במאמר זה אנו מתארים טכניקה חדשה ומהירה המדמה פגיעה בחוט השדרה הפתוח בחולדות ומבטלת כריתת למינקטומיה. המיסקציה צידית מבוצעת תוך כדי צפייה דרך מיקרוסקופ. הטכניקה היא רב-תכליתית וניתן להשתמש בה גם באזורים הצוואריים, החזה והמותניים של חוט השדרה של בעלי חיים אחרים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
טכניקת המיסקציה צידית זעיר פולשנית ומהירה של חוט השדרה למידול פגיעות בעמוד השדרה הפתוח בחולדות
במאמר זה
סיכום
תקציר
טכניקות פציעה פתוחות בחוט השדרה המדימות פציעות דמויות חתך גוזלות זמן רב ופולשניות מכיוון שהן כרוכות בכריתת למינקטומיה. טכניקה חדשה זו מבטלת למינקטומיה על ידי הסרת שני תהליכים בעמוד השדרה והרמה, ולאחר מכן הטיית קשת החוליות הקאודלית. אזור הניתוח נפתח ללא צורך בלמינקטומיה. לאחר מכן מבוצעת המיסקציה צידית עם שליטה גלויה ישירה תחת מיקרוסקופ. הטראומה ממוזערת, ודורשת רק פצע עצם קטן.
טכניקה זו יש כמה יתרונות: זה מהר יותר, ולכן, פחות נטל עבור החיה, ואת פצע העצם הוא קטן יותר. מכיוון שכריתת הלמינקטומיה מסולקת, יש פחות סיכוי לפגיעה לא רצויה בחוט השדרה, ואין רסיסי עצם שיכולים לגרום לבעיות (שברי עצם המוטבעים בחוט השדרה יכולים לגרום לנפיחות ולנזק משני). תעלת החוליות נותרה שלמה. המגבלה העיקרית היא שהמיסקציה יכולה להתבצע רק בחללים הבין חולייתיים.
התוצאות מראות כי טכניקה זו יכולה להתבצע הרבה יותר מהר מאשר הגישה הכירורגית המסורתית, באמצעות למינקטומיה (11 דקות לעומת 35 דקות). טכניקה זו יכולה להיות שימושית עבור חוקרים העובדים עם מודלים של בעלי חיים של פגיעה בחוט השדרה הפתוח מכיוון שהיא ניתנת להתאמה נרחבת ואינה דורשת מכשור מיוחד נוסף.
מבוא
פגיעות בעמוד השדרה (SCIs) הן למרבה הצער פציעות שכיחות בבני אדם. SCIs יכול להיות מסובך בדרכים שונות, למשל, על ידי זיהומים, וזה חשוב מבחינה קלינית לחקור את הפציעות האלה1. מכיוון שאין תרופה אחת ודאית למדעים, עדיין נדרשים מודלים של בעלי חיים כדי לקדם את ההבנה של חוקרים ולקדם טיפולים אפשריים 2,3. למרות שפציעות סגורות הן המודל הנפוץ ביותר (דחיסה וחבלה), חשוב מבחינה קלינית להבין חתכים, אשר ניתן למדל רק פציעות פתוחות4. מודלים של פצע פתוח באמצעות טרנסקציה או המיסקציה יכולים לשמש להדגמת לוקליזציה מדויקת יותר של פצע בהשוואה למודלים של פציעה סגורה, בשל אופי הפציעה (חבלה לעומת חתך ניתוחי). ניסויים בפצע פתוח יכולים לשפוך אור על פגיעות עצביות ספציפיות יותר בדרך מבוקרת, אמינה וניתנת לשכפול5. הטרנסקציה המלאה או החלקית של חוט השדרה היא טכניקה נפוצה של פצע פתוח וניתן לראות אותה בפירוט במאמר של בראון ומרטינז6.
כאשר חקרו פגיעה בחוט השדרה הפתוח בחולדות, מספר בעלי חיים הציגו בעיות שעלו מהניתוח: רסיסי עצם מכריתת הלמינקטומיה הוטמעו בחוט השדרה וגרמו לנפיחות; פצע העצם הגדול יותר נזקק לזמן רב כדי להחלים; הניתוח ארך זמן רב מדי. טכניקה כירורגית חלופית פותחה כדי למנוע בעיות אלה. המטרה הייתה לפתח טכניקה מהירה יותר, עדינה יותר עבור החיה. טכניקה חדשה זו שפותחה היא הרבה יותר מהירה מאשר טכניקות SCI מסורתיות. הגישה הניתוחית היא זעיר פולשנית, וכתוצאה מכך פצע עצם קטן יותר תוך ביטול בעיות הנובעות מכריתת הלמינקטומיה.
