מאמר שיטה

בניית מוטנטים הומוזיגוטיים של ארבה נודד בטכנולוגיית CRISPR/Cas9

DOI:

10.3791/63629

⸱

16 במרץ 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cotton Biology, Key Laboratory of Plant Stress Biology, School of Life Sciences, Henan University, 2Research Institute of Applied Biology, Shanxi University, 3School of Life Science, Shanxi University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מספק הליך מותאם באופן שיטתי של בנייה מבוססת ריבונוקלאז CRISPR/Cas9 של מוטציות ארבה הומוזיגוטיות, כמו גם שיטה מפורטת לשימור בהקפאה והחייאת ביצי ארבה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הארבה הנודדת, Locusta migratoria, היא לא רק אחת מארבות המגפה העולמיים שגרמו הפסדים כלכליים עצומים לבני אדם, אלא גם מודל מחקרי חשוב למטמורפוזה של חרקים. מערכת CRISPR/Cas9 יכולה לאתר במדויק במיקום דנ"א ספציפי ולהיבקע בתוך אתר המטרה, ולהציג ביעילות הפסקות דו-גדיליות כדי לגרום לנוקאאוט של גן המטרה או לשלב מקטעי גנים חדשים בלוקוס הספציפי. עריכת גנום בתיווך CRISPR/Cas9 היא כלי רב עוצמה להתמודדות עם שאלות בחקר הארבה, כמו גם טכנולוגיה מבטיחה להדברת ארבה. מחקר זה מספק פרוטוקול שיטתי לנוקאאוט גנים בתיווך CRISPR/Cas9 עם קומפלקס של חלבון Cas9 ורנ"א מנחה יחיד (sgRNAs) בארבה נודד. בחירת אתרי המטרה והעיצוב של sgRNA מתוארים בפירוט, ולאחר מכן סינתזת מבחנה ואימות של sgRNAs. הליכים מאוחרים יותר כוללים איסוף רפסודות ביצים והפרדת ביצים שזופות כדי להשיג מיקרו-הזרקה מוצלחת עם שיעור תמותה נמוך, תרבית ביצים, הערכה ראשונית של שיעור המוטציות, רבייה של ארבה וכן גילוי, שימור ומעבר של המוטנטים כדי להבטיח את יציבות האוכלוסייה של הארבה הערוך. שיטה זו יכולה לשמש כהפניה ליישומי עריכת גנים מבוססי CRISPR/Cas9 בארבה נודד כמו גם בחרקים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגיות עריכת גנים יכולות לשמש להחדרת החדרות או מחיקות למוקד גנום ספציפי כדי לשנות באופן מלאכותי את גן המטרה למטרה1. בשנים האחרונות, טכנולוגיית CRISPR/Cas9 התפתחה במהירות ויש לה היקף הולך וגדל של יישומים בתחומים שונים של מדעי החיים 2,3,4,5,6. מערכת CRISPR/Cas9 התגלתה עוד בשנת 19877, ונמצאה באופן נרחב בחיידקים ובארכאה. מחקר נוסף הצביע על כך שמדובר במערכת חיסון פרוקריוטית נרכשת התלויה בנוקלאז מונחה RNA Cas9 כדי להילחם בפאגים8. מערכת CR....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בחירת אתר יעד ועיצוב sgRNA

  1. לאסוף כמה שיותר מידע על רצפים עבור הגן המעניין באמצעות מחקר ספרותי ו / או חיפוש mRNA או רצף DNA מקודד (CDS) של הגן ב NCBI ומסד נתונים ארבה24.
  2. השווה את רצף הגן המעוניין לרצף הדנ"א הגנומי שלו כדי להבחין בין אזורי האקסון והאינטרון.
  3. בחר אזור מועמד לעיצוב אתר היעד בהתבסס על מטרת המחקר. תכנן זוגות פריימר כדי להגביר את מקטע האזור המועמד ולאמת את הרצף הפרוע שלו על ידי ניתוח רצף של מוצר ה- PCR.
    הערה: ישנן אסטרטגיות שונות לבחירת אזור היעד של המועמד. לדוגמה, ברוב מחקרי תפקודי הגנים/חלבונים, השתמשו במקטע האקסון הקרוב לקודון ההתחלה שלו כאזור המועמד כדי להבטיח שכל פונקציית החלבון....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מכיל את השלבים המפורטים ליצירת מוטציות הומוזיגוטיות של הארבה הנודד עם RNP המורכב מחלבון Cas9 ו- sgRNA מסונתז במבחנה . להלן כמה תוצאות מייצגות של נוקאאוט גן המטרה בתיווך CRISPR/Cas9 בארבה, כולל בחירת מטרה, סינתזה ואימות של sgRNA (איור 1A), איסוף והזרקת ביציות, סינון והעברה מוטנטיים, שימור בהקפאה והחייאה של הביציות ההומוזיגוטיות.

