מאמר שיטה

ספקטרומטריית מסה מונחית שושלת תאים פרוטאומיקה בעובר המתפתח (צפרדע)

DOI:

10.3791/63586

⸱

21 באפריל 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Maryland, 2Department of Anatomy & Cell Biology, The George Washington University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים אפיון פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסות של שושלות תאים עם גורלות רקמות ידועים בעובר בעל חוליות Xenopus laevis .

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיון אירועים מולקולריים כתאים המולידים רקמות ואיברים מעלה פוטנציאל להבין טוב יותר התפתחות תקינה ולתכנן תרופות יעילות למחלות. טכנולוגיות המאפשרות זיהוי וכימות מדויקים של סוגים שונים ומספר גדול של חלבונים יספקו מידע שעדיין חסר על מנגנונים מולקולריים המתזמרים התפתחות רקמות ואורגניזמים במרחב ובזמן. כאן אנו מציגים פרוטוקול מבוסס ספקטרומטריית מסות המאפשר מדידה של אלפי חלבונים בשושלות תאים מזוהות בעוברי צפרדע (Xenopus laevis ). הגישה מתבססת על מפות גורל התא הניתנות לשחזור ושיטות מבוססות לזיהוי, תיוג, מעקב ודגימה פלואורסצנטית של תאים וצאצאיהם (שיבוטים) ממודל זה של התפתחות בעלי חוליות. לאחר איסוף תוכן תאי באמצעות מיקרו-דגימה או בידוד תאים על ידי דיסקציה או מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, חלבונים מופקים ומעובדים לאנליזה פרוטאומית מלמטה למעלה. כרומטוגרפיה נוזלית ואלקטרופורזה נימית משמשות כדי לספק הפרדה ניתנת להרחבה לזיהוי וכימות חלבונים באמצעות ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה (HRMS). דוגמאות מייצגות ניתנות לאפיון פרוטאומי של תאים בעלי גורל לרקמה עצבית. פרוטאומיקה HRMS מונחית שושלת תאים ניתנת להתאמה לרקמות ואורגניזמים שונים. הוא רגיש, ספציפי וכמותי מספיק כדי להציץ לתוך הדינמיקה המרחבית-טמפורלית של הפרוטאום במהלך התפתחות בעלי חוליות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנתנו את התמיינות התאים ואת היווצרותם של רקמות ואיברים היא תוצאה של עשרות שנים של בדיקות ממוקדות מורכבות של גנים ותוצריהם. הגדלת הידע שלנו על כל הביומולקולות וכמותן במהלך אירועים תאיים חשובים תסייע לפענח מנגנונים מולקולריים השולטים בתבניות המרחביות והזמניות של תוכנית הגוף של בעלי החוליות. טכנולוגיות המאפשרות הגברה מולקולרית וריצוף מסוגלות כיום לדווח באופן שגרתי על מספר רב של גנים ותעתיקים, ותומכות במחקרים מונחי השערות במחקר ביולוגי ותרגומי בסיסי. כדי להבין מערכות מתפתחות, מערכת יחסים מורכבת בין שעתוק לתרגום דוגלת בניתוח ישיר של חלבונים מרובים ובשינויים שלאחר התרגום. פרוטאומיקה גלובלית המשתמשת במערכות ביולוגיות במבחנה, כגון תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, החלה לשרטט מנגנונים של השראת רקמות 1,2. באורגניזמים מורכבים, כגון עובר בעל חוליות, ההתפתחות מסתמכת על שיפועים מורפוגניים בהקשר של מרחב וזמן3. מכאן נובע כי רכישת ידע על שינויים פרוטאומיים כאשר תאים מתמיינים ליצירת רקמות מיוחדות, כגון רקמות עצביות, מציעה מפתח לפתיחת תוכניות מולקולריות השולטות בהתפתחות נורמלית ופגומית ומנחה את הדור הבא של הטיפולים.

צפרדע בעלת טפרים דרום אפריקאית (Xenopus laevis) היא מודל מבוסס היטב בביולוגיה תאית והתפתחותית, נוירו ורגנרטיבית. פרס נובללפיזיולוגיה או לרפואה 4,5 של סר ג'ון גורדון לשנת 2012 על גילוי הפלוריפוטנטיות של הגרעין הסומטי הדגיש את חשיבותו של מודל זה לתגליות במחקרים בסיסיים ותרגומיים. עוברי קסנופוס מתפתחים חיצונית לאם, ובכך מאפשרים מניפולציה ישירה של תאים, שיבוטים של תאים וביטוי גנים בשלבי התפתחות שונים. פיגמנטציה אסימטרית וחלוקות תאים סטריאוטיפיות אפשרו לשרטט מפות גורל הניתנות לשחזור מהעובר בן 16-6 ו-32 תאים 7,8. עבור פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (HRMS), יתרונות נוספים של המודל כוללים גודל גדול יחסית (~ 1 מ"מ קוטר), אשר מניב תכולת חלבון בשפע לניתוח (~ 130 מיקרוגרם בעוברים בשלב המחשוף המוקדם, ~ 10 מיקרוגרם של תכולת חלבון בתאים בודדים של עובר בן 16 תאים)9,10.

כיום, HRMS היא הטכנולוגיה המובילה המועדפת לגילוי חלבונים. טכנולוגיה זו מאפשרת איתור וכימות ישיר, רגיש וספציפי של חלבונים מרובים, בדרך כלל מאות עד אלפי חלבונים שונים11. פרוטאומיקה מלמטה למעלה על ידי HRMS כוללת סדרה של שלבים הקשורים זה בזה. לאחר מיצוי מדגימת התא/רקמה, חלבונים מתעכלים עם אנזים מפרקי חלבון, כגון טריפסין (פרוטאומיקה מלמטה למעלה). הפפטידים המתקבלים מופרדים בהתבסס על התכונות הפיזיקוכימיות השונות שלהם, כולל הידרופוביות (כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה, LC), מטען נטו (כרומטוגרפיה של החלפת יונים), גודל (כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל), או ניידות אלקטרופורטית (אלקטרופורזה נימית, CE). לאחר מכן פפטידים נטענים (מיוננים), בדרך כלל באמצעות יינון אלקטרוספריי (ESI), ויונים פפטידים מזוהים ומרוצפים באמצעות פיצול פאזת גז על ידי טנדם HRMS. הנתונים הפפטידים המתקבלים ממופים לפרוטאום של האורגניזם הנחקר. עם מתאם בין עוצמת אות יון פפטידי ספציפי לחלבון (פרוטטיפי) לבין ריכוז, ניתן לבצע כימות חלבון ללא תווית או מבוסס תווית (כימות ריבוב). פרוטאומיקה HRMS מניבה משאב עשיר של מידע על המצב המולקולרי של המערכת הנחקרת, ומאפשרת יצירת השערות ומחקרים פונקציונליים עוקבים.

