אנו מתארים שיפורים בשיטה סטנדרטית למדידת כוחות המתיחה התאית, המבוססת על הדפסה מיקרו-קונטרקטית עם שלב דפוס תת-קרקעי יחיד של מערכי נקודות של חלבוני מטריצה חוץ-תאית על הידרוג'לים רכים. שיטה זו מאפשרת ייצור פשוט ועקבי יותר של דפוסי איים, החיוניים לשליטה בצורת צביר התאים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיקרוסקופיית מתיחה מיקרו-פטרן מאפשרת שליטה על הצורה של תאים בודדים ואשכולות תאים. יתר על כן, היכולת לעצב בסולם אורך המיקרומטר מאפשרת שימוש באזורי מגע מעוצבים אלה למדידת כוחות מתיחה, שכן כל נקודה מיקרו-פטרנטית מאפשרת היווצרות של הידבקות מוקדית אחת המעוותת את ההידרוג'ל הרך והבסיסי. גישה זו שימשה למגוון רחב של סוגי תאים, כולל תאי אנדותל, תאי שריר חלקים, פיברובלסטים, טסיות דם ותאי אפיתל.
סקירה זו מתארת את האבולוציה של טכניקות המאפשרות הדפסה של חלבוני מטריצה חוץ-תאית על הידרוג'לים של פוליאקרילאמיד במערך קבוע של נקודות בגודל ובמרווחים שצוינו מראש. מכיוון שקשה להדפיס תבניות בקנה מידה של מיקרומטר ישירות על מצעים רכים, התבניות נוצרות תחילה על כיסויי זכוכית קשיחים המשמשים לאחר מכן להעברת התבנית להידרוג'ל במהלך הג'לציה. ראשית, מתוארת גישת ההדפסה המיקרו-קונטגטית המקורית ליצירת מערכים של נקודות קטנות על הכיסוי. צעד שני שמסיר את רוב התבנית כדי להשאיר איים של נקודות קטנות נדרש כדי לשלוט בצורות של תאים ואשכולות תאים על מערכים כאלה של נקודות מעוצבות.
לאחר מכן, מתוארת אבולוציה של גישה זו המאפשרת יצירת איים של נקודות באמצעות שלב דפוס תת-קרקעי יחיד. גישה זו היא פשוטה מאוד עבור המשתמש, אבל יש את החיסרון של אורך חיים מופחת עבור תבנית האב הדרושה כדי ליצור את הדפוסים. לבסוף, מתוארות הגישות החישוביות שפותחו לניתוח תמונות של נקודות שנעקרו ושדות מתיחה שנוצרו לאחר מכן על ידי תאים, וגרסאות מעודכנות של חבילות ניתוח אלה מסופקות.
מבוא
רוב הפנוטיפים של התא מפעילים כוחות אחיזה על סביבתם. כוחות מתיחה אלה נוצרים על ידי שלד הציטוסקלטון המתכווץ של התא, שהוא רשת של אקטין ומיוזין, וביופולימרים נימיים אחרים וחלבונים צולבים 1,2,3,4. כוחות הנוצרים בתוך התא יכולים להיות מועברים לסביבה החוץ-תאית או לתאים הסמוכים, בעיקר באמצעות חלבוני טרנס-ממברנה כגון אינטגרין וקדרינים, בהתאמה 5,6. האופן שבו תא מתפשט או מתכווץ - וגודל כוחות המתיחה הקשורים לתנועות אלה - הוא תוצאה של שיחה אינטימית עם סביבתו, התלויה במידה רבה בסוג ובכמות החלבון הק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. יצירת מאסטרים של סיליקון
הערה: רוב התהליך של העיצוב, היצירה ופתרון הבעיות של מאסטרים של סיליקון עבור יציקה חוזרת ונשנית של חותמות PDMS כוסה בעבר21, כך שרק הבדלים מרכזיים בגישה חדשה זו יתוארו כאן.
- צור את העיצוב עבור מסיכת הצילום באמצעות AutoCAD או תוכנת עיצוב דומה. מצפים צד אחד של מסכת הצילום, חתיכת זכוכית דקה, בשכבה דקה של כרום כדי לשלוט בפיזור אורות UV. עצבו את מסכת הצילום כך שאור UV בוהק דרכה אל הפוטורסיסט שנבחר ייצור מאסטר סיליקון עם ההופכי של התכונות הרצויות על חותמות ה-PDMS הסופיות. ראו איור 1 לעיצוב המסכה הזו.
