Method Article

לוקליזציה של גורם תא יחיד בכרומטין באמצעות מחשוף קלט אולטרה-נמוך תחת יעדים ושחרור באמצעות נוקלאז

DOI:

10.3791/63536

⸱

February 1st, 2022

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CUT&RUN והוריאנטים שלה יכולים לשמש לקביעת תפוסת החלבון בכרומטין. פרוטוקול זה מתאר כיצד לקבוע לוקליזציה של חלבון על כרומטין באמצעות uliCUT&RUN של תא יחיד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קביעת המיקומים המחייבים של חלבון על כרומטין חיונית להבנת תפקידו ויעדיו הרגולטוריים הפוטנציאליים. כרומטין אימונופרציפיטציה (ChIP) היה תקן הזהב לקביעת לוקליזציה של חלבון במשך למעלה מ -30 שנה ומוגדר על ידי שימוש בנוגדן כדי לשלוף את חלבון העניין מכרומטין sonicated או מתעכל אנזימטית. לאחרונה, טכניקות קשירת נוגדנים הפכו פופולריות להערכת לוקליזציה של חלבון על כרומטין בשל הרגישות המוגברת שלהם. מחשוף תחת מטרות & שחרור תחת נוקלאז (CUT&RUN) הוא נגזרת רחבת הגנום של Immunocleavage כרומטין (ChIC) ומשתמש חלבון רקומביננטי A קשור לנוקלאז מיקרוקוקאלי (pA-MNase) כדי לזהות את האזור הקבוע IgG של הנוגדן מיקוד חלבון של עניין, ובכך מאפשר מחשוף ספציפי לאתר של ה- DNA מאגף את החלבון של עניין. ניתן להשתמש ב- CUT&RUN כדי ליצור פרופיל לשינויים בהיסטון, גורמי שעתוק וחלבונים מחייבי כרומטין אחרים כגון גורמי שיפוץ נוקלאוזום. חשוב לציין, CUT&RUN יכול לשמש כדי להעריך את הלוקליזציה של חלבונים הקשורים euchromatic או הטרוכרומטיים ושינויים histone. מסיבות אלה, CUT&RUN היא שיטה רבת עוצמה לקביעת פרופילי האיגוד של מגוון רחב של חלבונים. לאחרונה, CUT&RUN עברה אופטימיזציה ליצירת פרופילים של גורמי שעתוק באוכלוסיות נמוכות של תאים ותאים בודדים והפרוטוקול הממוטב נקרא CUT&RUN של קלט נמוך במיוחד (uliCUT&RUN). כאן, פרוטוקול מפורט מוצג עבור פרופיל גורם תא יחיד באמצעות uliCUT&RUN בתבנית ידנית 96-well.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבונים גרעיניים רבים פועלים על ידי אינטראקציה עם כרומטין כדי לקדם או למנוע פעילויות בתבנית DNA. כדי לקבוע את הפונקציה של חלבונים אלה כרומטין אינטראקציה, חשוב לזהות את המיקומים הגנומיים שבהם חלבונים אלה קשורים. מאז התפתחותו בשנת 1985, אימונופרציפציה כרומטין (ChIP) היה תקן הזהב לזיהוי היכן חלבון נקשר לכרומטין 1,2. לטכניקת ChIP המסורתית יש את זרימת העבודה הבסיסית הבאה: תאים נקצרים ומקושרים (בדרך כלל עם פורמלדהיד), כרומטין הוא גזירה (בדרך כלל עם שיטות sonication קשות, המחייבות crosslinking), החלבון של עניין הוא immunoprecipitated באמצעות נוגדן המכוון החלבון (או חלבון מתויג) ואחריו נוגדן משני (בשילוב אגרוזים או חרוזים מגנטיים), crosslinking הוא הפוך, חלבון ורנ"א מתעכלים כדי לטהר DNA, ו- CHIP מועשר-DNA זה משמש כתבנית לניתוח (באמצעות בדיקות עם תווית רדיו 1,2, qPCR3, מיקרו-אריות 5,6, או רצף4). עם הופעתם של מיקרו-ערים ורצף עמוק מקביל מאסיבי, צ'יפ-צ'יפ-צ'יפ 5,6 ו-ChIP-seq4 פותחו לאחרונה ומאפשרים זיהוי כללי של לוקליזציה של חלבונים בכרומטין. Crosslinking ChIP הייתה טכניקה רבת עוצמה ואמינה מאז הופעתה עם התקדמות משמעותית ברזולוציה על ידי ChIP-exo7 ו ChIP-נקסוס8. במקביל להתפתחות של ChIP-seq, פרוטוקולים מקוריים (ללא crosslinking) עבור ChIP (N-ChIP) הוקמו, אשר משתמשים בעיכול נוקלאז (לעתים קרובות באמצעות נוקלאז מיקרוקוקאלי או MNase) כדי לפצל את הכרומטין, בניגוד sonication המבוצע בטכניקות ChIP crosslinking מסורתיות9. עם זאת, חיסרון מרכזי אחד הן בהצלבה של טכנולוגיות ChIP והן בטכנולוגיות N-ChIP היה הדרישה למספרי תאים גבוהים עקב תפוקת דנ"א נמוכה בעקבות המניפולציה הניסיונית. לכן, בשנים האחרונות, מאמצים רבים היו לקראת אופטימיזציה של טכנולוגיות ChIP עבור קלט תא נמוך. מאמצים אלה הביאו לפיתוח טכנולוגיות רבות עוצמה המבוססות על ChIP המשתנות בדרישות הישימות והקלט שלהן 10,11,12,13,14,15,16,17,18. עם זאת, טכנולוגיות מבוססות ChIP-seq חד-תאיות חסרות, במיוחד עבור חלבונים שאינם histone.

בשנת 2004 פותחה טכנולוגיה חלופית כדי לקבוע את תפוסת החלבון על כרומטין המכונה מחשוף כרומטין אנדוגני (ChEC) ו כרומטין Immunocleavage (ChIC)19. טכניקות לוקוס בודדות אלה משתמשות בהיתוך של MNase לחלבון העניין (ChEC) או לחלבון A (ChIC) לחיתוך ישיר של DNA הסמוך לחלבון העניין. בשנים האחרונות, הן ChEC והן ChIC עברו אופטימיזציה ליצירת פרופיל חלבון רחב גנום על כרומטין (ChEC-seq ו- CUT&RUN, בהתאמה)20,21. בעוד ChEC-seq היא טכניקה רבת עוצמה לקביעת לוקליזציה של גורמים, היא דורשת פיתוח חלבוני MNase-היתוך עבור כל מטרה, ואילו ChIC והווריאציה הרחבה של הגנום שלה, CUT&RUN, מסתמכים על נוגדן המכוון לחלבון העניין (כמו עם ChIP) וחלבון רקומביננטי A-MNase, שבו חלבון A יכול לזהות את האזור הקבוע IgG של הנוגדן. כחלופה, פותח חלבון היתוך A/Protein G-MNase (pA/G-MNase) שיכול לזהות מגוון רחב יותר של אזורים קבועים נוגדנים22. CUT&RUN הפכה במהירות לחלופה פופולרית ל-ChIP-seq לקביעת לוקליזציה של חלבונים בגנום כרומטין בכל רחבי.

CUT&RUN של קלט נמוך במיוחד (uliCUT&RUN), וריאציה של CUT&RUN המאפשרת שימוש בכניסות נמוכות ותא בודד, תוארה בשנת 201923. כאן מתוארת המתודולוגיה עבור יישום ידני של תא יחיד בתבנית 96 well. חשוב לציין כי מאז הפיתוח של uliCUT&RUN, פותחו שתי חלופות ליצירת פרופיל histone, CUT&Tag ו- iACT-seq, המספקות פרופיל חזק ומקביל מאוד של חלבוני הייסטון24,25. יתר על כן, scCUT&Tag עברה אופטימיזציה ליצירת פרופילים של גורמים מרובים בתא יחיד (multiCUT&Tag) וליישום חלבונים שאינם histone26. יחד, CUT&RUN מספקת חלופה אטרקטיבית ל- ChIP-seq עם קלט נמוך שבו ניתן לבצע uliCUT&RUN בכל מעבדה לביולוגיה מולקולרית שיש לה גישה לממיין תאים וציוד סטנדרטי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצהרת אתיקה: כל המחקרים אושרו על ידי המשרד המוסדי להגנה על בטיחות ביולוגית באוניברסיטת פיטסבורג.

1. הכינו חרוזים מגנטיים

הערה: יש לבצע לפני מיון התאים ולהחזיק בקרח עד לשימוש.

  1. פיפטה 30 μL של מיקרוספרות פרמגנטיות מצומדות ConA תערובת חריזה לכל תגובה לצינור מיקרופוג טרי 1.5 מ"ל ולהוסיף 850 μL של מאגר מחייב, צינורות בעדינות לערבב.
    הערה: מיקרוספרות פרמגנטיות מצומדות ConA הן חרוזים מגנטיים מצופים לציטין המאפשרים כריכת קרום השומנים.
  2. מניחים את הצינור על מתלה מגנטי ומאפשרים לחרוזים להתגנט למשך 1-2 דקות. לאחר supernatant פינה, להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע החרוזים.
  3. הסר את הצינור מן המתלה המגנטי לשטוף את החרוזים על ידי resuspending ב 1 מ"ל של מאגר מחייב.
  4. חזור על שלבים 1.2 ו- 1.3.
  5. ממגנטים את החרוזים במשך 2 דקות ומסירים את supernatant להשליך.
  6. הסר את הצינור מן המתלה המגנטי ו resuspend החרוזים ב 30 μL של מאגר מחייב לכל תגובה.
  7. מחזיקים את תערובת החרוזים השטופה על הקרח עד שהתאים ממוינים.

2. תאי קציר

הערה: שלב זה נכתב עבור תאים דבוקים ומותאם לתאי גזע עובריים מסוג Murine E14. פולחן וקצירת התאים תלויים בסוג התא.

  1. הסר את התאים מן החממה 37 °C °C ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח איכות.
  2. שאפו את המדיה מצלחת התא ושטפו ב-5 מ"ל של 1x PBS.
  3. שאפו PBS מהצלחת וקצורו את התאים (בשיטות קצירת תאים מסורתיות שיהיו שונות לפי סוג התא). השג השעיה של תא יחיד על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה עם פיפטה סרולוגית נגד צלחת התרבות, במידת הצורך.
  4. מעבירים את ההשעיה התאית לצינור חרוטי של 15 מ"ל ומסובבים כלפי מטה ב-200 x גרם למשך 5 דקות.
  5. לשאוף את התקשורת כדי להשליך ולשטוף את גלולה התא עם 5 מ"ל של PBS + 1% FBS.
  6. לסובב את התאים ב 200 x g במשך 5 דקות, להשליך את supernatant, ו resuspend גלולה התא ב 5 מ"ל של PBS + 1% FBS.
  7. לספור את התאים ולהעביר 1 מ"ל של 1 x 106 תאים לתוך צינור microfuge 1.5 מ"ל טרי.
  8. הוסף 5 μL של 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD), הפוך את הצינור היטב לערבב, ולאחר מכן להחיל את המדגם על סדרן התאים כדי למיין תאים בודדים חיים לתוך בארות בודדות של צלחת 96-well.
    הערה: צבע 7-AAD אינו נכלל בתאים חיים, ולכן ניתן להשתמש בו במיון תאים חיים.

3. מיון תאים ותמוגה

  1. הכן לוחית 96-well תואמת ממיין תאים עם 100 μL של חיץ גרעיני (NE) חוצץ בכל באר לפני מיון התאים.
  2. מיין את התאים ללוחות של 96 בארות בהתאם להוראות היצרן.
  3. סובב במהירות את הצלחת (600 x g עבור 30 s) כדי להבטיח תאים נמצאים במאגר בתוך הבארות.
    הערה: כדאי לבדוק בניסוי ראשוני אם התאים המשמשים מובאים באופן אמין לתחתית הבארות.
  4. החזק את הדגימות על קרח במשך 15 דקות.
  5. לסובב את הדגימות ב 600 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F) בזהירות pipette כדי להסיר את supernatant (משאיר מאחור 5 μL).
  6. הגדילו מחדש כל דגימה ב-55 μL של מאגר NE והוסיפו 30 μL של המיקרוספירות הפרמגנטיות המצומדות מראש של ConA (משלב 1.7; במאגר איגוד) לכל תגובה.
  7. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

4. דגימות טרום חסימה כדי למנוע עיכול מוקדם על ידי MNase

  1. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well, לאפשר לחרוזים להיקשר לפחות 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant.
  2. הוסיפו 100 μL של חוצץ חסימה לחרוזים הקשורים לגרעין וערבבו עם צינורות עדינים.
  3. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.

5. תוספת של נוגדן ראשוני

  1. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות לפחות 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים.
  2. הסר את הצלחת מן המתלה המגנטי ו resuspend החרוזים ב 100 μL של חוצץ לשטוף לכל תגובה עם צינורות עדינים.
  3. מניחים את הצלחת בחזרה על המתלה המגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant.
  4. Resuspend החרוזים ב 25 μL של חוצץ לשטוף לכל תגובה עם צינורות עדינים.
  5. הפוך תערובת ראשית נוגדנים עיקרית: 25 μL של מאגר לשטוף + 0.5 μL של נוגדן לכל תגובה.
  6. תוך כדי מערבולת עדינה של החרוזים הקשורים לגרעינים, הוסיפו 25 μL של תערובת אמן הנוגדנים העיקרית לכל דגימה המטופלת בנוגדן המכוון לחלבון העניין (בדרך כלל 1:100 דילול סופי). הוסף 25 μL של מאגר לשטוף ללא נוגדן, אם ביצוע פקד.
  7. דגירה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  8. מניחים את הדגימות על מתלה מגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות לפחות 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע החרוזים.
  9. הסר את הצלחת מן המתלה המגנטי ולשטוף את החרוזים עם 100 μL של חוצץ לשטוף, resususpending על ידי צינורות.

6. תוספת של pA-MNase או pA/G-MNase

הערה: לחלבון A יש זיקה גבוהה למולקולות IgG ממינים מסוימים כגון ארנבות, אך אינו מתאים ל- IgGs ממינים אחרים כגון עכברים או חולדות. לחלופין, ניתן להשתמש בחלבון A/G-MNase. היברידית זו קושרת ארנבים, עכברים וחולדות IgGs, ומונעת את הצורך בנוגדנים משניים כאשר משתמשים בנוגדנים ראשוניים של עכבר או חולדה.

  1. מניחים את הצלחת בחזרה על מתלה מגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות לפחות 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים.
  2. הסר את הצלחת מן המתלה המגנטי ו resuspend כל מדגם ב 25 μL של חוצץ לשטוף.
  3. צרו תערובת מאסטר pA-MNase (25 μL של מאגר כביסה + כמות ממוטבת של pA-MNase לכל תגובה).
  4. תוך כדי מערבולת עדינה, הוסיפו 25 μL של תערובת מאסטר pA-MNase לכל דגימה, כולל דגימות הבקרה.
    הערה: הריכוז של pA-MNase משתנה עם ההכנה, אם תוצרת בית, ויש לבדוק לפני השימוש על כל טיהור עצמאי. עבור pA / G-MNase, 2.5 μL של מלאי 20x יש להשתמש.
  5. לדגור על הדגימות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות לפחות 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים.
  7. הסר את הצלחת מן המתלה המגנטי ולשטוף את החרוזים עם 100 μL של חוצץ לשטוף, resuspending על ידי צינורות עדינים.

7. עיכול דנ"א מכוון

  1. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות לפחות 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant.
  2. הסר את הדגימות מן המתלה המגנטי ו resuspend החרוזים ב 50 μL של חוצץ לשטוף על ידי צינורות עדינים.
  3. שיווי משקל את הדגימות ל 0 °C (5 °F) בתערובת קרח / מים במשך 5 דקות.
  4. הסר את הדגימות מאמבט קרח / מים 0 °C °C (60 °F) והוסף 1 μL של 100 מ"מ CaCl2 באמצעות פיפטה רב ערוצית. ערבבו היטב (3-5 פעמים) עם צנרת עדינה באמצעות פיפטה רב ערוצית גדולה יותר, ולאחר מכן החזירו את הדגימות ל-0 °C (60 °F).
    הערה: ערבוב טוב כאן הוא חיוני. CaCl2 מתווסף כדי להפעיל עיכול MNase של DNA אגף את החלבון של עניין.
  5. התחל טיימר של 10 דקות ברגע שהצלחת חוזרת לאמבטיית הקרח / מים.
  6. עצור את התגובה על ידי צנרת 50 μL של 2XRSTOP + חוצץ לתוך כל באר, באותו סדר כמו CaCl2 נוספה.
    הערה: צור מאגר 2XRSTOP+ לפני שהעיכול של 10 דקות מסתיים כדי למנוע עיכול יתר.

8. פיצול מדגם

  1. לדגור על הדגימות במשך 20 דקות ב 37 °C (50 °F).
  2. לסובב את הצלחת ב 16,000 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F ).
  3. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96 היטב, לאפשר supernatant לנקות לפחות 5 דקות, ולהעביר supernatants לצלחת 96-well טרי. זרוק את החרוזים.

9. מיצוי דנ"א

  1. הוסף 1 μL של 10% נתרן דודציל סולפט (SDS) ו 0.83 μL של 20 מ"ג / מ"ל חלבון K לכל מדגם.
    אזהרה: אבקת SDS מזיקה אם היא נשאפת. משתמשים צריכים להשתמש בחללים מאווררים היטב לובש משקפי מגן, כפפות, מכונת הנשמה כיתה N95, טיפול בזהירות.
  2. מערבבים את הדגימות על ידי צנרת עדינה.
  3. לדגור על הדגימות במשך 10 דקות ב 70 °C (70 °F).
  4. להחזיר את הצלחת לטמפרטורת החדר ולהוסיף 46.6 μL של 5 M NaCl ו 90 μL של 50% PEG 4000. מערבבים על ידי צנרת עדינה.
  5. מוסיפים 33 μL של חרוזי פוליסטירן-מגנטיט לכל דגימה ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: הקפידו להביא חרוזי פוליסטירן-מגנטיט לטמפרטורת החדר (כ-30 דקות) וערבבו היטב לפני השימוש.
  6. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי ולאפשר supernatant לנקות במשך ~ 5 דקות, ולאחר מכן בזהירות להשליך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים.
  7. לשטוף 2x עם 150 μL של 80% אתנול מבלי להפריע לחרוזים.
    אזהרה: האתנול דליק מאוד וגורם לגירוי בעור, בעיניים ובריאות. בצע שלב זה עם בגדי מעבדה מתאימים ובברדס מאוורר.
  8. לסובב את הצלחת בקצרה ב 1000 x g עבור 30 s. מניחים את הצלחת בחזרה על מתלה מגנטי 96 היטב ולהסיר את כל EtOH שיורית מבלי להפריע לחרוזים.
  9. לייבש את הדגימות באוויר במשך ~ 2-5 דקות.
    הערה: אין לייבש את החרוזים במשך יותר מ-5 דקות. אם חרוץ על הסרת EtOH, 2-3 דקות של ייבוש מספיק.
  10. Resuspend החרוזים עם 37.5 μL של 10m Tris-HCl (pH 8) ודגר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  11. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי ומאפשרים לחרוזים להיקשר במשך 5 דקות.
  12. העבר 36.5 μL של supernatant לצלחת תרמוציקלה 96-well תואמת תרמוציקלר טרי. זרוק את החרוזים.
    הערה: ניתן לעצור את הניסוי כאן על ידי אחסון דגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או להמשיך בבניית הספרייה (שלבים 10-15).

10. סוף תיקון, זרחן, אדנילציה

הערה: הריאגנטים מקורם כפי שמוזכר בטבלת החומרים. הפרוטוקול שלהלן עוקב אחר שיטה דומה לערכה המסחרית כגון ערכת NEBNext Ultra DNA II.

  1. לדלל 5 U / μL של T4 DNA פולימראז 1:20 במאגר ligase DNA T4 1x.
  2. הכן תיקון קצה/3'A תערובת ראשית: 2 μL של 10x T4 מאגר ligase DNA, 2.5 μL של 10 mM dNTPs, 1.25 μL של 10 mM ATP, 3.13 μL של 40% PEG 4000, 0.63 μL של 10 U / μL T4 PNK, 0.5 μL של פולימראז T4 DNA מדולל, 0.5 μL של 5U / μL Taq DNA פולימראז, עם נפח כולל של 13.5 μL לכל תגובה.
    הערה: הקפד להביא 40% PEG 4000 לטמפרטורת החדר לפני הצנרת.
  3. הוסף 13.5 μL של סוף תיקון/ 3'A תערובת מאסטר ל 36.5 μL של DNA.
  4. מערבבים את התגובה על ידי מערבולת מהירה, ולאחר מכן ספין מהיר (500 x g עבור 10 s).
  5. דגירה באמצעות תנאי התגובה הבאים בתרמוציקלר מקורר מראש עם מכסה מחומם לטמפרטורות >20 °C (50 °F). השתמש בתנאי התגובה: 12 °C (65 °F) במשך 15 דקות, 37 °C (50 °F) במשך 15 דקות, 72 °C (72 °F) במשך 20 דקות, להחזיק ב 4 °C (60 °F).

11. קשירת מתאם

הערה: שמור את הדגימות על קרח תוך הגדרת התגובה הבאה. אפשר למאגר ligase להגיע לטמפרטורת החדר לפני הצנרת. לדלל את המתאם (ראה טבלת חומרים) בתמיסה של 10 mM Tris-HCl המכיל 10 mM NaCl (pH 7.5). בשל התשואה הנמוכה, אל תכמתו מראש את הדנ"א המועשר של CUT&RUN. במקום זאת, ליצור דילול 25 פי 25 של המתאם, באמצעות ריכוז מתאם עבודה סופי של 0.6 מיקרומטר.

  1. צור תערובת מאסטר קשירה: 55 μL של מאגר ligase (2x), 5 μL של T4 DNA ligase, ו 5 μL של מתאם מדולל, עם נפח כולל של 65 μL לכל תגובה.
  2. הוסף 65 μL של תערובת קשירה מאסטר ל 50 μL של DNA משלב 10.5.
  3. מערבבים על ידי מערבולת מהירה, ואחריו ספינינג מהיר (500 x גרם עבור 10 שניות).
  4. דגירה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס בתרמוציקלר (ללא מכסה מחומם) למשך 15 דקות.
    הערה: המשך מיד לשלב הבא.

12. עיכול המשתמש

  1. הוסף 3 μL של אנזים USER לכל דגימה, מערבולת, ספין (500 x גרם עבור 10 s).
  2. דגירה במחזור תרמי ב 37 °C (50 °F) במשך 15 דקות (מכסה מחומם להגדיר 50 °C (50 °F).

13. ניקוי חרוזים פוליסטירן-מגנטיט בעקבות תגובת קשירה

הערה: אפשר לחרוזים פוליסטירן-מגנטיט להשתוות בטמפרטורת החדר (~ 30 דקות). מערבולת כדי homogenize פתרון חרוזים לפני השימוש. בצע את השלבים הבאים בטמפרטורת החדר.

  1. הוסף 39 μL (0.33x) של תמיסת חרוזים פוליסטירן-מגנטיט לכל באר המכילה DNA קשור מתאם.
  2. מערבבים ביסודיות על ידי צנרת, ולאחר מכן לדגור את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות כדי לאפשר DNA להיקשר לחרוזים.
  3. מניחים את הדגימות על מתלה מגנטי של 96 בארות ודוללים במשך 5 דקות עד שהסופר-נרטיב מתבהר.
  4. שמור את הצלחת על המתלה המגנטי ולהסיר בזהירות ולהשליך את supernatant מבלי להפריע החרוזים.
  5. לשטוף את החרוזים עם 200 μL של 80% EtOH מבלי להפריע לחרוזים.
  6. דגירה עבור 30 שניות על מתלה מגנטי 96-well כדי לאפשר את הפתרון לנקות.
  7. הסר והשלך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים.
  8. חזור על שלבים 13.5-13.7 עבור סך של שתי שטיפה.
  9. לסובב את הצלחת בקצרה ב 500 x g עבור 10 s, למקם את הצלחת בחזרה על מתלה מגנטי 96-well, ולהסיר EtOH שיורית מבלי להפריע לחרוזים.
  10. שמור את הצלחת על המתלה המגנטי וייבש את הדגימות באוויר במשך 2 דקות.
    הערה: אין לייבש יתר על המידה את החרוזים.
  11. הסר את הצלחת מן המתלה המגנטי ו resuspend החרוזים ב 28.5 μL של 10 mM Tris-HCl (pH 8).
    זהירות: חומצה הידרוכלורית היא מאכלת מאוד. משתמשים צריכים לטפל בזה בזהירות בברדס אדים כימי לובש משקפי מגן, כפפות, וחלוק מעבדה.
  12. ביסודיות resuspend חרוזים על ידי צינורות, דואג לא לייצר בועות.
  13. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  14. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well ולאפשר את הפתרון לנקות במשך 5 דקות.
  15. העבר 27.5 μL של supernatant לצלחת PCR חדשה ולהשליך את החרוזים.

14. העשרת הספרייה

הערה: פריימרים מדוללים עם פתרון זהה לזה של המתאם. עבור בניית ספריה זו, השתמש בריכוז פריימר עבודה סופי של 0.6 מיקרומטר.

  1. הוסף 5 μL של פריימר אינדקס מדולל (ראה טבלת חומרים) לכל מדגם.
    הערה: כל דגימה זקוקה לאינדקס אחר כדי להיות מזוהה לאחר הרצף.
  2. הכינו תערובת מאסטר PCR: 10 μL של 5x מאגר PCR נאמנות גבוהה, 1.5 μL של 10 mM dNTPs, 5 μL של פריימר אוניברסלי מדולל, 1 μL של 1 U חם להתחיל פולימריות נאמנות גבוהה, עם נפח תערובת מאסטר כולל של 17.5 μL לכל מדגם.
  3. הוסף 17.5 μL pf PCR לערבב 32.5 μL של DNA מטוהר מתאם-קשירה (5 μL של פריימר באינדקס כלול בנפח זה).
  4. מערבבים את הפתרון על ידי צנרת.
  5. דגירה בתרמוציקלר באמצעות תנאי התגובה הבאים עם קצב שיפוע מרבי של 3 °C °C /s: 98 °C (6 °F) עבור 45 s, 98 °C (45 °F) עבור 45 s, 60 °C (60 °F) עבור 10 s, לחזור על השלב השני והשלישי 21 פעמים, 72 °C (72 °F) במשך 1 דקות, להחזיק ב 4 °C (60 °F).
    הערה: ניתן לשמור את הדגימות בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) לאחסון לטווח קצר או -20 °C (60 °F) לאחסון לטווח ארוך.

15. ניקוי חרוזים פוליסטירן-מגנטיט

  1. הוסף 60 μL (1.2x) של חרוזי פוליסטירן-מגנטיט לכל מדגם.
  2. Resuspened את החרוזים על ידי צינורות ודגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי במשך 5 דקות עד שהתמיסה ברורה.
  4. להשליך את supernatant ולשטוף את החרוזים עם 200 μL של 80% EtOH מבלי להפריע החרוזים.
  5. חזור על שלב הכביסה עבור סך של שני 80% EtOH לשטוף.
  6. לסובב את הצלחת ב 500 x g עבור 10 s, מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well, ולאפשר לחרוזים להיקשר במשך 5 דקות.
  7. Pipette כדי להסיר עודף EtOH מבלי להפריע לחרוזים ולאפשר לחרוזים להתייבש באוויר במשך 2 דקות.
    הערה: אין לייבש יתר על המידה את החרוזים.
  8. Resuspend החרוזים ב 21 μL של מים ללא נוקלאז ודגר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי ומאפשרים לפתרון להתפנות למשך 5 דקות.
  10. העבר 20 μL של supernatant לצלחת חדשה.
    הערה: ניתן לעצור את הניסוי כאן על ידי אחסון המדגם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  11. כימות ריכוזי הספרייה באמצעות פלואורומטר (ראה טבלת חומרים), באמצעות ריאגנט HS 1x.
  12. אם הריכוז מאפשר, להפעיל 30 ננוגרם של מדגם על 1.5% ג'ל agarose עם סולם משקל מולקולרי נמוך לדמיין. לחלופין, דמיין באופן חזותי על מנתח קטעים או על כלי קשור.
  13. ספריות רצף בפלטפורמת Illumina כדי להשיג ~ 50,000-100,000 קריאות ממופות באופן ייחודי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, פרוטוקול מפורט מוצג עבור פרופיל חלבון תא יחיד על כרומטין באמצעות 96-well בפורמט ידני uliCUT&RUN. בעוד התוצאות ישתנו בהתאם לפרופיל החלבון (בשל שפע חלבון ואיכות נוגדנים), סוג התא, וגורמים תורמים אחרים, התוצאות הצפויות עבור טכניקה זו נדונות כאן. יש להעריך את איכות התא (מראה התא ואחוז התאים הקיימים) ואת המיון של תא יחיד לפני או בזמן מיון התא החי למאגר NE. דוגמה למושבות תאים של ES ולמיון תאים מוצגת באיור 2A,B. באופן ספציפי, אין להשתמש בתאים באיכות נמוכה, ואם האיכות היא ב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CUT&RUN הוא פרוטוקול יעיל לקביעת לוקליזציה של חלבונים בכרומטין. יש לו יתרונות רבים ביחס לפרוטוקולים אחרים, כולל: 1) יחס אות לרעש גבוה, 2) פרוטוקול מהיר, ו-3) כיסוי קריאה ברצף נמוך הנדרש ובכך מוביל לחיסכון בעלויות. השימוש בחלבון A- או חלבון A/G-MNase מאפשר להחיל את CUT&RUN עם כל נוגדן זמין; לכן, יש לו את הפוטנציאל במהירות ובקלות פרופיל חלבונים רבים. עם זאת, הסתגלות לתא יחיד עבור כל פרופיל חלבון על כרומטין היה קשה, במיוחד בהשוואה לתעתיק של תא יחיד (כלומר, scRNA-seq), בשל מספר העותק הנמוך של DNA ביחס ל- RNA (שניים עד ארבעה ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים הקשורים לפרויקט זה.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לחברי מעבדת היינר על הקריאה וההערות על גרסה מוקדמת יותר של כתב יד זה. פרויקט זה השתמש NextSeq500 זמין באוניברסיטת פיטסבורג מדעי הבריאות רצף הליבה בבית החולים לילדים UPMC של פיטסבורג עבור ריצוף עם תודה מיוחדת למנהל שלה, ויליאם מקדונלד. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מרכז אוניברסיטת פיטסבורג למחשוב מחקר באמצעות משאבי המחשב שסופקו. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק מספר R35GM133732 (כדי S.J.H.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 מ"ל צינורות מיקרופוגה שקופיםThermoFisher Scientific90410
1.5 מ"ל צינור מתלה מגנטיThermoFisher Scientific12321D
1.5 מ"ל צנטריפוגה קרה תואמת צינורEppendorf5404000537
10 ס"מ צלחות תרבית רקמות סטריליותThermoFisher Scientific150464
10X T4 DNA Ligase bufferחדש אנגליה BiolabsB0202S
15 מ"ל צינורות חרוטייםVWR89039-656
1X מאגר TEThermoFisher Scientific12090015
200 ומיקרו; צינורות L PCREppendorf951010022
2X מהיר מאגר ליגאזניו אינגלנד BiolabsM2200Ligase Buffer
5X KAPA HiFi bufferRoche79588890015X מאגר PCR בנאמנות גבוהה
7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)Fisher ScientificBDB559925
96-well מתלה מגנטיThermoFisher Scientific12027 או 12331D
צלחת 96 בארותVWR82006-636
AMPure XP חרוזיםבקמן קולטרA63881חרוזי פוליסטירן-מגנטיט; בשל השונות הפוטנציאלית בין חרוזי AMPure XP, מומלץ לכייל את תמיסת חרוזי ה-AMPure שלך. ראה 'יצרן' s הוראות
נוגדן לחלבון מענייןמשתנה
ATPThermoFisher ScientificR0441
BioMag Plus Concanavalin A חרוזיםPolysciences86057-10מיקרוספירות פרמגנטיות מצומדות ConA
BSA
סידן כלורי (CaCl2)פישר סיינטיפיקAAJ62905AP
סדרן תאיםBD FACSAria II סדרןדורש הכשרה
מדיה ספציפית לתא לתרבית תאיםמשתנה
כלורופורםThermoFisher ScientificC298-500כלורופורם הוא מגרה בעור ומזיק בבליעה; לטפל במכסה אדים כימי באמצעות כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי מגן
מחשב עם מעבד 64 סיביות וגישה לאשכוללניתוחים חישוביים של מערכי נתונים של ריצוף שנוצרו
עמודות ספין DNAEpoch Life Sciences1920-250
dNTP setNew England BiolabsN0446S
EGTASigma AldrichE3889
ציוד אלקטרופורזהמשתנה
אתנולפישר סיינטיפיק22032601100% נפח / נפח אתנול דליק מאוד; ידית במכסה אדים כימי באמצעות כפפות, מעיל מעבדה, ומשקפי מגן
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית  (אדטה)Fisher ScientificBP2482100
FBSSigma AldrichF2442
גליצרולFisher ScientificBP229-1
גליקוגןVWR97063-256
HEPESFisher ScientificBP310-500
Heterologous S. cerevisiae DNA spike-inתוצרת ביתמוכן מג'ל מקושר, מעוכל MNase וג'ל אגרוז מופק DNA גנומי מטוהר מחלבון/RNA ומדולל ל-10 ננוגרם/מ"ל. אנו ממליצים על DNA גנומי של שמרים, אך ניתן להשתמש באורגניזמים אחרים במידת הצורך.
חומצה הידרוכלורית  (HCl)פישר סיינטיפיקA144-212היא קורוזיבית מאוד; ידית במכסה אדים כימי באמצעות כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי מגן
דלי קרחמשתנה
פלטפורמת ריצוף אילומינה (למשל, NextSeq500)אילומינה
עם בקרת טמפרטורה ואטמוספירהThermoFisher Scientific51030284
KAPA HotStart HiFi DNA פולימראז עם 5X KAPA HiFi מאגררוש7958889001hotstart פולימראז נאמנות
גבוהה קולט אדים זרימה למינריתחברת מאפייהSG404
מנגן כלוריד (MnCl2)סט מיקרופיפטה 244589
Rainin30386597
MinifugeBenchmark ScientificC1012
מתאם NEB מתאםE6612AVIAL ניו אינגלנד ביולאבס
NEB פריימר אוניברסליניו אינגלנד ביולאבסE6611AVIALפריימר אוניברסלי
NEBNext Multiplex Oligos לערכת Illumina ניואינגלנד BiolabsE7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/Lפריימרים אינדקס
נוגדנים לבקרהשלילית-OnlineABIN101961
מים ללא נוקלאזNew England BiolabsB1500S
PCR thermocyclerEppendorf2231000666
צינורות נעילת פאזהQiagen129046
פנול/כלורופורם/איזואמיל אלכוהול (PCI)ThermoFisher Scientific15593049פנול מזיק במקרה של בליעה או מגע עם העור; יש לטפל במכסה אדים כימי באמצעות כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי מגן
תמיסת מלח חוצצת Phsophate (PBS)ThermoFisher Scientific10814010
סיוע לפיפטהDrummond Scientific# 4-000-100
פוליאתילן גליקול (PEG) 4000VWRA16151
אשלגן כלורי (KCl)סיגמא אולדריץ'P3911
אשלגן הידרוקסיד (KOH)פישר סיינטיפיקP250-1זהירות: KOH הוא חומר מגרה לעיניים/לעור כתמיסה מוצקה וקורוזיבית. ידית במכסה אדים כימי באמצעות כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי מגן
מעכבי פרוטאזThermoFisher Scientific78430
ProteinA/G-MNaseEpicypher15-1016pA/G-MNase
ProteinA-MNase, מטוהר מ-pK19pA-MNAddgene86973
Proteinase KNew England BiolabsP8107S
Qubit 1X dsDNA HS ערכתבדיקהThermoFisher ScientificQ33230
צינורות בדיקת קיוביטThermoFisher ScientificQ32856
קיוביט פלואורומטרThermoFisher ScientificQ33238
ליגאז מהיר עם 2X מאגר ליגאז מהירניו אינגלנד BiolabsM2200S
RNase Aניו אינגלנד BiolabsT3010
נתרן אצטט  (נאו-אק)ThermoFisher ScientificBP333-500
נתרן כלורי (NaCl)Sigma AldrichS5150-1L
נתרן דודציל סולפט (SDS)ThermoFisher ScientificBP166-500SDS רעיל בשאיפה; טפל בזהירות בחללים מאווררים היטב באמצעות כפפות, מגן עיניים ומכונת הנשמה בדרגת N95 בעת טיפול
בנתרן הידרוקסיד (NaOH)Fisher ScientificS318-1NaOH הוא חומר מגרה עיניים/עור כתמיסה מוצקה וקורוזיבית. ידית במכסה אדים כימי באמצעות כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי מגן
SpermidineSigma AldrichS2626
מיקרוסקופ אור הפוך סטנדרטיLeica11526213
חומרי ג'ל אגרוז מעבדה סטנדרטייםמשתנה
חומרי מעבדה סטנדרטיים כגון פיפטות סרולוגיות וקצות פיפטותמשתנה
T4 DNA Ligaseחדש אנגליה BiolabsM0202S
T4 DNA פולימראזניו אינגלנד BiolabsM0203S
T4 PNKניו אינגלנד BiolabsM0201S
מערבולת שולחניתפישר סיינטיפיק2215414
Taq DNA פולימראזניו אינגלנד ביולאבסM0273S
תרמומיקסראפנדורף5384000020לחלופיןיכול להשתמש באמבט מים
TrisFisher ScientificBP152-5
Triton X-100Sigma Aldrich9002-93-1Triton X-100 הוא מסוכן; השתמש במעיל מעבדה, כפפות ומשקפי מגן בעת טיפול
באנזים TrypsinFisher ScientificMT25052
Tube RotatorVWR10136084
USER ניואינגלנד BiolabsM5505S
תאים מחשוב עלחומצה הידרוכלורית של חממת סיגמא אולדריץ' בסיס

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
  2. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).
  3. Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -L. DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation. Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).
  4. Albert, I., et al. Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).
  5. Blat, Y., Kleckner, N. Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region. Cell. 98 (2), 249-259 (1999).
  6. Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
  7. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
  8. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).
  9. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
  10. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  11. Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells. Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).
  12. Shankaranarayanan, P., et al. Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq. Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).
  13. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  14. Grosselin, K., et al. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer. Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).
  15. Adli, M., Bernstein, B. E. Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq. Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).
  16. Zwart, W., et al. A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples. BMC Genomics. 14, 232(2013).
  17. Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications. BMC Genomics. 16, 1083(2015).
  18. Brind'Amour, J., et al. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nature Communications. 6, 6033(2015).
  19. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. hI. C. ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
  20. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733(2015).
  21. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856(2017).
  22. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314(2019).
  23. Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos. Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).
  24. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).
  25. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).
  26. Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells. Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).
  27. Patty, B. J., Hainer, S. J. Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts. Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).
  28. Zheng, X. -Y., Gehring, M. Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN. Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).
  29. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  30. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell CUT RUNChromatin Protein LocalizationUltra Low InputTranscription Factor ProfilingChromatin ImmunoprecipitationAntibody TetheringProtein A MNase96 Well FormatDNA ExtractionEmbryonic Stem Cells

Related Articles