כל טכניקות הפצע הפתוח כוללות פתיחת דורה7. מספר מחקרים שנערכו לאחרונה בחנו טכניקות שונות שפותחו לאחרונה, במטרה לשפר את השיטות הקודמות 8,9. למרות שלא ניתן לשלול את פתיחת הדורה באמצעות טכניקה חדשה זו, היא גורמת לפצע קטן יותר בדורה תוך שהיא מציעה פגיעה אמינה ומבוקרת בחוט השדרה. תוך התייעצות עם הספרות על טכניקות פגיעה בחוט השדרה, מחברים רבים ניסו למזער את זמן הניתוח על ידי יישום שינויים קלים בטכניקה המקורית10. Laminectomy הוא תמיד חלק מהליכים כירורגיים אלה, אם כי זה זמן רב ודורש פצע עצם גדול יותר להיעשות6. טכניקה כירורגית זו יכולה להתאים לחוקרים המשתמשים במודלים של פגיעה בחוט השדרה בפצע פתוח, במיוחד טרנסקציה מלאה או המיסקציה צידית המבוצעת בחללים הבין חולייתיים (איור 1).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לדירקטיבה של האיחוד האירופי (2010/63/EU) ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים של המשרד הלאומי ההונגרי לבטיחות שרשרת המזון (PEI/001/2894-11/2014). כל התקנות המוסדיות והממשלתיות הרלוונטיות בנוגע לשימוש אתי בבעלי חיים בוצעו במהלך מחקר זה.
1. הכנה לפני הניתוח
- יש לעקר את כל המכשירים בהם נעשה שימוש במהלך ההליך (ראו טבלת חומרים) ולחטא את המשטחים בהם יש לבצע את העבודה לפני ההליך.
- הזריקו מנה אחת של אנטיביוטיקה תת עורית באופן מניעתי.
הערה: עיין בטבלת החומרים לפרטים על מינון האנטיביוטיקה. - השאירו את בעלי החיים בחדר הניתוח למשך שעה אחת כדי להתאקלם ולהפחית את הלחץ שלהם לפני הניתוח.
- הרדימו את החולדה באמצעות הזרקה תוך שרירית של שילוב של קטמין וקסילזין (קטמין 80 מ"ג/ק"ג משקל גוף (bw) וקסילזין 8 מ"ג/ק"ג bw).
הערה: בנוסף להרדמה,שילוב k etamine-xylazine מספק משככי כאבים מספיקים עבור הליך זה. ניתן לשנות את משטר שיכוך הכאבים בהתאם להנחיות המוסדיות לשימוש בבעלי חיים. - שמור על חום החולדה במהלך ההליך באמצעות שולחן מחומם או אור אינפרא אדום ושמור על לחות העיניים לאורך כל ההרדמה באמצעות משחה אופתלמית (יש למרוח שוב לפי הצורך).
- מקבעים את בעל החיים על שולחן הניתוחים באמצעות סרט כירורגי על כפותיו וזנבו הקדמיים והאחוריים, ובהתאם למקום הפציעה, גם על הצוואר. במידת הצורך, הניחו את החולדה במסגרת סטריאוטקסית כדי לייצב אותה במהלך הניתוח.
- באמצעות תפר כירורגי סטרילי, הניחו לולאה סביב השיניים הקדמיות העליונות של החולדה וקיבעו אותה על קצה שולחן הניתוחים.
- משוך את הלשון הצידה לניהול דרכי הנשימה.
- יש לגלח את הפרווה שעל הגב, לפחות 2 ס"מ לכל כיוון שבו יבוצע החתך.
- לחטא את העור של האזור הכירורגי לפחות שלוש פעמים, באמצעות פתרון יוד povidone וגזה סטרילית. הקפידו במיוחד להשרות את הפרווה המקיפה את האזור. אבטחו את אתר הניתוח בעזרת שפשוף סטרילי.
- להעריך את הלימות ההרדמה לפני ביצוע החתך הראשון על ידי צביטת הבהונות ואת הזנב של החיה. המשך לעקוב אחר נאותות ההרדמה במהלך כל ההליך.
