ניתוח כמותי של תכונות ויסקו-אלסטיות של תאי דם אדומים באמצעות פינצטה אופטית ומיקרוסקופ defocus

Lucas Barreto; Fran Gomez; Pedro S. Lourenço; Douglas G. Freitas; Juliana Soares; Clemilson Berto-Junior; Ubirajara Agero; Nathan B. Viana; Bruno Pontes

doi:10.3791/63626

מאמר שיטה

ניתוח כמותי של תכונות ויסקו-אלסטיות של תאי דם אדומים באמצעות פינצטה אופטית ומיקרוסקופ defocus

DOI:

10.3791/63626

⸱

25 במרץ 2022

Lucas Barreto^*¹^,² , Fran Gomez^*¹^,² , Pedro S. Lourenço¹^,² , Douglas G. Freitas¹^,² , Juliana Soares¹^,³ , Clemilson Berto-Junior⁴^,⁵ , Ubirajara Agero⁶ , Nathan B. Viana¹^,² , Bruno Pontes¹^,²^,³^,⁷

¹Centro Nacional de Biologia Estrutural e Bioimagem - CENABIO, Universidade Federal do Rio de Janeiro, ²Instituto de Física, Programa de Pós-graduação Multidisciplinar em Física Aplicada, Universidade Federal do Rio de Janeiro, ³Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas Biofísica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, ⁴Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro - Campus Macaé, ⁵Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Endocrinologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, ⁶Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Física, Universidade Federal de Minas Gerais, ⁷Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, פרוטוקול משולב המבוסס על פינצטה אופטית ומיקרוסקופ defocus מתואר כדי למדוד את התכונות הריאולוגיות של תאים. פרוטוקול זה יש ישימות רחבה בחקר התכונות viscoelastic של אריתרוציטים בתנאים פיזיולוגיים-פתולוגיים משתנים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התכונות viscoelastic של אריתרוציטים נחקרו על ידי מגוון של טכניקות. עם זאת, נתוני הניסוי המדווחים משתנים. זה לא מיוחס רק לשונות הרגילה של תאים, אלא גם להבדלים בשיטות ובמודלים של תגובת התא. כאן, פרוטוקול משולב באמצעות פינצטה אופטית ומיקרוסקופ defocus משמש כדי לקבל את התכונות הריאולוגיות של תאי דם אדומים בטווח התדרים של 1 הרץ עד 35 הרץ. בעוד פינצטה אופטית משמשת למדידת הקבוע האלסטי המורכב על ידי אריתרוציטים, מיקרוסקופ defocus מסוגל לקבל את פרופיל גובה התא, נפחו וגורם הצורה שלו פרמטר המאפשר המרה של קבוע אלסטי מורכב למודולוס גזירה מורכב. יתר על כן, יישום מודל ריאולוגיה זכוכית רכה, מעריך קנה המידה עבור שני מודולי ניתן להשיג. המתודולוגיה שפותחה מאפשרת לחקור את ההתנהגות המכנית של תאי הדם האדומים, המאפיינת את הפרמטרים הוויסקו-אלסטיים שלהם, המתקבלים בתנאי ניסוי מוגדרים היטב, עבור מספר תנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי דם אדומים בוגרים (RBCs), הידועים גם בשם אריתרוציטים, מסוגלים להרחיב יותר מפי שניים מגודלם כאשר עוברים דרך הנימים הצרים ביותר של גוף האדם¹. יכולת זו מיוחסת ליכולתם הייחודית להתעוות כאשר הם נתונים לעומסים חיצוניים.

בשנים האחרונות, מחקרים שונים אפיינו תכונה זו במשטחי RBC ^2,3. תחום הפיזיקה המתאר את התגובות האלסטיות והצמיגיות של חומרים עקב עומסים חיצוניים נקרא ריאולוגיה. באופן כללי, כאשר מופעל כוח חיצוני, העיוות המתקבל תלוי בתכונות החומר וניתן לחלק אותו לעיוותים אלסטיים, האוגרים אנרגיה, או עיוותים צמיגיים, המפזרים אנרגיה⁴. כל התאים, כולל RBCs, מפגינים התנהגות ויסקו-אלסטית; במילים אחרות, האנרגיה נאגרת ומתפזרת. התגובה הוויסקו-אלסטית של התא יכולה אפוא להיות מאופיינת על ידי מודולוס הגזירה המורכב שלו G*(ω) = G'(ω) + iG"(ω), כאשר G' (ω) הוא מודולוס האחסון, הקשור להתנהגות האלסטית, ו-G" (ω) הוא מודולוס ההפסד, הקשור לצמיגותו⁴. יתר על כן, מודלים פנומנולוגיים שימשו לתיאור תגובות התא, אחד הנפוצים ביותר נקרא מודל ריאולוגיה זכוכית רכה⁵, המאופיין בתלות חוק כוח של מודולוס הגזירה המורכב עם תדירות העומס.

שיטות מבוססות תא בודד שימשו כדי לאפיין את התכונות הוויסקו-אלסטיות של RBCs, על ידי הפעלת כוח ומדידת תזוזה כפונקציה של העומס המוטל ^2,3. עם זאת, עבור מודולוס הגזירה המורכב, ניתן למצוא תוצאות מעטות בספרות. באמצעות פיזור אור דינמי, דווח על ערכים עבור מודולי אחסון ואובדן RBC הנעים בין 0.01-1 Pa, בתחום התדרים של 1-100 הרץ⁶. על ידי שימוש בציטומטריה אופטית מעוותת מגנטית, התקבל מודולוס אלסטי מורכב לכאורה⁷, ולצורך השוואה נטען כי גורם כפל עשוי להבהיר את אי ההתאמות.

