אנו מציגים פרוטוקול לאפיון אלקטרופיזיולוגי של פוטופיגמנטים דו-יציבים: (1) ניצול תזוזות המטען בתוך מולקולות הפוטוגמנט בעקבות בליעת הפוטונים וכמותם העצומה בפוטורצפטורים, ו-(2) ניצול הבדלי הספיגה-ספקטרום של מצבי הפוטוגמנט של רודופסין ומטרהודופסין. פרוטוקולים אלה שימושיים לסינון מוטציות המשפיעות על מערכות פוטופיגמנט דו-יציבותיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטות אלקטרופיזיולוגיות למדידת רמות פוטופיגמנט בדרוזופילה פוטורצפטורים
במאמר זה
סיכום
תקציר
רודופסין פוטופיגמנט מצומד לחלבון G של דרוזופילה G (R) מורכב מחלבון (אופסין) ומכרומופור. תהליך ההפעלה של רודופסין מתחיל על ידי איזומריזציה הגורמת לספיגת פוטונים של הכרומופור, מקדמת שינויים קונפורמיים של האופסין וגורמת למצב פוטופיגמנט שני יציב כהה (metarhodopsin, M). חקירת פוטופיגמנט דו-יציב זה באמצעות מוטגנזה אקראית דורשת שיטות פשוטות וחזקות לסינון זבובים מוטנטיים. לכן, תוכננו מספר שיטות למדידת הפחתה ברמות הפוטופיגמנט התפקודיות. שיטה אחת כזו מנצלת את תזוזות המטען בתוך הפוטופיגמנט לאחר בליעת הפוטונים ואת הכמויות העצומות של מולקולות הפוטופיגמנט המבוטאות בפוטורצפטורים. אות חשמלי זה, המכונה פוטנציאל הקולטן המוקדם (או זרם הקולטן המוקדם), נמדד על ידי מגוון שיטות אלקטרופיזיולוגיות (למשל, אלקטרורטינוגרמה ורישומי תאים שלמים) והוא פרופורציונלי באופן ליניארי לרמות פוטופיגמנט תפקודיות. היתרונות של שיטה זו הם יחס האות לרעש הגבוה, מדידה ליניארית ישירה של רמות הפוטופיגמנט ועצמאות של מנגנוני פוטו-טרנסדוקציה במורד הזרם להפעלת רודופסין או מטרהודופסין. שיטה אלקטרופיזיולוגית נוספת הנקראת דפולריזציה ממושכת (PDA) מנצלת את היציבות הדו-כיוונית של פוטופיגמנט דרוזופילה ואת ההבדלים הקליטה-ספקטרליים של מצבי פיגמנט R ו-M של זבובים. ה-PDA מושרה על ידי אור כחול עז, הממיר כמויות רוויות של רודופסין למטרהודופסין, וכתוצאה מכך כישלון של סיום תגובת האור למשך זמן ממושך בחושך, אך ניתן לסיים אותו על ידי המרת מטרהודופסין לרודופסין באמצעות אור כתום עז. מכיוון שה-PDA הוא אות חזק שדורש המרת פוטופיגמנט מסיבית, אפילו פגמים קטנים בביוגנזה של הפוטופיגמנט מובילים לזיהוי בקלות של מחשב כף יד חריג. ואכן, מוטציות PDA פגומות הובילו לזיהוי חלבוני איתות חדשניים החשובים לפוטו-טרנסדוקציה.