2. ניתוח
- יש להניח את חתך העור באמצעות להב אזמל 20. כדי לפתוח את אזור הניתוח, יש לבצע חתך באורך 2-2.5 ס"מ לאורך עמוד השדרה, תוך חיתוך כל שכבות העור. מקם חתך זה במקביל לעמוד השדרה באמצעות חוליית L1 כנקודת אמצע, מה שהופך אותו להאריך ~ 1 ס"מ הן בכיוון הגולגולתי והן בכיוון הקאודלי לאורך עמוד השדרה.
- גייסו את צידי הפצע על ידי חיתוך דרך רקמת החיבור המקיפה את השרירים.
- מניחים שני חתכים מקבילים לאורך עמוד השדרה, חודרים את periosteum. מקמו את החתכים ממש ליד תהליכי עמוד השדרה משני הצדדים, על פני המרחק בין חוליות Th13 ו-L1.
- לנתח את השרירים המחוברים לחוליות בעזרת raspatorium עד שכל רצועות עמוד השדרה גלויות. שים במקום retractor.
- הסר את תהליכי עמוד השדרה של חוליית בית החזהה - 13 והחוליה המותניתהראשונה באמצעות מלקחיים עצם שיניים כדי לדמיין את האזור הכירורגי כולו. להלן, שלוט בהליך על ידי צפייה בתמונה מיקרוסקופית מוגדלת (4x-16x).
- השתמש בגזה סטרילית כדי לשלוט בדימום לאורך כל ההליך, בעת הצורך.
- הרימו בזהירות את שארית תהליכי עמוד השדרה L1, והגביהו את קשת חוליות L1. נתק את הליגמנטום פלבום כדי לגשת לחוט השדרה. העלה את תהליכי עמוד השדרה הקאודליים עוד יותר, ומאפשר גישה לדורה מאטר עמוד השדרה, שגם הוא נקטע. הטה את תהליכי עמוד השדרה הקאודליים בכיוון הגולגולת כדי לדמיין את ה- pia mater.
- הסתכלו דרך הפייה מאטר על הווריד החציוני האחורי, המציג לראווה את קו האמצע של עמוד השדרה.
- באמצעות הווריד כדו-כיווני, יש לבצע חתך באמצעות אזמל מיקרוכירורגי תוך חסכון בווריד. מניחים את החתך מתחת לווריד, במישור הרוחבי דרך הקוטר הקדמי של חוט השדרה. חתכו מחצית מחוט השדרה על ידי הזזת הלהב לרוחב מקו האמצע.
הערה: החתך הוא חד צדדי, בצד ימין, בקטע המותניהרביעי . - נסה למקם את החתך כדי למנוע חיתוך עורק עמוד השדרה הקדמי. ודא שלא מופעל לחץ עודף על גוף החוליה בעת חיתוך חוט השדרה כדי לחסוך את עורק עמוד השדרה הקדמי בצד הגחוני של חוט השדרה.
איור 1: גרפיקה שמראה את השלבים של טכניקת SCI פתוחה חדשה בחולדות. (A) החוליות החשופות. (B) תהליכים בעמוד השדרה שהוסרו (Th13 ו-L1). (C) קשת החוליות המורמת והמוטה של חוליית L1. (D) המיסקציה המבוצעת בצד ימין, כאשר חוט השדרה החצוי מוצג בנפרד, מוגדל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
- אין לסגור את הדורה מאטר ישירות במהלך סגירת הפצע. תפר בחוזקה (גודל תפר 4-0) את השרירים לאורך תהליכי עמוד השדרה, תוך סגירה עקיפה של הפצע הקטן בדורה מאטר.
- סגור את שכבת רקמת החיבור הגבית עם תפרים.
- לבסוף, תפרו את העור סביב אתר החתך.
3. טיפול ומעקב לאחר הניתוח
- אפשרו לבעלי החיים להתעורר בכלוביהם. שמרו על חום בעלי החיים באמצעות מנורת חום בנוסף לחדר עם בקרת טמפרטורה. אל תשאירו את החולדות לבד לאחר שהן מתעוררות לאחר הניתוח, ואל תשימו אותן יחד עם חולדות אחרות באותו כלוב.
- עקוב אחר קצב הנשימה שלהם לפחות כל 10 דקות עד שהם ערים לחלוטין. במידת הצורך, יש למרוח גירוי עדין (למשל, לשפשף את הראש) כדי לסייע להתעוררותם מההרדמה.