הערה: השאלה אם התכונות הרצויות או האזור....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הידרוג'לים של PAA עם המודולוס של יאנג של E = 3.6 kPa והיחס של פואסון של ν = 0.445 נעשו לשימוש על ידי שיטת מיקרו-פטרינג תת-קרקעית זו. ההידרוג'לים יוצרו בעובי של כ-100 מיקרומטר, מה שמאפשר להם להיות מצטלם עם מערך ההדמיה שבו נעשה שימוש כאן, תוך מניעת חדירת התאים לכיסוי הנוקשה שמתחת לג'ל, מה שיגרום לבעיות במחקרים המתמקדים בחישת קשיחות תאית23,33. ג'לים של רמות נוקשות רבות אחרות (עד 30 kPa) נעשו בהצלחה והצטלמו באמצעות שיטת המיקרו-פטרנינג העקיפה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיטה משופרת לדפוס עקיף של הידרוג'לים של PAA מתוארת במאמר זה. גישה זו מתבססת על שיטות ששימשו בעבר 20,35,36,37,38,39,40,41,42. השינוי העיקרי הוא שחותמות PDMS משמשות כיום להסרת חלבון ולהשארת התבנית הרצויה מאחור על מצע הביניים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
המחברים רוצים להודות לד"ר פול ברבון מהמחלקה להנדסת מכונות באוניברסיטת בוסטון על דיונים מועילים וסיוע בניתוח נתונים. מחקר זה נתמך על ידי מענק NSF CMMI-1910401.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| (3-אמינופרופיל) trimethoxysilane | Sigma Aldrich | #281778 | |
| צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל | פישר סיינטיפיק | #05-408-129 | |
| צינור חרוטי 15 מ"ל | פישר סיינטיפיק | #05-539-12 | |
| 4 x 4 ב 0.060 קוורץ LR כרום | Photomask Advance Reproductions Corporation | N/A | מסכה מעוצבת בהתאמה אישית |
| 6 צלחות | בארפישר סיינטיפיק | #07-200-83 | |
| אצטון | פישר סיינטיפיק | #A18P-4 | |
| תמיסת אקרילאמיד, 40% | סיגמא אולדריץ' | #A4058 | |
| AlexaFluor 488 | תרמו פישר | #A20000 | |
| אמיניום פרסולפט | פישר סיינטיפיק | #BP179-25 | |
| ביסקרילאמיד | פישר סיינטיפיק | #PR-V3141 | |
| אתנול | גרינפילד גלובל | #111000200C1GL | |
| כיסויי זכוכית, 25 מ"מ עגול | פישר סיינטיפיק | #12-545-102 | |
| כיסויי זכוכית, 30 מ"מ וורנר עגול | 64-1499 | ||
| Hamamatsu ORCA-R2 מצלמה | Hamamatsu | #C10600-10B | |
| פלזמה אנושי | ביו-רפואי | #HP1051P | משמש לבידוד פיברונקטין |
| חומצה הידרוכלורית, 1.0 N | Millipore Sigma | #1.09057 | |
| ImageJ | וויין רסבנד | #1.53N | |
| סט כלים להחלפה | Bioptechs | #190310-35 | |
| קים מגבונים | פישר סיינטיפיק | #06-666-11C | |
| מסכה אלינגר | קארל סוס | #MA6 | |
| Matlab 2021 | Mathworks | #R2021a | |
| MetaMorph התקנים | מולקולריים | #v7.7.1.0 | |
| N-hydroxysuccinimide ester | Sigma Aldrich | #130672-5G | |
| NucBlue Live Cell Stain | Thermo Fisher | #R37605 | |
| Olympus IX2-ZDC מיקרוסקופ הפוך | אולימפוס | #IX81 | |
| PD-10 עמודי התפלה | GE Healthcare | #52-1308-00 | |
| מחקר התקדמות מכסה המנוע ספינר פוטו-רזיסט | #PWM32 | ||
| מנקה פלזמה | Harrick | #PDC-001 | |
| תחריט פלזמה | TePla | #M4L | |
| לומן קודם 200Pro מקור אור | Pre Scientific | #L200 | |
| פרוסות סיליקון, רקיק אוניברסיטאי 100 מ"מ | #809 | ||
| SU-8 2005 | קיאקו חומרים מתקדמים בע"מ | ||
| מפתחת SU-8 | Kayaku Advanced Materials Inc. | ||
| Sylgard 184 סיליקון אלסטומר | אסקס בראונל | #DC-184-1.1 | |
| טטרמתילאתילנדיאמין | פישר מדעי | #BP150-20 | |
| טריכלורו (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)סילאן | סיגמא אולדריץ' | #448931 | |
| UAPON-40XW340 אולימפוס אובייקטיבי | #N2709300 | ||
| חשיפה | לשיטפונות UVNewport | # 69910 | |
| מגש מנשא רקיקים, 110 x 11 מ"מ | Ted Pella, Inc. | #19395-40 |
מקורות
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
