML | מדלל 1:100 בצלצולים המותאמים של מארק. |
| טבליות מלח חוצץ פוספט (PBS) | Diagnostic BioSystems | DMR E404-01 | הכינו מלאי פי 10 במים נטולי יונים, חיטוי ואחסנו בטמפרטורת החדר. יש לדלל לריכוז עבודה פי 1. |
| אשלגן כלורי | Sigma | P3911 | עבור הצלצולים המותאמים של מארק (MMR) ומדיום העובר (E3). |
| נתרן כלורי | סיגמא | S9888 | עבור הצלצולים המותאמים של מארק (MMR) ומדיום העובר (E3). |
| נתרן הידרוקסיד | Sigma | S5881 | הכינו 10 M והשתמשו בו כדי להתאים את ה-pH של MMR ל-7.4. |
| סוכרוז | סיגמא | S9378 | |
| Tricaine-S | Pentair | 100G #TRS1 | מתכון: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE |
| <חזק>ריאגנטים לאימונוהיסטוכימיה: | |||
| Alexafluor 568 מתויג נוגדן משני לזיהוי ארנב IgG | Invitrogen | A-11011 | השתמש בדילול של 1:500 להרכבה שלמה אימונוהיסטוכימיה. |
| DAPI או ToPro3 | Invitrogen | 1306 או T3605 | מהווים תמיסות של 1 מ"ג/מ"ל ב-DMSO; דילול של 1:5,000 לצביעה נגדית. |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | Sigma | D8418 | מרכיב של מאגר אימונובלוק. |
| מתנול (MeOH) | Sigma | 34860 | ערבוב MeOH עם תמיסות מימיות כמו PBST הוא אקסותרמי. הכינו את פתרונות MeOH/PBST לפחות מספר שעות לפני הזמן או קררו אותם על קרח לפני השימוש. |
| סרום עיזים רגיל | ThermoFisher Scientific | 50-062Z | מרכיב של מאגר אימונובלוק. ניתן לצטט בנפחים של 1-10 מ"ל ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. |
| נוגדן ראשוני לזיהוי פוספוהיסטון H3 | Millipore | 06-570 | השתמש בדילול של 1:300 לאימונוהיסטוכימיה שלמה. |
| נוגדן ראשוני לזיהוי חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP; מזהה נגזרות dsRed) | MBL International | PM005 | השתמש בדילול של 1:500 לאימונוהיסטוכימיה שלמה. |
| פרוטאינאז K (PK) | Sigma | P2308-10MG | להרכיב תמיסות מלאי של 10 מ"ג/מ"ל ב-PBS ולהשתמש ב-10 ומיקרו; גרם/מ"ל. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | שימושי לייצור פתרון מלאי של 20% (v/v) ב-PBS. |
| <תוכנה חזקה>לניתוח נתונים | |||
| ImageJ (פיג'י) | תוכנה חינמית לניתוח תמונה; https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| תוכנה | חינמית לניתוח סטטיסטי והדמיית נתונים; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | ||
| Adobe Photoshop או GIMP | תוכנות עיבוד תמונה קנייניות (Adobe Photoshop ו-Illustrator) משמשות לעתים קרובות לחיבור דמויות). חלופה חינמית היא Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/) | ||
| Zebrafish זנים. מחקר זה השתמש בזני AB, TU, Tg[atoh7:RFP]. | זמין מ מרכזי משאבים בינלאומיים של דג הזברה בארה"ב (https://zebrafish.org/home/guide.php) או באירופה (https://www.ezrc.kit.edu/). ניתן לבקש זנים טרנסגניים מיוחדים שעדיין לא הופקדו באף אחד ממרכזי המשאבים ממעבדות בודדות לאחר הפרסום. |
מקורות
- Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).
- Cang, J., Feldheim, D. A. Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment. Annual Review of Neuroscience. 36
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