לאחרונה, מתודולוגיה חדשה המבוססת על פינצטה אופטית (OT) יחד עם מיקרוסקופ defocus (DM), ככלי משולב למיפוי כמותי של אחסון ואובדן מודולי גזירה של אריתרוציטים אנושיים על עומסים תלויי זמן, הוקמה ^8,9. בנוסף, נעשה שימוש במודל ריאולוגיה רכה וזגוגית כדי להתאים את התוצאות ולקבל מקדם חוק כוח המאפיין את RBCs ^8,9.

בסך הכל, המתודולוגיה המפותחת^8,9, שהפרוטוקול עבורה מתואר בפירוט להלן, מבהירה אי-התאמות קודמות באמצעות הערכים הנמדדים עבור גורם הצורה, F_f^, המקשר כוחות ועיוותים ללחצים ומתחים בפני השטח של RBC וניתן להשתמש בו כשיטת אבחון חדשנית המסוגלת לקבוע כמותית את הפרמטרים הוויסקו-אלסטיים ואת תכונות הזכוכית הרכה של RBCs המתקבלים מאנשים עם דם שונה פתולוגיות. אפיון כזה, תוך שימוש בפרוטוקול המתואר להלן, עשוי לפתוח אפשרויות חדשות להבנת התנהגותם של RBCs מנקודת מבט מכנוביולוגית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות דם אנושיות סופקו על ידי מתנדבים בוגרים על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת האתיקה של המחקר של האוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז'ניירו (פרוטוקול 2.889.952) ונרשמו בפלטפורמת ברזיל תחת מספר CAAE 88140418.5.0000.5699. טופס הסכמה בכתב הונפק ונאסף מכל המתנדבים. אלו עם המוגלובינופתיה כלשהי ו / או נטילת תרופות מבוקרות לא נכללו. התהליך כולו פעל בהתאם להנחיות שאושרו על ידי ועדת האתיקה של המכון.

1. הכנת מחזיקי מדגם

יש לרכוש שתי כיסויים (24 מ"מ x 60 מ"מ ו- 24 מ"מ x 32 מ"מ; עובי = 0.13-0.17 מ"מ) וטבעת גומי אחת (קוטר = 10 מ"מ; עובי = 2 מ"מ) לכל מחזיק דגימה.
יוצקים שומן סיליקון על משטח טבעת הגומי באופן שמכסה את כל ההיקף.
הניחו את טבעת הגומי על הכיסוי כשצד השומן פונה לכיסוי. המתן 5 דקות לחיבור תקין, מחזיקי הדגימה מוכנים לקבל את תרבית התא.
הערה: בנוסף, ניתן להשתמש גם במנות תחתונות זכוכית מסחריות או ביתיות, כפי שתואר קודם לכן¹⁰.

2. תרבית תאים

הערה: השלבים הבאים מתארים כיצד להשיג RBCs בריאים מדם אנושי. חשוב שהדגימות יהיו מוכנות טריות לפני כל ניסוי.

לדלל 20 μL של דם ב 250 μL של 1x תמיסת מלח חיץ פוספט (PBS) המכילה 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1.8mM KH₂PO₄, 10 mM גלוקוז, בתוספת 1 מ"ג / מ"ל אלבומין בסרום בקר (BSA).
לאחר צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוף את supernatant באמצעות פיפטה ולהשהות מחדש את גלולת התא ב 1mL של 1x PBS/BSA פתרון. שטפו את התאים פי 2 במאגר.
חשב צפיפות תאים באמצעות המוציטומטר וזרע 50,000 עד 100,000 תאים במחזיק הדגימה שהוכן בשלב 1. המתן 10-15 דקות לחיבור תא לא ספציפי לתלוש הכיסוי; זמן ההמתנה אינו משפיע על התאים.
הוסף לדגימה 0.2 μL של תמיסת כדור פוליסטירן v/v 10% (רדיוס = 1.52 ± 0.02 מיקרומטר) לניסויי OT נוספים. ודא ערבוב נכון על ידי התבוננות בדגימות מתחת למיקרוסקופ.
לאחר זריעת תאים, פשוט מניחים את הכיסוי השני מעל טבעת הגומי (אין צורך להוסיף שומן לחיבור ביניהם), סוגרים את ההתקנה ומסיימים את הכנת הדגימה. הדגימות מוכנות לניתוח מיקרוסקופיה ומניפולציה.

3. הגדרת מיקרוסקופ פינצטה אופטי

הערה: OT הם כלים המשתמשים בקרן לייזר ממוקדת מאוד כדי ללכוד עצמים מיקרוסקופיים ולמדוד כוחות בתחום הפיקוניוטון ותזוזות בקנה מידה ננומטרי. לייזר OT המשמש (אורך גל של 1064 ננומטר) חייב להיות מיושר כראוי, כפי שתואר קודם לכן¹⁰.

בקצרה, באמצעות שתי מראות לפחות המופרדות על ידי מרחק של כמה סנטימטרים (10-20 ס"מ לפחות), לכוון קרן לייזר מקוטבת ליניארית לכיוון הכניסה האחורית של מיקרוסקופ הפוך. יישרו במדויק את קרן הלייזר כדי להיכנס למיקרוסקופ בקו ישר (איור 1).
לאחר מכן, שיקפו את קרן הלייזר באמצעות מראה דיכרואית, המותקנת במיקרוסקופ, כדי להתקדם במקביל לציר העדשה האובייקטיבית ולהיכנס לעדשה בסמוך למרכז הכניסה האחורית שלה. פעולה זו תמקד את הלייזר כדי ליצור את המלכודת האופטית (איור 1).
לאחר מכן, כדי למדוד כוחות עם OT, כיילו את המערכת כדי לקבל את קשיחות המלכודת (κ_OT). ראה¹⁰ לתיאור מפורט יותר של הליך כיול OT. ברגע שנמצא κ OT, מערכת _ה-OTמוכנה לניסויים בריאולוגיים.