figure-introduction-1
איור 1: פרוטאומיקה מרחבית-זמנית המאפשרת פרוטאומיקה מונחית שושלת תאים HRMS בעובר המתפתח (צפרדע). (A) הדמיה של הדגימה (1) באמצעות סטריאומיקרוסקופ (2) להזרקה של תא מזוהה (inset), באמצעות מיקרופיפטה מפוברקת (3) תחת בקרה על ידי שלב תרגום (4). (B) דגימה תת-תאית של תא D 11 השמאלי שזוהה בעובר בן16 תאים. (C) דיסקציה של תא D 11 שלם מעובר בן16 תאים. (D) מעקב פלואורסצנטי (ירוק) של צאצאי D111 משמאל ומימין מעובר בן 32 תאים כדי להנחות דיסקציה של האקטודרם העצבי (NE) בגסטרולה (שלב 10) ובידוד הרקמה היורדת מהראשנים באמצעות FACS. מוטות קנה מידה: 200 מיקרומטר לעוברים, 1.25 מ"מ לבקבוקון. הנתונים אומצו באישור הפניות 15,19,21,59. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר כימות מבוסס HRMS של מספר רב של חלבונים בתאים/רקמות מזוהים בעוברי X. laevis מתפתחים. הגישה מתבססת על זיהוי מדויק של תאים, מפות גורל תאים הניתנות לשחזור, ומתודולוגיות מבוססות למעקב אחר שושלות תאים במודל ביולוגיזה 6,7,8. כפי שניתן לראות באיור 1, אנו חוקרים פרוטאומים מתאים בודדים על-ידי שימוש בדיסקציה של תאים שלמים או במיקרו-דגימה נימית כדי לשאוף תוכן תאי. ניטור השושלת של התא מאפשר לנו לחקור את האבולוציה המרחבית-זמנית של הפרוטאום כאשר תאים יוצרים רקמות במהלך גסטרולציה. צאצאי התא מסומנים באופן פלואורסצנטי על ידי הזרקת פלואורופור מצומד לדקסטרן אינרטי או mRNA עבור חלבון פלואורסצנטי (למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק, או GFP). הצאצא המסומן מבודד בנקודות זמן התפתחותיות רצויות. במהלך הגסטרולציה, שיבוטים של תאים המקובצים היטב עשויים להיות מבודדים על ידי דיסקציה. לאחר הגסטרולציה, שיבוטים של תאים עשויים להיות מופצים בתוך העובר עקב תנועות נדידה וניתן לבודד אותם מרקמות מנותקות על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS). חלבונים בתאים וברקמות אלה נמדדים באמצעות פרוטאומיקה מלמטה למעלה המשתמשת ב- HPLC או CE להפרדה ו- ESI טנדם HRMS לזיהוי. פרוטאומיקה HRMS מונחית שושלת תאים ניתנת להרחבה לגדלי תאים ושושלות שונות בתוך העובר והיא ספציפית, רגישה וכמותית. באמצעות דוגמאות נבחרות המוצגות כאן, אנו גם מדגימים שפרוטוקול זה ניתן להרחבה ולהתאמה רחבה לסוגים שונים של תאים ושושלות תאים.

figure-introduction-2
איור 2: תהליך העבודה הביואנליטי. מיקרו-דיסקציה ושאיפה נימית, או FACS הקל על דגימה של תכולת חלבון תאי ושבטי. דלדול חלבוני חלמון בשפע והפרדה על ידי אלקטרופורזה נימית (CE) או כרומטוגרפיה נוזלית ננו-זרימה (LC) רגישות זיהוי משופר (ID) באמצעות יינון אלקטרוספריי (ESI) ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (HRMS). הכימות חשף חוסר ויסות, וסיפק מידע חדש למחקרים מונחי השערות בשילוב עם מידע זמין מאונטולוגיה גנטית (GO). האיורים עובדו באישור הפניה15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הפרוטוקולים המבטיחים תחזוקה אנושית וטיפול בצפרדעים בוגרות של Xenopus laevis אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מרילנד, קולג' פארק (מספרי אישור R-DEC-17-57 ו- R-FEB-21-07).

1. הכינו את הפתרונות

  1. לאמבריולוגיה
    1. הכינו את התמיסה של שטיינברג (SS) 1x, 0.5x ו-0.2x, ולאחר מכן העבירו אותם אוטומטית (120°C למשך 20 דקות) לסטריליות בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים12.
    2. הכינו 3% (w/v) Ficoll ב-1x SS מעוקר בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים12.
    3. עבור dejellying, טרי להכין 2% (w / v) תמיסת ציסטאין ולהתאים את pH שלה ל 8 על ידי הוספת 10 M תמיסת הידרוקסיד טיפתית.
      אזהרה: חשיפה לציסטאין עלולה לגרום לנזק לעור ולדרכי הנשימה. נתרן הידרוקסידי הוא חומר מאכל שעלול לגרום נזק חמור לעור ולעיניים בחשיפה ישירה. השתמש בציוד מגן אישי מתאים (PPE) בעת טיפול בכימיקלים אלה, כגון כפפות ומעיל מעבדה.
    4. עבור עוקב השושלת, הכינו 0.5% (v/v) של דקסטרן פלואורסצנטי במים סטריליים שעברו דה-יוניזציה. לחלופין, הכינו תמיסה של 0.2 מיקרוגרם/מיקרוליטר של mRNA עבור חלבונים פלואורסצנטיים במים סטריליים שעברו דה-יוניזציה (למשל, GFP).
    5. כדי לנתק תאים, הכינו חיץ Newport 2.0 המכיל 0.1 M נתרן isethionate, 20 mM נתרן pyrophosphate, ו 10 mM CAPS, ולאחר מכן להביא את ה- pH שלה ל 10.513.
      אזהרה: חשיפה לנתרן פירופוספט עלולה לגרום לגירוי בעור ובעיניים. השתמש בציוד הגנה אישי מתאים בעת טיפול בכימיקלים אלה.
  2. עבור פרוטאומיקה מלמטה למעלה
    1. הכינו את מאגר הליזה של התא כך שיכלול: 250 מ"מ סוכרוז, 1% תחליף נונידט P-40 (w/v), 20 מ"מ Tris-HCl, 5 mM EDTA, 10 מיקרומטר ציטוכלסין D ו-10 מיקרומטר קומברטסטטין 4A. הכינו מלאי של 10% (w/v) נתרן דודציל סולפט14,15.
      הערה: Tris-HCl נבחר כדי למזער את זיהום HEPES במהלך nano-flow LC (nanoLC)-HRMS.
      אזהרה: חשיפה לתחליף P-40 שאינו אחיד עלולה לגרום לגירוי בעור. ציטוכלסין D הוא טרטוגני אם צורכים אותו, וקומברטסטטין רעיל מאוד בחשיפה ישירה. השתמש בציוד הגנה אישי מתאים בעת טיפול בכימיקלים אלה.
    2. כדי להפריד פפטידים לפי CE, הכינו את הממסים הבאים (v/v): ממס לדוגמה, 75% אצטוניטריל (ACN) המכיל 0.05% חומצה אצטית (AcOH) במים; תמיסת מעטפת, 10% ACN המכיל 0.05% AcOH במים; אלקטרוליט רקע (BGE), 25% ACN המכיל 1M חומצה פורמית (FA) במים.
      אזהרה: AcOH ו-FA רעילים בשאיפה או בצריכה, ועלולים לגרום לנזק חמור לעור ולעיניים בחשיפה ישירה. השתמש בציוד הגנה אישי מתאים בעת טיפול בכימיקלים אלה.
    3. כדי להפריד פפטידים על ידי ננו-LC בפאזה הפוכה, הכינו (v/v): פאזה A ניידת (מימית), מים המכילים 0.1% FA; שלב B נייד (אורגני), 0.1% FA ב-ACN.
      הערה: יש להכין את כל התערובות באמצעות ממיסים בדרגת LC-MS כדי למזער הפרעות כימיות במהלך זיהוי HRMS.