- כאשר בעלי החיים ערניים ופעילים כראוי, העבירו אותם בבטחה חזרה לבית החיות.
- שמרו על החולדות תחת מעקב צמוד במשך 24 השעות הראשונות לאחר הניתוח. לאחר 24 השעות הראשונות לאחר הניתוח, יש לבדוק את בעלי החיים לפחות פעמיים ביום עד לסיום הניסוי, תוך מעקב אחר סימני מצוקה.
- העריכו אותם ביסודיות פעם ביום לאיתור סימני מצוקה באמצעות פרוטוקול רווחת בעלי החיים המוסדי הרלוונטי והקפידו במיוחד לבדוק את פצעיהם לאיתור סימני זיהום ודלקת.
הערה: מתח וזיהום משפיעים על רווחת בעלי החיים ועל תוצאות הניסויים. - מתן אנטיביוטיקה תת עורית כל יום עד סוף הניסויים. החזיקו את בעלי החיים בכלובים סטריליים, חיה אחת בכל כלוב, ותנו מזון ומים עד הבית, כמו קודם. בתום הניסויים (או אם נצפתה תגובה שלילית חמורה במהלך פרק הזמן של הניסוי), יש להרדים את בעלי החיים באופן הומני, בהתאם לפרוטוקול המוסדי הרלוונטי לרווחת בעלי חיים.
הערה: כאן, בעלי החיים הומתו (בשינה עמוקה הנגרמת על ידי שילוב של קטמין-קסילזין) על ידי מתן זילוח מלח פיזיולוגי (1/3 מ"ל / גרם bw) ואחריו זילוח פרפורמלדהיד 4% (1 מ"ל / גרם bw).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לאחר ההמיסקציה, החולדות מראות שיתוק בגפה האחורית האיפסילטרלית (הוכחה in vivo להמיסקציה מוצלחת). הערכת דגימה יסודית יכולה להיעשות רק לאחר הסרת חוט השדרה (ראו איור 2, שם ניתן לראות את חוט השדרה שהוסר הן מהצד הגחוני והן מהצד הגבי).
איור 2: מבט גחוני וגבי על חוט השדרה שהוסר לאחר המיסקציה. כל חוט ה...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
טכניקת פגיעה זעיר פולשנית זו בחוט השדרה פותחה כאשר חקרו חולדות פגועות חוט שדרה, והצוות התמודד עם בעיות הנובעות מהניתוח עצמו (שברי עצם מכריתת הלמינקטומיה הגורמים לדחיסה ופגיעה בחוט השדרה, ניתוח שלוקח זמן רב מדי, ריפוי איטי של פצע עצם גדול). על ידי ביטול כריתת הלמינקטומיה, ההליך הפך הרבה יותר מהיר (11 דקות לעומת 35 דקות), מבנה תעלת החוליות נשאר שלם, פצע העצם היה קטן בהרבה, ולא היו שברי עצם שיכולים לפגוע בחוט השדרה.
לא ניתן לבטל את הסרת התהליכים השדרתיים מכיוון שהסרת התהליך הספינוסי העליון (גול...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים ידועים או קשרים אישיים שיכלו להשפיע לכאורה על העבודה המדווחת במאמר זה.