4. הגדרת DM

הערה: DM היא טכניקת מיקרוסקופיה אופטית מבוססת שדה בהיר המאפשרת לעצמים שקופים להיות גלויים אם המיקרוסקופ מעט לא ממוקד^11,12. טכניקה כזו יושמה כדי להשיג את צורת RBC¹³. אותו מיקרוסקופ המשמש עבור מערכת OT יכול לשמש עבור DM, כדי לקבל פרופיל גובה באמצעות שחזורים תלת ממדיים.

כוונן את מערכת תאורת המיקרוסקופ על ידי ביצוע תאורת קוהלר¹⁴ , ולקבלת רזולוציה טובה יותר, פתח באופן מלא את דיאפרגמת המעבה כדי לבצע את הניסויים.
השתמש במערכת מיקום פיאזואלקטרית כדי להזיז את הדגימה בכל הקואורדינטות, בדיוק ננומטרי בציר z. בצע את הכיול האוטומטי של המערכת הפיזואלקטרית בכל הצירים. לאחר ביצוע כל ההליכים, מערכת המיקרוסקופ מוכנה לניסויי DM.

5. ניסוי וניתוח ריאולוגיה מבוססי OT

הערה: ניסוי הריאולוגיה מורכב מהתבוננות בתגובות התא לתנודות קטנות בתדרים משתנים.