2. הכינו את הכלים למיקרו-הזרקה ודיסקציה

  1. כדי להזיז ולכוון עוברים בעדינות, עשו לולאות שיער על ידי קיבוע שיער נקי לפיפטה של פסטר כמתואר במקום אחר16.
  2. עבור מיקרו-הזרקה, לייצר מחטים על ידי משיכת נימי בורוסיליקט (1 מ"מ / 500 מיקרומטר קוטר חיצוני/פנימי) באמצעות מושך פיפטה כמתואר במקום אחר16.
    הערה: כאן, P-1000 פיפטה Puller עם ההגדרות הבאות שימש לייצור מחטים: חום, 495; משיכה, 30, מהירות, 60; זמן, 150; לחץ, 200.
  3. בעזרת התבוננות תחת סטריאומיקרוסקופ, חתכו את קצה הנימים באמצעות זוג מלקחיים חדים כדי למעשה לייצר את הנימים למחט (מיקרו) (למשל, Dumont #5)16.
    זהירות: נימים משוכים הם חדים מאוד ויש לטפל בהם בזהירות.
    הערה: קצה המחט צריך להיות חד מספיק (קוטר חיצוני 10-15 מיקרומטר) כדי להיות מסוגל לחדור את התא עם נזק מינימלי לקרום התא, כך התוכן התוך-תאי לא ידלוף החוצה והתא יוכל להחלים ולהמשיך להיות בר קיימא.
  4. כדי להחזיק עוברים במהלך מיקרו-הזרקה, הכינו בארות בכלי מלא חימר. בצלוחית פטרי בקוטר 15 מ"מ, הטבעה ~1 מ"מ קוטר x ~0.5 מ"מ עמוק בארות לתוך חרסית פלסטלינה לא רעילה כמתואר במקום אחר16.
  5. למיקרודיסקציה, הכינו מנות מצופות אגרוז. הכינו 2% אגרוז ב-1x SS ובצעו אוטוקלאבינג כדי לעקר את התמיסה (120°C למשך 20 דקות). ממלאים צלחות פטרי בקוטר 60 מ"מ באמצע הדרך, ונותנים לצלחות להתמצק. הפוך ~ 1 מ"מ קוטר x ~ 0.5 מ"מ בארות עומק באמצעות כלי פיפטה פסטר כדורי כפי שתואר קודם16.

3. בודד את שושלת התאים

הערה: השלבים הבאים מבוצעים כדי לבודד תאים בודדים מזוהים ו/או שושלות תאים צאצאים שלהם. בדרך כלל, העובר מתורבת לשלב של 16 או 32 תאים, שבו גורלות הרקמה של כל תא ממופים באופן שניתן לשחזר 6,7,17. התאים העובריים מזוהים על סמך מורפולוגיה, מיקום והתייחסות למפות הגורל שלהם. עבור ניתוח תא בודד, תאים מזוהים מבודדים על ידי דיסקציה ידנית, או התוכן התוך-תאי שלהם נאסף לתוך פיפטה נימית ומושקע 5 μL של 0.5 mM אמוניום ביקרבונט. הדגימה המתקבלת מאוחסנת בטמפרטורה של -80°C עד לניתוח (איור 1)18,19,20,21. לצורך ניתוח שושלת תאים, תאים מזוהים מוזרקים עם עוקב שושלת, והשיבוטים הבאים שלהם מבודדים בשלבי מפתח של התפתחות (למשל, במהלך גסטרולציה לחקר השראת רקמות, לאחר נוירולציה כדי לחקור מחויבות רקמות). במה שלהלן, מתוארים צעדים לסימון פלואורסצנטי של שושלת התאים המזוהים לבידוד על ידי דיסקציה או FACS.