מבוא
הרודופסין המופעל באמצעות אור (R), שהוא קולטן מצומד לחלבון G (GPCR), מורכב מחלבון 7 טרנס-ממברנה (opsin) וכרומופור. ב-Drosophila melanogaster (זבוב הפירות) ספיגת הפוטונים גורמת לאיזומריזציה של כרומופור הרשתית 11-cis-3-OH ל-all-trans-3-OH-רשתית1, מה שמקדם את השינוי הקונפורמי של הרודופסין למטרהודופסין (M, איור 1A). שלא כמו רודופסין של בעלי חוליות, החלק השולט של כרומופור חסרי חוליות אינו מתנתק מהאופסין, וכתוצאה מכך מצב הפיגמנט הכהה-יציב הפעיל מבחינה פיזיולוגית M. בתורו, ספיגת פוטון נוספת על ידי כרומופור הרשתית all-trans-3-OH גורמת לאיזומריזציה של הכרומופור 2,3
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. מדידת הקשר בין תגובת העוצמה, דה-פולריזציה ממושכת של האפטרפוטנציאל (PDA) ופוטנציאל הקולטן המוקדם (ERP) באמצעות האלקטרורטינוגרמה
- תנאי גידול מתאימים להכנת ד. מלנוגסטר
- העלאת זבובים D. melanogaster בבקבוקים המכילים תירס צהוב סטנדרטי המכיל מזון באינקובטור המתוחזק בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס ובמחזור חשוך/אור של 12 שעות
- שמור את בקבוקי הזבובים בחושך לפחות 24 שעות לפני הניסוי.
- הגדרה כללית
- הכינו פיפטות הקלטה על ידי משיכת נימי זכוכית בורוסיליקט מלאים בסיבים בגודל 1 מ"מ x 0.58 מ"מ (O.D x I.D) (איור 6L, O). ההתנגדות של הפיפטות צריכה להיות ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 2 מדגים את החוסן והקלות של השימוש בטכניקת ERG. הוא חזק משום שהוא נרשם בזבוב הכמעט שלם על ידי טכניקה פשוטה של הקלטות מתח חוץ-תאיות הדורשות מערך אלקטרופיזיולוגי פשוט. החוסן מתבטא בהשגת הקלטות של תגובות אור עם משרעת גדולה יחסית (בטווח המיליוולט) גם כאשר מוטציות מפחיתות או מעוותות מאוד את תגובת האור. לכן, אפילו נסיינית חסרת ניסיון יכולה להשתמש במערך הניסוי הפשוט ביותר וללמוד כיצד להשיג תוצאות משמעותיות תוך מספר ימים. המטרה העיקרית של הטכניקה שנועדה למדוד רמות פוטופיגמנט מושגת על ידי שיטות פ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
היתרון העיקרי של שימוש בהכנת הפוטורצפטור של Drosophila הוא הנגישות שלו, הקלות והדיוק של גירוי האור, והכי חשוב, היכולת ליישם את העוצמה של הגנטיקה המולקולרית7. מחקרים גנטיים נרחבים ביססו את Drosophila כמערכת מודל שימושית ביותר לניתוח גנטי של תהליכים ביולוגיים מורכבים7. המבנה הפשוט יחסית של הגנום של דרוזופילה (המורכב מארבעה כרומוזומים בלבד, כולל כרומוזומי המין X ו-Y, שני יסודות אוטוזומליים גדולים יותר, כרומוזומים 2 ו-3, והכרומוזום הרביעי של הנקודה הק.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הישראלית למדע (ISF) ומהקרן הדו-לאומית למדע ארצות הברית-ישראל (BSF). אנו מודים למר אנטולי שאפוצ'ניקוב על בניית מחמם השעווה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מזרק 1 מ"ל עם קצה | איור 6M | ||
| 1 פינצטה | Dumont #5, סטנדרטי | 0.1 מ"מ x 0.06 מ"מ, אורך 110 מ"מ, Inox (איור 6H) | |
| 2 עדשות | |||
| ממיר A/D | מכשיר מולקולרי | Digidata 1200 | החלפה אפשרית: כל digidata ממכשירים מולקולריים (למשל 1440A) -מגבר |
| איור 7Cאלקטרוניקה | החלפה אפשרית: מכשירי וורנר - IE251A או IE-210 (מגיע עם במת ראש)- איור 7D | ||
| שולחן נגד רעידות | ניופורט | VW-3036-OPT-01 | איור 7H |
| נימים | מכשירי הרווארד | נימי זכוכית בורוסיליקט | 1 מ"מ x 0.58 מ"מ (איור 6O) |
| תוכנת | מכשיר | ||
| Clampex CO2 טנק | |||
| מקור אור קר | Schott | KL1500 LCD | איור 6C |
| מגבים עדינים | Kimtech | Kimwipes (איור 6K) | |
| אלקטרודה | מתאים לOD נימי 1 מ"מ (איור 6N, איור 7N ואיור 7P) | ||
| כלוב פאראדיי | תוצרת | ווילון קדמי שחור (איור 7K) | |
| מסנן (צבע) | שוט | OG590, מסנן קצה | איור 7S |
| מסנן (צבע) | Schott | BP450/40 ננומטר | מסנן איור 7S |
| (צבע) | בלייזרים | 550 ננומטר | איור 7S |
| מסנן (צבע) למקור אור קר | Schott | RG630 | איור 6C |
| מסנן (חום) | Schott | KG3 | איור 7S |
| מסננים (ניטרלי מסנן צפיפות) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | איור 7S |
| מערכת מנורות הבזק | Honeywell | איור 7U | |
| מערכת שינה זבוב עם מזרק | הזרקה + מתטי | איור 6A-B | |
| ספק כוח מנורה | PTI | LPS-220 | איור 7W |
| גלאי אור | פוטו-טרנזיסטור | תוצרת | |
| מדריך אור | קוטר 3 מ"מ, אורך 1.3 מ' (איור 7L,M) | ||
| מקור | מנורת קסנון 75 W נטולת אוזון בלחץ גבוה (פועלת על 50 W), החלפה אפשרית: מחקר Cairn- OptoLED (איור 7R) | ||
| שעווה נמסה בטמפרטורה נמוכה | תוצרת | מורכב מתערובת של שעוות דבורים (Tm≈ 62 & deg; C) ופרפין ב-~3:1 כדי להגיע לטמפרטורת התכה של ~55– 56 & deg; C (איור 6J) | |
| מעמד מגנטי לזבובים | תוצרת | איור 6I ואיור 7Q | |
| מערכת מגבר קדם מיקרואלקטרודה עם שלב ראש | אלקטרוניקה | בודק עכבה (איור 7G) | |
| מיקרומניפולטור (גס מכני) | Tritech Research, Narishige | M-2 | |
| מיקרומניפולטור (עדין מכני) | Leitz Microsystems | Leitz מיקרומניפולטור מכני | איור 7F |
| pCLAMP | תוכנת מכשיר | ||
| צלחת | 60 מ"מ | ||
| מחולל דופק | AMPI | Master 8 | איור 7A |
| קרם Redux לאלקטרוקרדיוגרפיה | מעבדות פרקר | Redux אלקטרוליט Crè אני | |
| נהג תריס | Uniblitz, Vincent Associates | VCM-D1 חד ערוץ חד יציב | דמות 7V |
| מערכת תריס | Uniblitz, Vincent Associates | LS2 2 מ"מ תריסים חד יציבים | דמות 7V |
| חוט כסף | וורנר אינסטרומנטס | 0.25– קוטר 1 מ"מ, צריך להיות כלוריד | |
| ברזל הלחמה המורכב מחוט | בקוטר 0.25 מ"מ (איור 6F) | ||
| מיקרוסקופ זום סטריאוסקופי | Nikon | SMZ-2B | איור 6D |
| זום סטריאוסקופי מיקרוסקופ | Wild | Wild M5 | עם 6, 12, 25 ו-50 הגדרות הגדלה (איור 7E) |
| מסנני מזרק | Millex | 22 ומיקרו; m מסנן PVDF | |
| חולץ פיפטה אנכי | Sutter / Narishige | דגם P-97 / PP-830 | השתמש במושך אנכי או אופקי, לפי העדפה (איור 6L) |
| מחמם נימה שעווה | תוצרת | ראה איור S1 (איור 6E-G) | |
| מערכת מנורת הבזק קסנון | ד"ר ראפ אופטואלקטרוניקה | JML-C2 | איור 7X |
מקורות
- Vogt, K., Kirschfeld, K. Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment. Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).
- Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability. Physiological Reviews....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