ניסויים
1. באמצעות מערכת OT, לכוד את הכדור עם לייזר OT ולאחר מכן לחבר אותו RBC על ידי לחיצה על הכדור על פני התא קרוב לפני השטח העליון קרוב לקצה התא. השתמש במיקרוסקופ לשלב זה. לאחר מכן, לכוד כדור נוסף וחזור על אותו הליך התקשרות אך כעת חבר אותו לכיסוי, קרוב לתא. הכדור המחובר לתלוש הכיסוי הוא חרוז הייחוס (איור 2), אשר הכרחי כדי לעקוב אחר תזוזת הפיזו ולהשוות עם כדור RBC.
2. ודא כי התא שנבחר מחובר היטב לכיסוי וכי RBC וכדורי הייחוס נצמדו למשטח RBC ולכיסוי, בהתאמה, לפני תחילת המדידה. זהה חזותית את התאים שאינם נדבקים כפי שהם ינועו לאורך זמן, למרות שיעור ההדבקה הגבוה (סביב 80%-90%).
3. הוסף פונקציה סינוסואידלית של משרעת, ξ 0 = 0.500 ± 0.001 מיקרומטר ותדרים משתנים של 1 הרץ, 7 הרץ, 14 הרץ, 21 הרץ, 28 הרץ ו-35 הרץ, עם תדרים זוויתיים מתאימים, ω, של 6.3 ראד/שנייה, 169 ראד/שנייה, 88 ראד/שנייה, 132 ראד/שנייה, 176 ראד/שנייה ו-220 ראד/שנייה, לתוכנת הבמה הפיזואלקטרית, באמצעות התוכנה Piezoelectric, כפי שהודגם בעבר ^8,9.
4. באמצעות השלב הפיזואלקטרי, לחץ על כפתור ההתחלה כדי לאפשר את התזוזה הפיזואלקטרית ולשמור על כדור RBC במלכודת, שלח את הדגימה למחזור תנועות באמצעות הפונקציה הסינוסואידלית שנקבעה קודם לכן. השתמש במצלמה המסוגלת להפיק תמונות במהירות של 790 פריימים לשנייה ומעלה כדי להקליט את תנועת הדגימה. סכמה של הניסוי מוצגת באיור 2.
5. בזמן שהדגימה נשלחת לתנועות סינוסואידליות, הפעל את ה-OT כדי ללכוד את הכדור המחובר למשטח RBC. ללא קשר לטמפרטורה שנבחרה לביצוע הניסויים, טמפרטורת החדר, 37 מעלות צלזיוס או טמפרטורה אחרת, עקוב בקפידה אחר הטמפרטורה כדי למנוע שינויים במהלך המדידות. לייזר אינפרא אדום (1064 ננומטר) המשמש ליצירת OT כמעט ולא גורם נזק או חימום של התאים.
ניתוח
1. נתח את התמונות שהתקבלו במהלך התנועות הסינוסואידליות באמצעות ImageJ כדי למצוא את מרכז מיקום המסה של כל אחד מהכדורים לאורך זמן.
  הערה: נתונים אלה מאפשרים יצירת חלקות המסוגלות להציג הבדלי פאזה ומשרעת בין שני הספירות. מידע כזה חיוני להשגת התגובה הוויסקו-אלסטית של RBCs.
2. כדי לקבל את מרכז המסה עבור כל אחד מהכדורים, פתח את תוכנת ImageJ. ייבא את הסרט כולו שהתקבל במהלך התנועות הסינוסואידליות.
3. בכרטיסיה תמונה , לחץ על התאם ולאחר מכן בחר סף. חלון הסף ייפתח. בחר B&W. פעולה זו תהפוך את הרקע ללבן ואת הכדורים לשחורים.
4. התאם את הסף עם שני פסי הגלילה מתחת להיסטוגרמה כדי ששני הספירות יופיעו עם כמות הפיקסלים המרבית.
5. בחר את כדור ההתייחסות על ידי לחיצה על קובץ > מלבן. צייר מלבן כדי לבחור את הכדור. לאחר בחירת כדור ההתייחסות בתמונה אחת, ודאו שהמלבן בוחר נכון גם את אותו כדור בכל שאר תמונות הסרט.
6. לאחר מכן, בכרטיסייה נתח , לחץ על הגדר מדידות ובחר את מרכז המסה אופציה.
7. לחץ שוב על הכרטיסייה נתח ובחר נתח חלקיקים. ייפתח חלון חדש. הגדר את הגודל והמעגליות (בהתאם לרדיוס הכדור). סמן את התיבות הבאות: הצג תוצאות ונקה תוצאות. לבסוף, לחץ על אישור כדי לעבד את כל התמונות.
8. יופיע חלון חדש המכיל טבלה עם קואורדינטות xy למרכז המסה. שמור ערכי קואורדינטות אלה כקובץ .txt. חזור על ההליך עבור הכדור השני, המחובר למשטח RBC.
9. כדי לקבל את המשרעת ואת ההבדלים בפאזה עבור שני הספירות, פתח את תוכנת הניתוח. יבא את קבצי .txt שהושגו בעבר.
10. צור טבלה חדשה עם שלוש עמודות. בעמודה הראשונה (c0) הוסף את מספר המסגרות, בעמודה השנייה (c1) הוסף את הקואורדינטות x עבור כדור הייחוס, ובעמודה השלישית (c2), את הקואורדינטות x עבור הכדור המחובר למשטח RBC.
  הערה: בדוגמה זו, מכיוון שהתנועות הסינוסואידליות בוצעו רק בציר x, יש צורך להשתמש רק בקואורדינטות x עבור שתי הספירות.
11. לאחר מכן, להתאים את המסגרות עם הזמן. לחץ על הזנת נוסחה של Windows >. ייפתח חלון חדש בשם ערך נוסחה. בחלון זה ניתן להגדיר שמונה משוואות שונות, כל אחת מהן במפתח מסוים (מ-F1 עד F8).
12. בחר F1, הקלד את הנוסחה הבאה:
  c 3 = c0 / (מצלמה fps)
  לחץ על הפעל. פעולה זו תיצור עמודה חדשה לזמן מה בטבלה (עמודה 4).
13. הפחת את ערך קואורדינטות x של כל מסגרת בערך הממוצע המתאים לו. לשם כך, הקצה שני מפתחות בערך הנוסחה והקלד את המשוואות הבאות עבור כל מפתח:
  c 4 = (c 1 - mean(c 1)) ו- c 5 = (c 2 - mean(c2))
  לחץ על כפתור הפעלה . התוצאות יופיעו בעמודות 5 ו- 6 עבור כדורי התייחסות ו- RBC, בהתאמה.
14. המר את מרכז ערכי המסה מפיקסלים למיקרומטרים. לשם כך, השתמש במפתח אחר בערך הנוסחה והקלד את המשוואה הבאה:
  c 4 = c 4 / מספר המרה
  חזור על אותו תהליך עבור עמודה 5.
  הערה: ההמרה נרכשת באמצעות קנה מידה/סרגל מיקרומטר וקבלת התמונה שלה עם אותו מערך מיקרוסקופ המשמש למדידות (כולל אותה עדשה אובייקטיבית). הליך זה יכול להתבצע במהלך כיול המיקרוסקופ. כך מתקבל יחס פיקסל/מיקרומטר.
15. צור תרשים עם מרכזי המסה של שני הכדורים על ציר y וזמן על ציר x. לשם כך, לחץ על גלריה > ליניארי ופיזור. ייפתח חלון חדש. בחר את עמודת הזמן עבור ציר x ובציר y בחר את העמודות של מרכז המסה במיקרומטרים הן עבור כדורי ייחוס והן עבור כדורי RBC.
16. בחלקה, בחר רק את הנתונים הקשורים לתדר הזוויתי הראשון (6.3 rad/s). השתמשו בכלים המצוינים באיור 3.
17. הגדר את המשוואה המתאימה את עקומת הנתונים עבור כדור הייחוס. לשם כך, לחץ על Curve Fit > General ו- Fit1, בחר את תיבת הנתונים הקשורים למיקום כדור הייחוס ולאחר מכן לחץ על הגדר. ייפתח חלון חדש להגדרת המשוואה. המיקום ξ(t) של כדור הייחוס מתואר על ידי:
  ξ(t) = ξ₀cos(ωt)
  כאשר ξ היא התנועה הסינוסואידלית של הדגימה, ω היא התדירות הזוויתית ו-t הוא הזמן ב-S . העברת משוואה זו לתוכנת הניתוח, היא תיראה כך:
  כאשר m1 הוא ξ, m2 הוא f, m0 הוא הזמן t, ו-m3 הוא הפאזה של פונקציית הקוסינוס עבור t = 0.,
18. הערך את הערכים עבור m1, m2 ו- m3 מהמשטח. לאחר הגדרת המשוואה, לחץ על אישור. הנתונים יותאמו על בסיס המשוואה ותופיע עקומה יחד עם ריבוע קטן בגרף עם הערכים m1, m2 ו-m3.
19. הגדר את המשוואה המתאימה את עקומת הנתונים עבור כדור RBC. לשם כך, לחץ על Curve Fit > General והגדר את המשוואה שתתאים את העקומה עבור הנתונים. המיקום ρ(t) של כדור RBC נתון על ידי:
  
  כאשר ξ' היא מחוץ למשרעת הפאזה, ו-φ היא מחוץ לזווית הפאזה. העברת נוסחה זו לתוכנת הניתוח, היא תיראה כך:
  כאשר m1, m2 ו- m3 הם הערכים המתקבלים בהתאמת העקומה של כדור הייחוס., M4 הוא ξ' ו-M5 הוא φ.
20. הערך את הערכים עבור m4 ו- m5 מהמגרש. לאחר הגדרת הנוסחה, לחץ על אישור. הנתונים יותאמו על בסיס המשוואה, ובגרף תופיע עקומה יחד עם ריבוע קטן עם הערכים m4 ו-m5.
21. לאחר מכן, צור טבלה חדשה כדי להוסיף את הנתונים המתקבלים מהתאמת העקומה בעמודות המתאימות. הגדר חמש עמודות שונות עבור הפרמטרים הבאים: תדירות זוויתית, משרעת (כדור ייחוס), זמן התחלתי, משרעת (כדור RBC) וזווית מחוץ לפאזה. בצע את אותו הליך עבור כל התדרים האחרים.
22. השתמש במשוואות הבאות כדי למצוא את קבועי האחסון (K') וההפסד (K"):
  