  1. תרבית את העוברים
    1. להשיג עוברים באמצעות הזדווגות טבעית או הפריה חוץ גופית (IVF) בהתאם לפרוטוקולים שנקבעו12.
      הערה: ההזדווגות הטבעית פשוטה יותר מבחינה לוגיסטית, חוסכת את הצפרדעים הזכרים הבוגרים ומניבה עוברים בשלבי התפתחות שונים, ואילו הפריה חוץ גופית מספקת עוברים מסונכרנים התפתחותית לניסויים הדורשים היערכות מדויקת.
    2. דג'לי את העוברים. הסר את שכבת הג'לי המקיפה את העוברים באמצעות טיפול בתמיסת הג'לי כמתואר במקום אחר12,16.
      הערה: מיקרו-הזרקות ודיסקציה דורשות גישה לתאים ולרקמות, מה שמחייב דה-ג'לי בעוברי X. laevis.
    3. בחר עוברים 2 תאים עם פיגמנטציה סטריאוטיפית16,22.
      הערה: שלב זה חשוב כדי להבטיח דיוק ויכולת שחזור בזיהוי התא והשושלת שלו.
    4. עוברים בתרבית לשלב ההתפתחותי הרצוי. העבירו את העוברים לצלחת פטרי המכילה 1x SS ודגרו עליהם בין 14-25 מעלות צלזיוס כדי לשלוט במהירות ההתפתחות.
      הערה: התלות בטמפרטורה של הפיתוח ניתנת לשחזור ותרשים עבור X. laevis, זמין ב- Xenbase23 (www.xenbase.org). גידול אצוות של עוברים בטמפרטורות שונות מאפשר שלבים התפתחותיים מדהימים. פעולה זו מסייעת לחלק את מספר העוברים הזמינים בזמן נתון לניסויים.
    5. עקוב אחר תבנית המחשוף של עוברים ובחר עוברים עם פיגמנטציה סטריאוטיפית ודפוסי מחשוף למיקרו-הזרקה16.
      הערה: בעת בחירת עוברים בני 16 ו-32 תאים, ודא ששסעיפי התאים סימטריים לצורך מעקב אחר שושלות הניתנות לשחזור.
  2. תייגו את התא(ים) שמעניינים אתכם
    1. הגדר את מחט ההזרקה המכילה את תמיסת נותב השושלת. הרכיבו את מחט המיקרו-הזרקה לתוך מחזיק מיקרופיפטה הנשלט על ידי מיקרומניפולטור רב-צירי.
    2. חבר את מחזיק המיקרופיפטה למיקרו-מזרק. מלא את המחט בעוקב השושלת על ידי הפעלת לחץ שלילי כמתואר במקום אחר16. איור 1A מדגים את ההגדרה.
    3. כיילו את המחט. התאם את גודל קצה המחט ואת זמן ההזרקה כדי לספק ~ 1 nL של תמיסת נותב השושלת, הנמדדת בשמן (מינרלי) בהתאם לפרוטוקול הזמין במקום אחר16.
      הערה: נימים עם קצה רחב יותר נוטים לפגוע בקרום התא, מה שגורם לתוכן תת-תאי ולעוקב השושלת המוזרק לדלוף החוצה, בעוד נימים עם קצוות קטנים יותר נוטים להיסתם. נימים עם ~ 10 מיקרומטר קוטר חיצוני קצה הם אידיאליים, דורשים פעימת לחץ 40 psi מעל ~ 300 ms כדי לספק ~ 1 nL.
    4. הציפו את צלחת החימר במיקרו-הזרקה בתמיסת 3% פיקול והעבירו ~10 עוברים לצלחת החימר באמצעות פיפטת העברה. השתמש בלולאת שיער כדי להנחות כל עובר לתוך באר ולמקם אותם בעדינות כך שתא היעד של העניין יהיה בזווית ישרה למיקרו-מחט.
    5. זהה את התא המקדים של השושלת המעניינת בעקבות מפות גורל הרקמה X. laevis. לדוגמה, איור 1 מדגים את התיוג של שיבוטים אקטודרמליים עצביים בהתבסס על הזרקת התאים המקדימים שלו בעוברים בני 32 תאים (תאי D111 משמאל ומימין).
      הערה: מפות גורל מפורטות עבור עוברים בני 16-6 ו-32 תאיםבני 7,8 זמינות בפלטפורמה אינטראקטיבית באמצעות Xenbase23. חשוב להקפיד על פיגמנטציה סטריאוטיפית ומחשופים על עוברים בעת השימוש בהם לניסויים לאיתור שושלות.
    6. הזריקו לתאים המעניינים ~1 nL של דקסטרן פלואורסצנטי או ~200 pg של mRNA כפי שתואר קודםלכן 16.
      הערה: השתמש במצומדות דקסטרן בהספק של 10,000-40,000 מגה-ואט. מצומדות דקסטרן קטנות יותר יכולות לעבור דרך צמתי רווחים, בעוד שמצומדות דקסטרן גדולות יותר עשויות שלא להתפזר באופן שווה לתוך התא המוזרק. תכננו להזריק תאים ב~10 עוברים כדי שיהיו להם מספיק רקמות לאנליזות פרוטאומיות.
    7. לאשר את ההצלחה של תיוג תאים תחת סטריאומיקרוסקופ. ודא שרק התא המיועד מוזרק. יש להשליך עוברים המכילים תאים פגומים או מסומנים באופן שגוי בהתאם למדיניות מוסדית.
      הערה: מכיוון ש - X. laevis פולשני בסביבות לא טבעיות רבות, ניתן להקפיא עוברים כדי להבטיח קטלניות לפני השלכת העוברים.
  3. בידוד צאצאי התא המסומנים
    1. מעבירים את העוברים המוזרקים ל-0.5x SS בצלוחית פטרי ומגדלים אותם בתרבית בין 14-25 מעלות צלזיוס עד שמגיעים לשלב ההתפתחותי הרצוי.
      הערה: התייעץ עם פרוטוקולים מבוססים לשלב עוברים שדווחו ב- Xenbase.
    2. מעבירים 3-5 עוברים לצלחת אגר עם תמיסת SS 0.2x למיקרודיסקציות.
      הערה: הפחתת ריכוז המלח של תמיסת SS מ-0.5x ל-0.2x מסייעת להפריד תאים במהלך דיסקציה.
    3. השתמש בשני מלקחיים מחודדים כדי להסיר בעדינות את קרום ויטלין המקיף את העובר.
      הערה: כדי לחסוך מהשיבוט עניין מנזק, קלף את הממברנה מהצד הנגדי של השיבוט המסומן באופן פלואורסצנטי.
    4. בודד את השכפול המסומן באמצעות דיסקציה ידנית (שלבים 3.3.5-3.3.6) או FACS (שלבים 3.3.7-3.3.8) באופן הבא.
    5. השתמש במלקחיים כדי לנתח את השיבוט המסומן מהעובר.
      הערה: ניתן להשתמש בכלים אחרים כגון מספריים מיקרוכירורגיים, מחטי טונגסטן או סכיני שיער גבות לנתיחת השיבוט המסומן, כמפורט במקום אחר16.
    6. לאסוף את הרקמה לנתח עם פיפטה 0.5-10 μL ולהפקיד אותם לתוך בקבוקון microcentrifuge. באמצעות פיפטת העברה, שאפו את המדיה סביב הרקמה שנאספה להגביל מלחים בדגימה, אשר מפריעים לניתוח HRMS בשלבים מאוחרים יותר.
      הערה: השתמש בבקבוקונים שממזערים את ספיחת החלבונים על משטחי פלסטיק כדי למזער את הפסדי החלבון על משטחי בקבוקונים במהלך שלבים מאוחרים יותר של זרימת העבודה.
    7. כדי לבודד על ידי FACS, העבר ~ 5-8 עוברים סוטים לכל באר של צלחת 12 בארות המכילה ~ 5 מ"ל של חיץ ניופורט 2.0. נתקו את העוברים על ידי ערבוב הצלחת ב-80 סל"ד למשך 20-30 דקות בטמפרטורת החדר13.
      הערה: לעוברים/זחלים שגילם עולה על שלב 22 יש שפע של חלבוני מטריצה חוץ-תאיים, מה שמקשה על דיסוציאציה לתאים נפרדים. ניתן להתאים גישות אנזימטיות נוספות לניתוק רקמות מעוברים ישנים יותר כמתואר במקום אחר24.
    8. לטהר את התאים המסומנים באופן פלואורסצנטי מהמתלה באמצעות FACS כמתואר במקום אחר24.
    9. תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ומשליכים את הסופרנטנט.
      הערה: השתמש במהירות צנטריפוגה נמוכה (400 × גרם) ובטמפרטורה נמוכה (4 ° C) כדי למנוע ליזה של תאים. אם אתם משתמשים באלבומין בסרום בקר (BSA) עבור FACS, שטפו את כדורית התא כדי להפחית את הפרעות ה-BSA במהלך זיהוי HRMS. השהה מחדש בעדינות את התאים במי מלח חוצצים פוספט 1x (PBS) ובצנטריפוגה שוב לתאים שטופי כדוריות. הסר את נוזל PBS supernatant.
    10. הקפיאו במהירות את התאים המבודדים על ידי הנחת בקבוקון הדגימה על קרח יבש או חנקן נוזלי.
      הערה: שמור את הדגימות (רקמות או תאים) מקוררות (למשל, על קרח) במהלך שלבי העיבוד. הקפיאו את התאים עם כמה שפחות מדיה סביב הדגימה כדי להקל על העיבוד במורד הזרם.
    11. אחסן את הדגימות ב -80 ° C עד ניתוח HRMS.

4. לנתח את החלבונים על ידי ספקטרומטריית מסות

אפיון פרוטאומי של הרקמות או התאים המבודדים מבוסס על סדרה של שלבים מבוססים ב- HRMS. איור 2 מדגים את השלבים של זרימת העבודה הביואנליטית. פרוטוקול איסוף הדגימות המשמש כאן תואם לזרימות עבודה של פרוטאומיקה מלמטה 11,25 מאמצע למטה או26 מלמעלה למטה. בהמשך מתוארת אסטרטגיית "מלמטה למעלה" בה נעשה שימוש במחקר זה, אשר הוכחה כרגישה, כמותית וניתנת להתאמה לסוגים שונים של ספקטרומטרים של מסות. לאחר מיצוי ועיכול אנזימטי של חלבונים, הפפטידים המתקבלים מופרדים, ולאחר מכן ניתוח HRMS.

  1. לעבד את הרקמות/תאים בודדים
    1. עבור ניתוח תא בודד על ידי CE, לחמם את הדגימה ל 60 ° C במשך ~ 15 דקות כדי denature חלבונים, ולאחר מכן לאזן את הדגימה לטמפרטורת החדר (RT, ~ 5 דקות) 18,21.
      הערה: שלא כמו במהלך עבודה עם רקמות, מדלגים על שלבי ההפחתה והאלקילציה כדי להגביל את אובדן החלבון במהלך הכנת הדגימה מתאים בודדים. ניתן לאמץ הכנת דגימות בעזרת מסנן (FASP)27,28, אסטרטגיות אחרות של סיר בודד 29 וגישות מיקרופלואידיות30 כדי למזער הפסדי חלבון במהלך הכנת הדגימה.
    2. לניתוח על ידי nanoLC, ליז עד 5 רקמות מנותחות ב 50 μL של חיץ ליזה (~ 100 מיקרוגרם של חלבון כולל). להקל על התהליך על ידי pipeting את הדגימה למעלה ולמטה כמה פעמים.
    3. לדגור את הליזט ב 4 ° C במשך 10 דקות, ולאחר מכן גלול את פסולת התא ואת טסיות החלמון על ידי צנטריפוגה ב 4,500 × גרם ב 4 ° C. מעבירים את הסופרנאטנט לבקבוקון מיקרוצנטריפוגה נקי ומוסיפים 10% SDS לקבלת ריכוז סופי של 1% SDS בליזט (v/v).
    4. עבור רקמות, בצע את השלבים 4.1.5-4.1.7.
    5. הוסף 0.5 M dithiothreitol לליזט כדי לקבל ריכוז סופי של ~ 25 mM (למשל, 2.5 μL של 0.5 M dithiothretol ל 50 μL של ליזט) ודגור את הליזט במשך 30 דקות ב 60 ° C כדי להפחית כימית קשרים דיסולפידים בחלבונים.
    6. הוסיפו 0.5 M יודואצטמיד כדי לקבל ריכוז סופי של ~75 מילימטר בליזט ודגרו על התערובת במשך 15 דקות ב-RT בחושך (איור 2).
    7. הוסף 0.5 M dithiothreitol, זהה לנפח ההתחלתי (למשל, 2.5 μL של 0.5 M dithiothretol ל- 50 μL של ליזט) כדי להרוות מגיבים שנותרו מתגובת האלקילציה.
      אזהרה: יודואצטמיד ודיתיותרייטול עלולים לגרום לנזק חמור לעור ולעיניים בחשיפה ישירה. השתמש בציוד הגנה אישי מתאים בעת טיפול בכימיקלים אלה.
    8. לטהר חלבונים באמצעות משקעים. משקעים מבוססי כלורופורם-מתנול מתפקדים היטב31. פרוטוקול זה ניתן להתאמה גם לסוגים אחרים של גישות משקעים32.
      הערה: עבור אנליזה של תא יחיד, שבו הפסדי חלבון מעוררים דאגה, דלג על שלב המשקעים עבור CE-HRMS.
    9. יבש את משקע החלבון ברכז ואקום (4-37 מעלות צלזיוס), ולאחר מכן השהה מחדש את הפרוטאום המופק ב 50 μL של 50 mM אמוניום ביקרבונט. הערך את ריכוז החלבון באמצעות בדיקה קולורימטרית כוללת של חלבון כדי לקבוע את כמות האנזים הדרושה לעיכול (למשל, בדיקת חלבון חומצה ביכונית).
    10. לעכל את החלבונים לפפטידים. הוסף טריפסין (1 מיקרוגרם/μL מלאי) כדי לקבל יחס פרוטאז:חלבון של 1:50 ודגור על התערובת ב 37 ° C עד 5 שעות עבור דגימות תא בודד ועד 14 שעות עבור דגימות רקמה. עיין בהמלצות ספציפיות לספק עבור התגובה.
      הערה: עיכול עם טריפסין במשך יותר מ -14 שעות או ריכוזים גבוהים יותר עלול להכניס מחשופים שאינם ספציפיים לרצף החלבון, ובכך לאתגר את זיהוי החלבונים33.
    11. כמת את ריכוז הפפטיד הכולל באמצעות בדיקה קולורימטרית.
    12. אופציונלי: לכימות ריבוב, תייג את הפפטידים מכל דגימה בתג מסה איזוברי שונה בהתאם להוראות ספציפיות לספק. מערבבים את הפפטידים המקודדים בפרופורציות שוות לכל דגימת פפטידים.
      הערה: הקפד על תיוג וערבוב מדויקים כדי למנוע הטיות כמותיות. עבור דגימות מוגבלות בכמות או דגימות חד-תאיות, ניתן לכלול תעלת נשא מבוססת TMT המורכבת מרקמות/תאים מאוגמים כדי למזער את אובדן הדגימות במהלך שלבי ההפרדה הבאים ולהגביר את הרגישות של חלבונים בעלי שפע נמוךיותר 34.
    13. אופציונלי: פפטידים להתפלה להסרת מלחים ומזהמים (למשל, ריאגנטים של תגי מסה איזוברית לא מגיבים) על עמודת/קצה ספין C18 בפאזה הפוכה להגנה על מערכת LC-MS.
    14. אופציונלי: שבר (למשל, שבר פאזה הפוכה בעל pH בינוני או גבוה) את תערובת הפפטידים, לזיהוי עמוק יותר של הפרוטאום באמצעות פלטפורמות ידניות או אוטומטיות. השתמש בפאזה נייחת C18 המכילה קצוות כדי לחלק כמויות נמוכות (1-10 מיקרוגרם) של עיכול פפטידים.
    15. יבשו את תערובת הפפטידים, בטמפרטורה של 60°C ברכז ואקום.
    16. אחסנו את תערובת הפפטידים, בטמפרטורה של -80°C עד למדידה.
  2. להפריד את הפפטידים
    הערה: לאחר מיצוי ועיכול אנזימטי של חלבונים, הפפטידים המתקבלים מופרדים על ידי nanoLC או CE ומיוננים על ידי ESI לריצוף על ידי HRMS טנדם. הפרדת ננו-LC בפאזה הפוכה אידיאלית לפפטידים הצוברים ~150 ננוגרם עד ~1 מיקרוגרם לאנליזה. CE מספק רגישות משלימה לפפטידים החל מפמטוגרמות ועד <100 ng. Various custom-built and commercial CE-ESI interfaces allow for ready coupling of CE to HRMS with robust performance35 ומשמשים יותר ויותר לניתוח תא בודד18,36,37.
    1. כדי להפריד באמצעות CE, בצע את השלבים 4.2.2-4.2.7.
      הערה: במה שלהלן מתואר השימוש בפלטפורמת CE המותאמת אישית למדידת הפפטידים. פרוטוקולים לבניית מכשיר CE זה ולשימוש בו סופקו מוקדם יותר38, יחד עם ניסוי חזותי על השימוש במולקולות קטנות20. לחלופין, מדידות אלה יכולות להתבצע על מערכת CE מסחרית, כגון AB SCIEX CESI, Agilent 7100, או שווה ערך.
    2. הרכיבו מחדש את עיכול החלבון ב-1-2 מיקרוליטר של ממס הדגימה, ערבבו את הדגימה וצנטריפוגה אותה ב-10,000 x גרם למשך 2 דקות לפסולת התא.
      הערה: סילוק פסולת התא ממזער את הסבירות לסתימת נימי CE, ובכך מאריך את חיי מערכת ההפרדה ומגביר את תפוקת המדידה.
    3. אתחל את מכשיר CE-ESI על ידי שטיפת נימי CE עם BGE.
    4. אמת ביצועים אינסטרומנטליים באמצעות תקן ידוע (למשל, cytochrome C או BSA digest, פפטידים אנגיוטנסין).
      הערה: מומלץ להעריך את המכשיר במונחים של דיוק מסה, רגישות זיהוי, יכולת שחזור וטווח דינמי ליניארי של כימות לפני מדידת דגימות יקרות. הערות נוספות על אימות ופתרון בעיות של ביצועי CE-ESI-MS מפורטות במקום אחר18,20,38.
    5. הזריקו ~1-10 nL של הדגימה לתוך נימי ההפרדה CE.
      הערה: מחקר זה משתמש ~ 1 מ 'סיליקה נימי מאוחה (40/110 מיקרומטר פנימי / חיצוני קוטר) עם מערך זרימת נדן שאוב אלקטרונית. מכשירי CE מסחריים דורשים בדרך כלל הצגה של 5-10 μL של דגימה במיקרוויאל להזרקה. פלטפורמת CE18,38 שנבנתה בהתאמה אישית תואמת ל~250 nL עד 1 μL של דגימה שהופקדה במיקרווויאל טעינת דגימה.
    6. מעבירים את קצה הכניסה של נימי ההפרדה CE לתוך BGE.
    7. התחל הפרדה אלקטרופורטית על ידי עלייה הדרגתית של מתח ההפרדה CE מהקרקע של כדור הארץ (למשל, צעד לאורך דקה אחת). פוטנציאלים של 20-28 kV עם זרם מתחת ~ 10 μA מבטיחים ביצועים אינסטרומנטליים יציבים וניתנים לשחזור לניתוח.
    8. כדי להפריד באמצעות nanoLC, בצע את השלבים 4.2.9-4.2.12.