במחקר זה, אתר היעד של מערכת CRISPR/Cas9 נבחר על פי התוצאות של שלוש תוכניות מקוונות (E-CRISP, CRISPOR ו-ZiFit) וממוקם .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ארבה היה בין המזיקים ההרסניים ביותר לחקלאות מאז הציוויליזציה של בני האדם23 . טכנולוגיית עריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 היא כלי רב עוצמה להקניית ידע טוב יותר על המנגנונים הביולוגיים בארבה, כמו גם אסטרטגיית הדברה מבטיחה. לפיכך, יש תועלת רבה בפיתוח שיטה יעילה וקלה לשימוש של בנייה בתיווך CRISPR/Cas9 של מוטציות ארבה הומוזיגוטיות. למרות שכמה עבודות נהדרות דווחו וסיפקו זרימת עבודה בסיסית לעריכת גנום בארבה 18,20,21,22,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32070502, 31601697, 32072419 והקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (2020M672205).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10 פעמים; NEBuffer r3.1ניו אינגלנד BiolabsB7030Sהמאגר של   in vitro מבחני מחשוף Cas9
2xEs Taq MasterMix (צבע)CwbioCW0690להגברת גנים
2xPfu MasterMix (צבע)CwbioCW0686להגברת גנים
אתר מקוון CHOPCHOP
CRISPOROnline לעיצוב sgRNAs, http://crispor.org.
אתר CRISPRdirectOnline לעיצוב sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/.
ספק כוח אלקטרופורזהLIUYI BIOLOGYDYY-6Dהפרדה של מולקולות חומצות גרעין בגדלים שונים
אפנדורף Eppendorf30125177לאיסוף דגימות וכו '.
מברשות עדינותAnnigoni1235לניקוי ובידוד ביצים. נרכש באינטרנט.
חולץ מיקרופיפטה בוער/חוםSutter InstrumentP97להכנת מחטי המיקרו-הזרקה
ערכת מיצוי ג'לCwbioCW2302שחזור וטיהור DNA
מערכת ניתוח הדמיית ג'לOLYMPUSGel Doc XRהתבונן בתוצאות האלקטרופורזה
GeneTouch PlusBioerB-48DAלהגברת גנים
זכוכית נימי אלקטרודהGairdnerGD-102להכנה  מחטי הזרקה עם  א  חממת חולץ מיקרופיפטה
MEMMERTINplus55לתרבית עובר ארבה נודד
אמבט מתכתTIANGENAJ-800לחימום הדגימה
מיקרו מזרק אוטומטיEppendorf5253000068מיקרו-הזרקה של עוברים בשלב מוקדם בפיתוח
מיקרו צנטריפוגהAllshengMTV-1משמש לערבוב ריאגנטים
מיקרו-מטחנהNARISHIGEEG-401להארקת קצה מחט ההזרקה
MicroloaderEppendorf5242956003להעמסת תמיסות לתוך מחטי ההזרקה.
מערכת מיקרומניפולציהEppendorfTransferMan 4rמערכת מניפולציה אלטינטיבית למיקרו-הזרקה
מיקרוסקופcnoptecSZ780למניפולטור כונן מנוע מיקרו-הזרקה
NARISHIGEMM-94לשליטה במיקום המיקרופיפטה במהלך קדם המיקרו-הזרקה
מטחנת רקמות מרובת דגימהjingxinTissuelyser-64טוחנים והומוגניזציה של
סיר הביציםChangShengYuanYiCS-11מלא בחול סטרילי רטוב להטלת ארבה בו. האוציסטים נאספים ממיכל זה. נרכש באינטרנט.
ParafilmParafilmMPM996לעטיפת צלחות הפטרי.
ערכת שיבוט pEASY-T3TransGen BiotechCT301-01לשיבוט ת"א
צלחת פטריNEST752001לתרבית ושימור הביצים.
פיפטוראפנדורףמחקר פלוסלטעינת מדגם
לגידול ארבה בנפרד וכל פלסטיק גדולה מספיק (לא פחות מ-1000 מ"ל בנפח) תתאים. נרכש באינטרנט.
ערכת סינתזת gRNA מדויקתThermoA29377לסינתזת sgRNA
פריימר PremierPREMIER BiosoftPrimer Premier 5.00לעיצוב פריימר
SnapGeneInsightful ScienceSnapGene® 4.2.4לניתוח   רצפים כדורי
פלדהHuaXinGangQiuHXGQ60לטחינת מדגם. נרכש באינטרנט.
טיפיםbioleafD781349לטעינת דגימה
Trans DNA Marker IITransGen BiotechBM411-01משמש לקביעת גודל הגן
TrueCut Cas9 חלבון v2ThermoA36496Cas9 חלבון
UniversalGen DNA KitCwbioCWY004למיצוי DNA גנומי
VANNAS מספרייםמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית72932-01לכריתת האנטנות
חיטהליצירת שתילי חיטה כמזון לארבה. נקנה מחקלאים מקומיים.
ZiFiTOnline לעיצוב sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx.
לעיצוב sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/.אתר צינור תרבית פלסטיק אתר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doudna, J. A. The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature. 578 (7794), 229-236 (2020).
  2. van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., Schaffer, D. V. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechn....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

sgRNA

מאמרים קשורים