  כאשר κ OT הוא הקבוע האלסטי _OTו- β הוא מקדם הגרר של סטוקס. העברת המשוואות לתוכנת הניתוח, זה ייראה כדלקמן:
  ו
  
  כאשר β ו- κ_OTצריכים להיות מוחלפים בערכים הנמצאים במערכת.,
23. שרטט את התוצאות בגרף, באמצעות ציר x עבור K " וציר y עבור K' (איור 4).

6. ניסוי וניתוח DM להשגת גורם הצורה הכולל של התא

רכישת וידאו
1. הזז את השלב הפיזואלקטרי בכיוון xy באמצעות התוכנה כדי לחפש תא מבודד המחובר לכיסוי. ללכוד ולחבר כדור פוליסטירן בקוטר ידוע למשטח RBC. באמצעות השלב הפיזואלקטרי, הזיזו מעט את החרוז הלכוד, המחובר גם הוא למשטח RBC, על מנת לעוות את התא, ולאחר מכן הצמידו את החרוז לכיסוי.
  הערה: ניתן גם להשתמש באותו תא ממדידות OT.
2. שנה את מיקום ציר z כדי למצוא את התמונה הממוקדת, כאשר מישור המיקוד נמצא במרכז התא שנבחר. תמונה זו מציגה את הניגודיות הקטנה יותר, כאשר רמת האפור במרכז התא שווה לרמת האפור מחוץ לתא (רקע).
3. כאשר המיקום קבוע, השתמש בתוכנת המצלמה כדי ליצור סרט של התא כולו עם כ- 5,000 תמונות ב- 8 סיביות ו- 256 פיקסלים x 256 פיקסלים, בקצב פריימים של 25 fps. לאחר מכן, הזז את מיקום ציר z 2 מיקרומטר למטה או למעלה כדי לקבל תמונה לא ממוקדת עבור התא שנבחר. חזור על הפרמטרים כדי ליצור סרט עבור מצב זה.
4. לבסוף, מבלי לשנות את מיקום ציר z, חפש אזור ללא תאים כדי לחזור על אותו הליך וליצור סרט של רקע התמונה.
רכישת תמונת ניגודיות
1. המירו כל אחד משלושת הסרטים לשלוש תמונות ממוצעות. באמצעות ImageJ, בחר אחד מהסרטים, לחץ על Image > Stacks > Z Project ובחר באפשרות עוצמה ממוצעת . חזור על הליך זה כדי שהסרטים האחרים יקבלו את התמונות שלהם.
2. שנה את כל התמונות שהתקבלו מ- 8 סיביות לנקודת ציפה של 32 סיביות. באמצעות ImageJ, לחץ על Image > הקלד > 32 סיביות. לאחר מכן, לחץ על נתח > הגדר מדידות ובחר את ערך אפור ממוצע אופציה. לבסוף, לחץ שוב על ניתוח > מדידה.
3. לאחר מכן, לחץ על מחשבון תמונה תהליך > וחלק את התמונה הממוקדת בתמונת הרקע. לתוצאה זו, הכפילו את הערך הממוצע של רמת האפור של התמונה הממוקדת. השג את הערך הממוצע על ידי לחיצה על תהליך > מתמטיקה > להכפיל .
4. כדי לקבל את הערך הממוצע, בחר את התמונה הממוקדת ולאחר מכן לחץ על נתח > מדידה. עבור התמונה המייצגת, הערך הממוצע של הרמה האפורה הוא 69,199. חזור על ההליכים לעיל עבור התמונה הממוקדת. במקרה זה, הערך הממוצע של הרמה האפורה הוא 69,231. איור 5 מראה את התמונות הממוקדות והלא ממוקדות לפני ואחרי ההליך.
5. תמונות עלולות לאבד ניגודיות חזותית במהלך פעולות. כדי להמחיש טוב יותר את התמונות, לחץ על תמונה > התאם > בהירות/ניגודיות ובחר באפשרות אוטומטי .
6. לאחר מכן, כדי למצוא את ניגודיות התמונה, השתמש בקשר הגומלין הבא:
  כאשר N _Img היא הרמה האפורה של התא, N₀ היא הרמה האפורה מחוץ לתא, והיא פרמטר קבוע המתאים לרמה האפורה עבור עוצמת אור אפסית התלויה במצלמה.,
7. כדי למצוא את הערך B, השתמש במד צריכת חשמל כדי למדוד את עוצמת האור. עבור כל ערך של עוצמת האור, יש להקליט סרטון; לכן, ערכי עוצמה שונים יכולים להיות קשורים לרמות שונות של אפור. לבסוף, קבל התאמה ליניארית וקשר את B לעוצמת האור האפסית¹⁵.
8. מצא את הערך של N₀, לחץ על סמל בחירת מצולע וצייר מצולע כמו זה שבאיור 6. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה נתח ובחר מדידה כדי למצוא את הרמה האפורה הממוצעת עבור האזור שנבחר. כל תמונה נוצרת על ידי קבוצת פיקסלים ולכל פיקסל יש רמת אפור מסוימת. קבוצת כל רמות האפור עקב כל הפיקסלים המרכיבים את התמונה תואמת ל - N_Img.
9. השתמש במשוואת הניגודיות כדי לקבוע N _Img - N_o ובצע זאת על-ידי בחירה באפשרות תהליך > מתמטיקה > חיסור. חלק את התוצאה ב- N₀ - B. לבסוף, מצא את הניגודיות עבור התמונה הממוקדת (C 0) והתמונה הממוקדת (C1).
השגת פרופיל הגובה
1. כדי להשיג את פרופיל הגובה, השתמש בשיטה¹³ המתוארת כבר. בקצרה, השתמש בהתמרת הארטלי (FHT) כדי להשיג את עובי RBC. ב- ImageJ, לחץ על Process > FFT > FFT Options, ולאחר מכן בחר FHT.
2. החסר את התמונות C0 ו- C1 ב- ImageJ באמצעות תהליך > מתמטיקה > חיסור כדי לקבל את התמונה עבור ההליך הבא, C= C0 - C1.
3. עבור תמונה C, לחץ על Process > FFT > FFT Options, ולאחר מכן בחר FHT כדי לבצע את שינוי הצורה Hartley של התמונה. לאחר מכן, חלק בתדר המרחבי q² באמצעות התוסף המותאם אישית DivideQ2. לחץ על תוסף > DivideQ2.
  הערה: יש להעתיק את הקובץ DivideQ2.class בספריית התוספים שבה מותקן ImageJ. התוסף מסופק כקובץ .class (קובץ משלים 1) שייכלל בתיקיית התוסף של ImageJ.
4. לאחר מכן, בצע את המרת הצורה ההופכית FHT באמצעות Process > FFT > FFT לקבלת תמונה עם רמת אפור פרופורציונלית לגובה התא.
5. לבסוף, לחץ על תהליך > מתמטיקה > הכפל כדי להכפיל את התמונה המתקבלת באמצעות הקבוע הבא:
  