    9. השהה מחדש את דגימת הפפטיד בשלב A נייד. ריכוז הדגימה ונפחה להזרקה תלוי במערכת LC ובעמודה הזמינה. במחקר זה, ~250 ng-1 מיקרוגרם של עיכול חלבון מוזרק בנפח דגימה של 1-20 מיקרוליטר על עמוד C18 ארוז מיטה (קוטר פנימי של 75 מיקרומטר, גודל חלקיקים של 2 מיקרומטר עם נקבוביות של 100 Å, עמוד הפרדה באורך 25 ס"מ).
    10. מעבירים את הדגימה לבקבוקון LC.
      הערה: ודא שאין בועות אוויר בבקבוקון, מה שעלול להזיק לעמודה האנליטית. בקבוקונים עם תוספות יכולים לשמש עבור רקמות בנפח נמוך או דגימות תא בודד.
    11. טען ~ 200 ng עד 2 מיקרוגרם של דגימת פפטיד על העמודה האנליטית C18.
      הערה: לחלופין, ניתן לטעון את הפפטידים על עמודת השמנה להתפלה לפני ההפרדה האנליטית. לדוגמה, עמוד השמנה C18 בקוטר פנימי של 0.1 מ"מ, גודל חלקיקים של 5 מיקרומטר, גודל נקבוביות של 100 Å, אורך של 20 מ"מ. פפטידים התפלה עם 100% חיץ A בקצב זרימה של 5 μL/min למשך 5 דקות לפני תחילת שיפוע ההפרדה.
    12. הפרידו את הפפטידים באמצעות הדבקה הדרגתית. בקצב זרימה של 300 nL/min, השיפוע של 120 דקות המשמש במחקר זה הוא כדלקמן: 0-5 דקות 2% B, 5-85 דקות 2-35% B, 86-90 דקות 70% B, 91-120 דקות 2% B.
  3. יינון הפפטידים על ידי ESI
    הערה: נימי CE או nanoLC מצומדים בדרך כלל למקור ESI לצורך יינון. ממשקי Micro-flow (קהה קצה) וננו-זרימה (tapered-tip39 ו-electrokinetic pumped sheath-flow36 design) CE-ESI לזיהוי רגיש במיוחד פותחו בעבר.
    1. ספק את הפפטידים המפרידים למקור יון אלקטרוספריי ליינון באמצעות ממשק ESI מסחרי או מותאם אישית. לניתוח CE-ESI-MS חד-תאי בעוברי Xenopus , השתמש בממשק זרימה נמוכה שאוב אלקטרונית שבו יציאת נימי CE סגורה בפולט בורוסיליקט משוך.
    2. בדוק את זרימת הנוזל דרך פולט התרסיס באמצעות מצלמה ובדוק חזותית את ההתקנה עבור דליפות אפשריות.
    3. הגדר את מתח ההתזה החשמלי ל~ 2.5 kV כדי להפעיל את מקור ESI (לעומת הארקת כדור הארץ).
    4. ודא ננו-ריסוס יציב לניתוח HRMS על ידי ניטור זרם היונים הכולל. כוונן את מתח ההתזה החשמלי ואת המרחק של הפולט לכניסת HRMS כדי להשיג ריסוס יציב (<15% סטיית תקן יחסית בעוצמה הכוללת).
  4. זיהוי הפפטידים
    הערה: זיהוי פפטידים מתבצע על פי שיקולים אינסטרומנטליים שונים עבור פפטידים בעלי מסה איזוברית מתויגת ולא מתויגת, ותלוי בסוג ספקטרומטר המסות הזמין. מחקר זה משתמש בספקטרומטר מסות טריבריד אורביטרפ על פי השלבים הבאים.
    1. לרכוש אירועי MS1 עם ההגדרות: Analyzer, orbitrap; רזולוציה ספקטרלית, 120,000 רוחב מלא בחצי מקסימום (FWHM); זמן הזרקה מרבי (IT), 50 אלפיות השנייה; בקרת הגברה אוטומטית (AGC), 4 x 105 ספירות; מיקרוסקינות, 1.
    2. כדי לרצף פפטידים, מקטע יונים מקדימים לזיהוי במנתח מלכודת היונים באמצעות ההגדרות: מצב פיצול, דיסוציאציה של התנגשות אנרגיה גבוהה יותר (HCD); גז התנגשות, חנקן; אנרגיית התנגשות, 32% אנרגיית התנגשות מנורמלת (NCE); מקסימום IT, 70 אלפיות השנייה; AGC, 1 x 104 ספירות; מיקרוסקינות, 1.
    3. אופציונלי: כמת פפטידים מתויגים TMT באמצעות HRMS דו-שלבי/רב-שלבי (MS2/MS3). עבור MS3 המשתמש בבחירת מבשר סינכרונית, ההגדרות האינסטרומנטליות האופייניות הן כדלקמן. סריקות חד-פאזיות (MS1) הסוקרות את היונים הנפוצים ביותר מנותקות באמצעות רכישה תלוית נתונים באמצעות הפרמטרים: מצב פיצול MS2 , דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות (CID); גז התנגשות, הליום; אנרגיית התנגשות, 35% NCE; מנתח עבור יוני פרגמנט, מלכודת יונים ההגדרות הבאות: מקסימום IT, 50 ms; AGC, 5 x 104 ספירות; מיקרוסקינות, 1. בחר 10 יוני פרגמנט MS2 ושבור אותם עם HCD בחנקן (65% NCE). זהה יוני פרגמנט MS3 באמצעות ההגדרות הבאות: רזולוציית אורביטרפ 15,000 FWHM, מקסימום IT, 120 אלפיות השנייה; AGC, 1 × 105 סעיפים; מיקרוסקינות, 1.
      הערה: ניתן להשתמש בשיטות ובפרמטרים שונים של רכישת MS עבור דוגמאות מתויגות בהתאם להמלצות הספק כמתואר במקום אחר11,40.
  5. ניתוח הנתונים
    הערה: חלבונים מזוהים ומכומתים באמצעות אריזות ביואינפורמטיות מתקדמות. נאמנות הזיהויים מחושבת באמצעות מסד נתונים של הטעיה, המתבטא בשיעור גילוי השווא (FDR) ברמת הפפטידים והחלבונים.
    1. עבד את הנתונים באמצעות חבילות תוכנה מסחריות או חבילות קוד פתוח (נסקר בהפניה41). התאימו את הנתונים הגולמיים למסד נתונים שהוכן על ידי שרשור Xenopus proteome 9.2 עם מסד הנתונים PHROG שמקורו ב-mRNA42.
      הערה: פרמטרי החיפוש הם: אנזים עיכול, טריפסין; מחשופים שהוחמצו, עד 2; שינוי משתנה, חמצון מתיונין; שינוי סטטי, ציסטאין carbamidomethylation; סובלנות המונית מבשרי, 10 עמודים לדקה; סובלנות מסה פרגמנט, 0.6 Da; אורך פפטיד מינימלי, 5; נאמנות זיהוי, <1% FDR עבור פפטידים וחלבונים. ללא אלקילציה לפפטידים, carbamidomethylation כשינוי סטטי אינו נכלל במהלך חיפוש מסד נתונים (למשל, עבור ניתוח תא בודד).
    2. כמת את שפע החלבונים באמצעות אסטרטגיות43 ללא תוויות או אסטרטגיות מבוססות תוויות44,45.
    3. אופציונלי: ביאור חלבונים לאונטולוגיה גנטית. ניתן להשתמש ב-PantherDB46, Reactome47 או Xenbase23 .
    4. אופציונלי: כימות שפע החלבונים וההבדלים בשפע החלבונים בין סוגי תאים/רקמות באמצעות חבילות תוכנה/כלי אינטרנט, כגון Trans-Proteomic Pipeline48, Perseus49 ו-Orange50.
      הערה: שיקולים נוספים לגבי תכנון ניסויים ואפשרויות תוכנה נסקרו במקום אחר41,51.
    5. אופציונלי: הערך את התוצאות עוד יותר באמצעות בסיסי ידע, כגון STRING52 ו- BioPlex Display 53 עבור אינטראקציות חלבון-חלבון ידועות ו- PhosphoSiteplus54 עבור פוספורילציות. לניתוח מוטיבים ותחומים המיוצגים בפרוטאום, השתמש בכלי אינטרנט כגון Simple Modular Architecture Research (SMART)55.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה איפשר לחקור חלבונים בתאים בודדים ואת השושלות שלהם כאשר הם מקימים רקמות בעוברים X. laevis. איור 1 מדגים יישום אחד כזה של הגישה לחקר חלבונים בתאים שגורלם רקמה עצבית והאקטודרם העצבי החדש שהושרה בעובר. כפי שניתן לראות באיור 1A, זרימת העבודה הביואנליטית שילבה כלים מסורתיים של ביולוגיה תאית והתפתחותית כדי לזהות, להזריק / לשאוף תאים ולאסוף דגימות. איור 1B מראה דגימת מיקרו-בדיקה של תא בעל חיים גבי שמאלי (D11)...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מאפשר אפיון ביטוי חלבונים בשושלות תאים מזוהות בעוברים מזן הקסנופוס . המתודולוגיה, המבוססת על HRMS, משלבת ספציפיות מעולה בזיהוי מולקולרי, יכולת לגילוי רב-חלבוני ללא בדיקות מולקולריות (בדרך כלל מאות עד אלפי חלבונים שונים), ויכולת כימות. הסתגלות לכלים קלאסיים ולתהליכי עבודה בביולוגיה תאית והתפתחותית (נוירו) מרחיבה את הפרוטאומיקה של HRMS ליישומים מרגשים, כולל אפיון הוליסטי של התמיינות תאי גזע בעובר X. laevis בעל חוליות.

השלבים מתארים פרוטאומיקה מונחית שושלת תאים בעובר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו אסירי תודה לג'יה לי (אוניברסיטת מרילנד, קולג' פארק) על דיונים חשובים על דיסוציאציה עוברית ו- FACS. אנו מודים ל- Vi M. Quach ול- Camille Lombard-Banek על הסיוע בהכנת הדגימות ואיסוף הנתונים במחקרים קודמים המדגימים את היישומים הפרוטאומיים המודגשים בפרוטוקול זה. חלקים מעבודה זו נתמכו על ידי הקרן הלאומית למדע תחת פרס מספר IOS-1832968 CAREER (ל- P.N.), המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R35GM124755 (ל- P.N.), תוכנית השותפות של אוניברסיטת מרילנד-המכון הלאומי לסרטן (ל- P.N.), ופרסי המחקר של קרן מועדון קוסמוס (ל- A.B.B. ו- L.R.P).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אצטוניטריל (דרגת LC-MS)פישר סיינטיפיקA955
אגרוזתרמו-פישר סיינטיפיקR0492
אמוניום ביקרבונטפישר סיינטיפיקA643-500
טור אנליטיתרמו סיינטיפיק164941
מיקרו-איזון אנליטימטלר-טולדוXSE105DU
פלטפורמת פיצול פפטידים אוטומטיתAgilent1260 Infinity II
Borosilicate CapillariesSutter Instruments Co.B100-50-10
נימי בורוסיליקט (לייצור פולטים)Sutter InstrumentsB100-75-10
C18 עמודי ספין (להתפלה)ThermoFisher Scientific89870
מצלמה למוניטור אלקטרוספרייEdmund Optics Inc.EO-2018C
קומברטסטטין A4Millipore SigmaC7744
מערכת CESI מסחריתAB SCIEXCESI
(Cyclohexylamino)-1-פרופנסולפונית חומצה (CAPS)VWR97061-492
ציטוכלאסין DMillipore SigmaC8273
Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, אניוני, ThermoFisher ניתן לתיקון ScientificD22910
DiothiothreitolFisher ScientificFERR0861
Dumont #5 מלקחייםFine Science Tools11252-30
EDTAFisher ScientificAAJ62786AP
מקור אור אפיפלואורסצנטיLumencoreAURA III
Eppendorf LoBing מיקרוצנטריפוגה  צינורות: חלבוןפישר Scientific13-698-793
חומצה פורמית (דרגת LC-MS)Fisher ScientificA117-50
(-20 ° ג)פישר סיינטיפיק97-926-1 
מקפיא (-80 מעלות; C)Thermo ScientificTSX40086A
נימי סיליקה התמזגוMolex1088150596
Heat BlockBenchmarkBSH300
מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוהThermoFisher ScientificDionex Ultimate 3000 RSLC ננו-מערכת
כוח מתח גבוהSpellmanCZE1000R
ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוההThermoFisher ScientificOrbitrap Fusion Lumos Tribrid ספקטרומטר
כובעי HPLC ThermoScientificC4013-40A
בקבוקוני HPLCThermo ScientificC4013-11
תאורה למשל צווארי אווזNikonC-FLED2
ניתוח מסלול ההמצאהQiagen
יודואצטמידפישר סיינטיפיקAC122275000
מתנול (דרגת LC-MS)פישר סיינטיפיקA456
מתנול (דרגת LC-MS)פישר סיינטיפיקA456-4
מושך מיקרו-נימיSuttor InstrumentsP-2000
מיקרו-מזרקוורנר מכשיר, הנדם, CTPLI-100A
מושך מיקרופיפטSutter Instruments Co.P-1000
מסחריתProteomeDiscoverer
MS,קוד פתוח MaxQuant
non-idet 40Millipore Sigma11754599001
צלחת פטרי 60 מ"מ ו-80 מ"מFisher ScientificS08184
Pierce 10 µ L bed Zip-tips (להתפלה)ThermoFisher Scientific87782
ערכת בדיקת חלבון חומצה ביסינצ'ונינית PierceThermoFisher Scientific23225
בדיקת פפטיד קולורימטרי כמותיPierce ThermoFisher Scientific23275
פירס טריפסין פרוטאז (דרגת MS)בקבוקוני
Eppendorf0030108434
, 0030108442
צנטריפוגה מקוררתEppendorf5430R
חממה מקוררתThermo ScientificPR505755R/3721
נתרן איזתיונאטMillipore Sigma220078
נתרן פירופוספטSigma Aldrich221368-100G
בקבוקון נירוסטה BGEבהתאמה אישית
סטריאומיקרוסקופ
סוכרוזVWR97063-790
משאבות מזרק (2)מכשירי הרווארד704506
1000 ומיקרו; LHamilton1750TTL
פיפטות העברה (פלסטיק, חד פעמי)Fisher Scientific13-711-7M
עמוד מלכודתThermo Scientific164750
Tris-HCl (תמיסה של 1 M)Fisher ScientificAAJ22638AP
רכז ואקום המסוגל לפעול ב-4– 10 & deg; CLabconco7310022
מערבולת-מיקסרBenchmarkBS-VM-1000
מים (דרגת LC-MS)Fisher ScientificW6
מים (דרגת LC-MS)שלב התרגום Fisher ScientificW6
XYZ שלב התרגוםThorlabsPT3
XYZנבנה
מקפיא ספק מסהתוכנת ניתוח נתונים MS, תוכנת ניתוח נתונים תחליף חלבון LoBind של Fisher Scientific PI90058 בקבוקונים לדוגמה מנירוסטה שנבנו בהתאמה אישית (אובייקטיבי 10x) Nikon SMZ 1270, SZX18 מזרקים (אטומים לגז): 500– בהתאמה אישית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shoemaker, L. D., Kornblum, H. I. Neural Stem Cells (NSCs) and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 344-354 (2016).
  2. Cervenka, J., et al. Proteomic characterization of human neural stem cells and their secretome during in vitro differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 612560(2021).
  3. Christian, J. L. Morphogen gradients in development: From form to function. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 1 (1), 3-15 (2012).
  4. Gurdon, J. B., Elsdale, T. R., M, F. Sexually mature individuals of Xenopus laevis from the transplantation of single somatic nuclei. Nature. 182, 64-65 (1958).
  5. Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends in Genetics. 27 (12), 507-515 (2011).
  6. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 119 (2), 560-578 (1987).
  7. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 122 (2), 300-319 (1987).
  8. Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
  9. Sun, L. L., et al. Single cell proteomics using frog (Xenopus laevis) blastomeres isolated from early stage embryos, which form a geometric progression in protein content. Analytical Chemistry. 88 (13), 6653-6657 (2016).
  10. Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry for discovery proteomics: quantifying translational cell heterogeneity in the 16-cell frog (Xenopus) embryo. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (7), 2454-2458 (2016).
  11. Zhang, Y. Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chemical Reviews. 113 (4), 2343-2394 (2013).
  12. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2000).
  13. Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
  14. Gupta, M., Sonnett, M., Ryazanova, L., Presler, M., Wuhr, M. Quantitative proteomics of xenopus embryos I, sample preparation. Xenopus. Methods in Molecular Biology. Vleminckx, K. 1865, Humana Press Inc. NY. 175-194 (2018).
  15. Baxi, A. B., Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Proteomic characterization of the neural ectoderm fated cell clones in the Xenopus laevis embryo by high-resolution mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 2064-2073 (2018).
  16. Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods in Molecular Biology. 135, 331-347 (2000).
  17. Sater, A. K., Moody, S. A. Using Xenopus to understand human diseases and developmental disorders. Genesis. 55 (1-2), 1-14 (2017).
  18. Lombard-Banek, C., Choi, S. B., Nemes, P. Enzyme Activity in Single Cells. Methods in Enzymology. Allbritton, N. L., Kovarik, M. L. 628, 263-292 (2019).
  19. Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. High-sensitivity mass spectrometry for probing gene translation in single embryonic cells in the early frog (Xenopus) embryo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 11(2016).
  20. Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. Microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (Xenopus laevis) embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56956(2017).