תודות
המחברים מבקשים להודות לגרגלי אנגיאן על יצירת האמנות המקורית. מחקר זה מומן על ידי אוניברסיטת זמלווייס בבודפשט, הונגריה. מחקר זה נתמך גם על ידי התוכנית ההונגרית לפיתוח משאבי אנוש (EFOP-3.6.2-16-2017-00006). תמיכה נוספת התקבלה מתוכנית המצוינות התמטית (2020-4.1.1.-TKP2020) של משרד החדשנות והטכנולוגיה בהונגריה, במסגרת התוכנית התמטית הטיפולית של אוניברסיטת סמלווייס.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אוגמנטין (1,000 מ"ג/200 מ"ג אבקה) | GlaxoSmithKline, בריטניה | מינון חד פעמי של אנטיביוטיקה s.c. באופן מניעתי (10 מ"ג אמוקסיצילין ו-2 מ"ג חומצה קלבולנית; אבקת אוגמנטין 1,000 מ"ג/200 מ"ג). בכל יום לאחר הניתוח, 10 מ"ג אמוקסיצילין ו-2 מ"ג חומצה קלבולנית (אוגמנטין 1,000 מ"ג/200 מ"ג אבקה) ליום לבעל חיים | |
| בטדין | EGIS, הונגריה | חיטוי עור אזור הניתוח באמצעות תמיסת פובידון-יוד | |
| קליפסול (50 מ"ג/מ"ל) | ריכטר גדעון, הונגריה | <חזק>הרדמה: שילוב של קטמין 80 מ"ג/ק"ג וקסילזין 8 מ"ג/ק"ג תוך שרירי | |
| CP XYLAZIN 2% (20 מ"ג/מ"ל) | Produlab Pharma B.V., הולנד | <חזק>הרדמה: שילוב של קטמין 80 מ"ג/ק"ג וקסילזין 8 מ"ג/ק"ג תוך שרירי | |
| מלקחיים עצם | דנטליים Dentech, הונגריה | BS 0127 | הסר את התהליכים הקוצניים של חוליית בית החזה ה<>13 והחוליה המותנית 1st באמצעות מלקחיים דנטליים |
| כירורגיים מיקרו-מוטוריים | W& H, אוסטריה | MF-TECTORQUE | באמצעות מיקרו-מנוע כירורגי דנטלי, מבוצעת כריתת למינקטומיה במיקרוסקופ האופטי של חוליה L1 |
| צייס, גרמניה | OPMI19-FC | שלוט בהליך על ידי צפייה בתמיסת מלח פיזיולוגית מיקרוסקופית מוגדלת (הגדלה פי 16) | |
| (0.9% NaCl) | Fresenius Kabi, גרמניה | שמור על עיני החולדה לחות לאורך כל ההרדמה באמצעות טיפות תמיסת מלח פיזיולוגיות (יש למרוח מחדש לפי הצורך) | |
| raspatorium | Dentech, Hungary | FK 1164 | נתח את השרירים המחוברים לחוליות בעזרת רספטוריום, עד שכל רצועות עמוד השדרה נראות לעין. |
| retractor | Dentech, הונגריה | RT 1253 | |
| אזמל | Dentech, הונגריה | BB 173 | |
| אזמל | Dentech, הונגריה | BB 184 | |
| להב אזמל 12 | B. בראון, גרמניה | 12 | |
| להב אזמל 20 | B. בראון, גרמניה | 20 | |
| גזה חתוכה סטרילית 10 x 10 ס"מ | Sterilux, הרטמן, גרמניה | ||
| תפרים (מונופילמנט, סינטטי; נספג ולא נספג), גודל: 4-0 | B. בראון, גרמניה | ||
| פינצטה (13 ס"מ) | דנטק, הונגריה | BD 1555 | |
| פינצטה (מלקחיים עדינים לרקמות) | דנטק, הונגריה | BD 1670 |
מקורות
- Failli, V., et al. Functional neurological recovery after spinal cord injury is impaired in patients with infections. Brain. 135, Pt 11 3238-3250 (2012).
- Guan, B., Chen, R., Zhong, M., Liu, N., Chen, Q. Protective effect of Oxymatrine against acute spinal cord injury in rats via modulating oxidative stress, inflammation and apoptosis. Metabolic Brain Disease. 35 (1), 149-157 (2020).
- Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: from pathology to potential therapies. Disease Models & Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
- Minakov, A. N., Chernov, A. S., Asutin, D. S., Konovalov, N. A., Telegin, G. B. Experimental models of spinal cord injury in laboratory rats. Acta Naturae. 10 (3), 4-10 (2018).
- Borbély, Z., et al. Effect of rat spinal cord injury (hemisection) on the ex vivo uptake and release of [3H]noradrenaline from a slice preparation. Brain Research Bulletin. 131, 150-155 (2017).
- Brown, A. R., Martinez, M. Thoracic spinal cord hemisection surgery and open-field locomotor assessment in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59738(2019).
- Taoka, Y., Okajima, K. Spinal cord injury in the rat. Progress in Neurobiology. 56 (3), 341-358 (1998).
- Hou, S., Saltos, T. M., Iredia, I. W., Tom, V. J. Surgical techniques influence local environment of injured spinal cord and cause various grafted cell survival and integration. Journal of Neuroscience Methods. 293, 144-150 (2018).
- Mattucci, S., et al. Development of a traumatic cervical dislocation spinal cord injury model with residual compression in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 322, 58-70 (2019).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324(2019).
- Ashammakhi, N., et al. Regenerative therapies for spinal cord injury. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 25 (6), 471-491 (2019).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