  אשר מוגדר על בסיס המאפיינים של התמונות, המדגם, ואת מערך הניסוי¹³. כאן, n = 1.51 הוא מדד שבירת השמן, p = 0.0721 מיקרומטר הוא הקשר בין מיקרומטרים ופיקסלים של התמונות, Δ n = 0.058 הוא ההבדל בין RBC לבין מדדי השבירה הבינוניים המימיים, המרחק בין תמונות המיקוד וביטול המיקוד (Z f1 - Z_f2) = 2מיקרומטר, וגודל התמונות, N² = 256 pxl².
6. השתמשו בתמונה המתקבלת כדי לקבל את פרופיל הגובה (איור 7). התמונה המתקבלת משמשת ב- ImageJ לצפייה בפרופילי גובה שונים. תלוי היכן בתא ממוקם הקו האנכי הצהוב, לדוגמה, באיור 7 מתקבל פרופיל גובה המוגבל על ידי הקו האנכי, שימו לב לכך על ידי הקשה על Ctrl + K.
גורם צורה
1. לאחר מציאת התמונה הכוללת את פרופיל הגובה של RBC, השתמש בניגודיות של 2 מיקרומטר שאינה ממוקדת ליצירת ערכה של שתי תמונות ב- ImageJ. לחץ על Image > Stacks ולאחר מכן בחר באפשרות Images to Stack. כדי למצוא את גורם הצורה, השתמש במאקרו מותאם אישית של ImageJ כדי לנתח את הערימה. המאקרו המותאם אישית של ImageJ זמין להורדה כקובץ משלים 2.
  הערה: התוכנית משתמשת בתמונת ביטול המיקוד כדי לקבוע את קצוות התא. לאחר מכן הוא קובע את ההיקף, באמצעות התמונה הכוללת את פרופיל הגובה, לכל מיקום אופקי. בנוסף לקצוות, הוא קובע את ההיקף, כמו גם את ההופכי של ההיקף. סכום הערכים ההיקפיים ההופכיים, כפול עובי הפיקסלים, מתאים להופכי של גורם הצורה.
2. הכנס את יחס הפיקסל/מיקרומטר בתוכנית. קבל ערך זה מניסוי הכיול האובייקטיבי במיקרוסקופ. בדוגמה שבה נעשה שימוש, הערך הוא 13.87 פיקסלים/מיקרומטר.
3. בחרו במיקום ההתחלה האופקי כדי למקם את הקו הצהוב בתמונה הראשונה של הערימה. התחל את הקו לפני תחילת התא וצייר אותו מעבר לגבולות האנכיים של התא. בדוגמה, הקו הצהוב הוא בעל אורך של 153 פיקסלים והמיקום ההתחלתי הוא בין i = 70, y1 = 80 ו- i = 70, ו- y2 = 195. לאחר מכן, הזז את הקו הצהוב אופקית עד שהמיקום הסופי הוא f = 245, y1 = 80 ו- f = 245, ו- y2 = 195.
4. לבסוף, כדי למצוא את קצוות התא, את ההיקף ואת ההופכי של ההיקף, בחר את המאקרו הכרטיסייה ולחץ על הפעל מאקרו. המאקרו יספק טבלה עם מיקום הקצוות, ההיקף וההופכי של ההיקף, ותמונה של התא המנותח. בדקו אם הקצוות של תמונה זו דומים לקצוות של איור 7, אחרת, חזרו על ההליך.
5. השתמש בסכום ההופכי של ההיקף כדי למצוא את גורם הצורה⁸.