  21. Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Manzin, M. C., Nemes, P. Microsampling capillary electrophoresis mass spectrometry enables single-cell proteomics in complex tissues: developing cell clones in live Xenopus laevis and zebrafish embryos. Analytical Chemistry. 91 (7), 4797-4805 (2019).
  22. Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Developmental Biology. 120 (1), 299-304 (1987).
  23. Karimi, K., et al. Xenbase: a genomic, epigenomic and transcriptomic model organism database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 861-868 (2018).
  24. Kakebeen, A. D., Chitsazan, A. D., Wills, A. E. Tissue disaggregation and isolation of specific cell types from transgenic Xenopus appendages for transcriptional analysis by FACS. Developmental Dynamics. 250 (9), 1381-1392 (2021).
  25. Garcia, B. A. What does the future hold for top down mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 193-202 (2010).
  26. Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in top-down proteomics and the analysis of proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. (Palo Alto Calif). 9 (1), 499-519 (2016).
  27. Zhang, Z. B., Dubiak, K. M., Huber, P. W., Dovichi, N. J. Miniaturized filter-aided sample preparation (MICRO-FASP) method for high throughput, ultrasensitive proteomics sample preparation reveals proteome asymmetry in Xenopus laevis Embryos. Analytical Chemistry. 92 (7), 5554-5560 (2020).
  28. Wisniewski, J. R. Microbial Proteomics: Methods and Protocols.Methods in Molecular Biology. Becher, D. 1841, Humana Press Inc. NY. 3-10 (2018).
  29. Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  30. Zhu, Y., et al. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells. Nature Communications. 9, 882(2018).
  31. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute-solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  32. Jiang, L., He, L., Fountoulakis, M. Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis. Journal of Chromatography A. 1023 (2), 317-320 (2004).
  33. Hildonen, S., Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. Why less is more when generating tryptic peptides in bottom-up proteomics. Proteomics. 14 (17-18), 2031-2041 (2014).
  34. Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19, 161(2018).
  35. Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-mass spectrometry at trial by metabo-ring: effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
  36. Sun, L. L., Zhu, G. J., Zhang, Z. B., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-generation electrokinetically pumped sheath-flow nanospray interface with improved stability and sensitivity for automated capillary zone electrophoresis-mass spectrometry analysis of complex proteome digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
  37. DeLaney, K., Sauer, C. S., Vu, N. Q., Li, L. J. Recent advances and new perspectives in capillary electrophoresis-mass spectrometry for single cell "omics". Molecules. 24 (1), 21(2019).
  38. Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Protocols. 8 (4), 783-799 (2013).
  39. Choi, S. B., Zamarbide, M., Manzini, M. C., Nemes, P. Tapered-tip capillary electrophoresis nano-electrospray ionization mass spectrometry for ultrasensitive proteomics: the mouse cortex. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (4), 597-607 (2017).
  40. Pino, L. K., Rose, J., O'Broin, A., Shah, S., Schilling, B. Emerging mass spectrometry-based proteomics methodologies for novel biomedical applications. Biochemical Society Transactions. 48 (5), 1953-1966 (2020).
  41. Chen, C., Hou, J., Tanner, J. J., Cheng, J. L. Bioinformatics methods for mass spectrometry-based proteomics data analysis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 25(2020).
  42. Peshkin, L., et al. On the relationship of protein and mRNA dynamics in vertebrate embryonic development. Developmental Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
  43. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  44. Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
  45. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  46. Mi, H. Y., et al. PANTHER version 16: a revised family classification, tree-based classification tool, enhancer regions and extensive api. Nucleic Acids Research. 49, 394-403 (2021).
  47. Schmidt, E., et al. On the Move Federated Workshops. , Springer, Verlag. Berlin. 710-719 (2006).
  48. Deutsch, E. W., et al. Trans-Proteomic pipeline, a standardized data processing pipeline for large-scale reproducible proteomics informatics. Proteomics Clinical Applications. 9 (7-8), 745-754 (2015).
  49. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  50. Demsar, J., et al. Orange: Data mining toolbox in Python. Journal of Machine Learning Research. 14, 2349-2353 (2013).
  51. Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. Journal of Proteome Research. 8 (5), 2144-2156 (2009).
  52. Jensen, L. J., et al. STRING 8 - a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms. Nucleic Acids Research. 37, 412-416 (2009).
  53. Schweppe, D. K., Huttlin, E. L., Harper, J. W., Gygi, S. P. BioPlex display: an interactive suite for large-scale AP-MS protein-protein interaction data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 722-726 (2018).
  54. Hornbeck, P. V., et al. PhosphoSitePlus, 2014: mutations, PTMs and recalibrations. Nucleic Acids Research. 43, 512-520 (2015).
  55. Letunic, I., Khedkar, S., Bork, P. SMART: recent updates, new developments and status in 2020. Nucleic Acids Research. 49, 458-460 (2021).
  56. Lombard-Banek, C., et al. In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis). Angewandte Chemie-International Edition. 60 (23), 12852-12858 (2021).
  57. Lombard-Banek, C., Reddy, S., Moody, S. A., Nemes, P. Label-free quantification of proteins in single embryonic cells with neural fate in the cleavage-stage frog (Xenopus laevis) embryo using capillary electrophoresis electrospray ionization high-resolution mass spectrometry (CE-ESI-HRMS). Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2756-2768 (2016).
  58. Saha-Shah, A., et al. Single cell proteomics by data-independent acquisition to study embryonic asymmetry in Xenopus laevis. Analytical Chemistry. 91 (14), 8891-8899 (2019).
  59. Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Analytical Chemistry. 89 (13), 7069-7076 (2017).
  60. Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cell Lineage ProteomicsXenopus EmbryoProtein QuantificationFluorescence LabelingCell DissectionCapillary ElectrophoresisLiquid ChromatographyHigh Resolution Mass SpectrometryNeural Tissue Proteomics

מאמרים קשורים