7. מודל ריאולוגיה זכוכית רכה וניתוח ניסויי

ארגון נתוני הניסוי בטבלה
1. צור טבלה חדשה בתוכנת הניתוח על ידי לחיצה על הכרטיסייה קובץ . קבע 10 עמודות שונות (מ- c0 עד c9) עבור הפרמטרים הבאים: תדרים זוויתיים בשימוש (rad/s): c0; ערכי K' (pN/μm) המתקבלים עבור כל תדר זוויתי: c1; ErrK': ג2; K" (pN/μm) ערכים המתקבלים עבור כל תדר זוויתי: c3; ErrK": ג4; ערכי G'(Pa) המתקבלים עבור כל תדר זוויתי: c5; ErrG': ג6; ערכי G" (Pa) המתקבלים עבור כל תדר זוויתי: c7; ErrG": c8 ו-F_f עם השגיאה המתאימה שלו: c9 (איור 8). השתמש בנוסחה הבאה כדי לאכלס את העמודות הבאות:
  C5 = (3 x c1) / (8 x 1.28 x 0.087)
  C6 = (3 / (8 x 0.087 x 1.28)) x sqrt (C2^2 + (C1 x 0.01 / 1.28)^2 + (C1 x 0.008 / 0.087) ^ 2)
  C7 = (3 x C3) / (8 x 1.28 x 0.087)
  C8 = (3 / (8 x 0.087 x C4)) x sqrt (C4^2 + (C3 x 0.01 / 1.28)^2 + (C3 x 0.008 / 0.087)^2)
עקומת התוויית G' (ω) לעומת G" (ω)
1. כדי ליצור את העקומה G' (ω) לעומת G" (ω) בתוכנת הניתוח, השתמש בנתונים מהטבלה הקודמת. לחץ על גלריה > ליניארי ובחר בפורמט מגרש פיזור.
2. ייפתח חלון חדש. בחר בעמודה G כציר x ובעמודה G כציר y. לבסוף, לחץ על מגרש כפתור כדי לקבל את הגרף.
3. כדי להוסיף את קווי השגיאה במגרש, לחץ על חלון העלילה ולאחר מכן לחץ על התוויית > קווי שגיאה. ייפתח חלון חדש. ראשית, סמן את האפשרות Y Err . חלון נוסף, שנקרא הגדרות שורת השגיאה ייפתח.
4. לחץ על % מהערך, בחר עמודת נתונים ולאחר מכן לחץ על העמודה ErrG'. לבסוף, לחץ על אישור > Plot, פסי השגיאה עבור ערכי y יופיעו. חזור על אותו הליך עבור ערכי ציר x על-ידי בחירת הריבוע X Err והעמודה הנכונה עבור ErrG". העלילה הסופית תהיה דומה לזו המוצגת באיור 9.
התאמת הפרמטרים למודל הריאולוגיה הזגוגית הרכה
הערה: ניתוח הנתונים מחולק לשני חלקים: 1) עקומה המתאימה לתרשים G (ω) לעומת G" (ω) כדי לקבל את הפרמטרים Γ ו- G_m; 2) עקומה המתאימה ל-G (ω) ול-G" (ω) כפונקציה של התדירות ω, כדי לקבל את מעריך חוק החזקה α.
1. עקומה המתאימה לתרשים G (ω) לעומת G" (ω) לקבלת הפרמטרים Γ ו- G_m.
  1. לחץ על הכרטיסייה התאמת עיקול , בחר Fit1. ייפתח חלון חדש. בחר את הריבוע ולחץ על כפתור הגדר . יופיע חלון שנקרא הגדרת התאמה כללית לעקומה. הקלד את המשוואה הבאה:
    m1 + m0/m2
    כאשר m1 = 61.576; m2 = 1, עם שגיאה מותרת של 1 x ^10-5. כאן m0 מייצג G ", m1 מייצג G_m ו- m2 מייצג Γ.
    הערה: עבור m1 ו- m2 יש צורך להעריך את הערכים המתאימים שלהם במהלך הגדרת התאמת העקומה. ההערכות לעיל התבססו על הניסוי לדוגמה שהוצג. בניסויים, להעריך את המספרים על פי הערכים שנצפו בעלילה.
  2. לחץ על כפתור אישור בשני החלונות וההתאמה תופיע, כפי שמוצג באיור 10 - עקומה שחורה. בדוק את הערכים הנכונים עבור m1 ו- m2, המפורטים בטבלת התאמת העקומה שהופיעה עם המשטח.
2. התאמת עקומה G' ו-G" כפונקציה של התדר הזוויתי ω
  1. לאחר מכן, צור שתי חלקות נוספות, כלומר, G' כפונקציה של ω ו- G' כפונקציה של ω. מקם את קווי השגיאה רק על ציר y, כפי שהודגם בעבר.
  2. חזור על הליך התאמת העקומה, אך כעת בבחירות התאמת עקומה, בחר באפשרות G" ולאחר מכן, בהגדרת התאמה כללית > עקומה, כתוב את המשוואה הבאה:
    
    במקרה זה, m1 הוערך כערך של G" (ω) = 23.683 Pa, כאשר ω = 6.3 rad/s; M2 הוערך ב-0.5 (זכרו ש-M2 הוא המעריך α ונע בין 0 ל-1). הכנס את הערך עבור Γ = 2.0293, בהתאם לתוצאה של m2 באיור 10.
  3. סמן את האפשרות נתוני משקל. לאחר כל הפרוצדורות הללו, לחצו על OK, ותופיע עקומה דומה לזו שבאיור 11 - עקומה כחולה. הערכים עבור α, α = 0.63 ± 0.02 ו- G 0, G 0 = (3.7 ± _0.3)Pa יופיעו. השתמש בערכים אלה כדי להתאים לעקומה הבאה, G' (ω).
  4. לחץ על העקומה הבאה, חזור על הליך התאמת העקומה אך כעת בהגדרת עקומת ההתאמה הכללית, כתוב את המשוואה הבאה:
    
    במקרה זה, m3 הוא רק ערך משוער של α כדי לאשר את הערך שהושג בעבר. השתמש בערכים עבור G ₀ = 3.703 ו- G' (ω) = 23.683 Pa כאשר ω = 6.3 rad/s.
  5. שוב, הוסף 1 x ^10-5 כשגיאה מותרת וסמן את האפשרות נתוני משקל. לאחר כל הפרוצדורות הללו, לחצו על OK, ותופיע עקומה דומה לזו שבאיור 11 - עקומה ירוקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מייצג את הסכמות של מערכת ה-OT ששימשו למדידות ריאולוגיה. איור 2 מראה את הסכמות של ניסוי המיקרו-ריאולוגיה עם שני הספירות, ומוצג גם RBC מייצג. איור 3 מראה עקומה טיפוסית למשרעת של שתי הספירות כפונקציה של זמן שבו התנועות הסינוסואידליות מיוצרות על-ידי השלב הפיזואלקטרי. בעוד כדור הייחוס (איור 3 - עקומה אדומה) מתנודד בעקבות תנועת השלב, כדור RBC (איור 3 - עקומה כחולה) מתנודד ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, מוצגת שיטה משולבת המבוססת על פינצטה אופטית ומיקרוסקופ defocus כדי למפות כמותית את התכונות הויסקו-אלסטיות של RBCs. נקבעות תוצאות עבור מודולי הגזירה של אחסון ואובדן, יחד עם מעריך קנה המידה המאפיין את הריאולוגיה הזגוגית הרכה של RBC. יישום פרוטוקול זה עבור תנאי ניסוי שונים, כגון במצב פיזיולוגי⁸ או לאורך כל שלב של P. falciparum תוך אריתרוציטי^{מחזור 9} כבר בוצע.

הפניות בספרות מצביעות על אי התאמות בריאולוגיה של RBC, המיוחסות בחלקן ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין כל אינטרס כלכלי במוצרים המתוארים בכתב יד זה ואין להם דבר נוסף לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לכל חברי מתקן המיקרוסקופיה המתקדם CENABIO על העזרה החשובה ביותר. עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנויות הברזילאיות Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Financial Code 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), ו- Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) יחד עם Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). B.P. נתמכה על ידי מענק JCNE מ-FAPERJ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג
צלחות תרבות 35 מ"מ	אלבומין סרום בקר Corning	430165
	Sigma-Aldrich	A9418
Coverslips	Knittel Glass	VD12460Y1A.01 ו-VD12432Y1A.01
כלי תחתית זכוכית	MatTek Life Sciences	P35G-0-10-C
גלוקוז	Sigma-Aldrich	G7021
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
שמן טבילה	ניקון	MXA22165
מיקרוסקופ הפוך	Nikon	Eclipse TE300
KaleidaGraph	Synergy Software	https://www.synergy.com/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
KH₂PO₄	מצלמת מיקרוסקופ Sigma-Aldrich	P5655
	Hamamatsu	C11440-10C
Na₂HPO₄	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
תא נויבאואר	Sigma-Aldrich	BR717805-1EA
ניקון		תוכנית APO 100X 1.4 NA DIC H; תוכנית APO 60x 1.4 NA DIC H ותוכנית APO 10x XXNA PH2
שולחן אופטי	Thorlabs	T1020CK
OT לייזר	IPG Photonics	YLR-5-1064-LP
מיקרוספירות פוליסטירן	Polysciences	17134-15
טבעת גומי	Forever Seals	NBR O-Ring
גריז סיליקון	Dow Corning	Z273554
מיקום במה	PI	P-545.3R8S
פיפטה	גילסון	P1000

עדשת אובייקטיבית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fowler, V. M. The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure. Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).
Tomaiuolo, G. Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (5), 051501(2014).
Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. A. Methods to investigate the deformability of RBC during malaria. Frontiers in Physiology. 10, 1613(2019).
Boal, D. Mechanics of the Cell. 2 edn. , Cambridge University Press. (2012).
Balland, M., et al. Power laws in microrheology experiments on living cells: Comparative analysis and modeling. Physical Review E. 74 (2), 021911(2006).
Amin, M. S., et al. Microrheology of red blood cell membranes using dynamic scattering microscopy. Optics Express. 15 (25), 17001-17009 (2007).
Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. American Journal of Physiology Cell Physiology. 293 (2), 597-605 (2007).
Gomez, F., et al. Effect of cell geometry in the evaluation of erythrocyte viscoelastic properties. Physical Review E. 101 (6-1), 062403(2020).
Gomez, F., et al. Plasmodium falciparum maturation across the intra-erythrocytic cycle shifts the soft glassy viscoelastic properties of red blood cells from a liquid-like towards a solid-like behavior. Experimental Cell Research. 397 (2), 112370(2020).
Pompeu, P., et al. Protocol to measure the membrane tension and bending modulus of cells using optical tweezers and scanning electron microscopy. STAR Protocols. 2 (1), 100283(2021).
Agero, U., Mesquita, L. G., Neves, B. R., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Defocusing microscopy. Microscopy Research and Technique. 65 (3), 159-165 (2004).
Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Physical Review E. 67 (5), 051904(2003).
Roma, P. M. S., Siman, L., Amaral, F. T., Agero, U., Mesquita, O. N. Total three-dimensional imaging of phase objects using defocusing microscopy: Application to red blood cells. Applied Physics Letters. 104 (25), 251107(2014).
Köhler, A. New method of illumination for photomicrographical purposes. Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).
Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. L. Native ultrastructure of the red cell cytoskeleton by cryo-electron tomography. Biophysical Journal. 101 (10), 2341-2350 (2011).
Ayala, Y. A., et al. Rheological properties of cells measured by optical tweezers. BMC Biophysics. 9, 5(2016).
Ayala, Y. A., et al. Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity. Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

ניתוח כמותי של תכונות ויסקו-אלסטיות של תאי דם אדומים באמצעות פינצטה אופטית ומיקרוסקופ defocus

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים