הפרוטוקול הנוכחי מתאר בדיקה להערכת היכולת לחמצון חומצות שומן בתרביות של תאי עצם ראשוניים או קווי תאים רלוונטיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר בדיקה להערכת היכולת לחמצון חומצות שומן בתרביות של תאי עצם ראשוניים או קווי תאים רלוונטיים.
היווצרות עצם על ידי הבחנה בין אוסטאובלסטים צפויה לדרוש קלט אנרגטי משמעותי מכיוון שתאים מיוחדים אלה חייבים לסנתז חלבוני מטריצה חוץ-תאיים גדולים המרכיבים רקמת עצם ולאחר מכן לרכז את היונים הדרושים למינרליזציה שלה. נתונים על הדרישות המטבוליות של היווצרות עצם צצים במהירות. בעוד שעדיין יש הרבה מה ללמוד, צפוי כי שיבושים בחילוף החומרים המתווך תורמים למחלות שלד. כאן, מתואר פרוטוקול להערכת יכולתם של תאים אוסטאובלסטיים לחמצן 14חומצות שומן המסומנות C ל-14CO2 ומטבוליטים מסיסים בחומצה. חומצות שומן מייצגות מאגר אנרגיה עשיר שניתן לקחת ממחזור הדם לאחר האכלה או לאחר שחרורן ממאגרי רקמת השומן. הבדיקה, המבוצעת בצלוחיות תרבית רקמה T-25, מועילה לחקר רווח או אובדן תפקוד גנים על ניצול חומצות שומן והשפעת אותות אנבוליים בצורה של גורמי גדילה או מורפוגנים הנחוצים לשמירה על מסת העצם. פרטים על היכולת להתאים את הפרוטוקול להערכת החמצון של גלוקוז או חומצות אמינו כמו גלוטמין מסופקים גם כן.
האוסטאובלסטים, שמקורם בתאי אב הנמצאים במח העצם ובפריאוסטאום, אחראי על סינתזה והפרשה של המטריצה המינרלית והעשירה בקולגן המרכיבה את רקמת העצם. כדי להגשים את המאמץ היקר מבחינה אנרגטית ולתרום לשמירה על שלמות השלד לכל החיים, תאים מיוחדים אלה שומרים על רשתית אנדופלזמית מחוספסת בשפע החיונית לסינתזה של חלבוני מטריצה חוץ-תאיים 1,2 ומספר רב של מיטוכונדריות בעלות פוטנציאל ממברנה גבוה כדי לקצור את האנרגיה הכימית הנדרשת ממצעי דלק 3,4. החשיבות של פונקציה אחרונה זו מודגמת על ידי הפסקת צמיחת העצם והתפתחות אוסטאופניה<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול זה משתמש בהמרה של [1-14C]-חומצה אולאית ל-14CO2 כאינדיקטור ליכולת חמצון חומצות שומן. המשרד המקומי לבטיחות קרינה אישר את הפרוטוקול לשימוש בחומרים רדיואקטיביים לפני תחילת הניסויים. כל הליכי הקרינה בוצעו מאחורי מגן פרספקס באמצעות ציוד מגן אישי מתאים. הוועדה המקומית לטיפול ושימוש בבעלי חיים אישרה את הפרוטוקול לפני השימוש בתאים ראשוניים.
1. חמצון חומצות שומן באוסטיאובלסטים מתורבתים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פעילות אנזימטית של קרניטין פלמיטואיל טרנספראז-1 (Cpt1) וקרניטין פלמיטואיל טרנספראז-2 (Cpt2) נדרשת לחמצון חומצות שומן ארוכות שרשרת מיטוכונדריה. Cpt1 הוא האנזים המגביל את הקצב במסלול המטבולי, אך שלושה איזופורמים (Cpt-1a, Cpt-1b ו-Cpt-1c) מקודדים בגנום של יונקים, והשיבוש הגנטי של איזופורם אחד יכול להוביל לוויסות פיצוי של איזופורםאחר 13. לעומת זאת, Cpt2 מקודד על ידי גן יחיד. בניסוי המוצג באיור 2A, אבלציה גנטית של Cpt2 מביאה להפחתה של ~60% בחמצון של [1-14C]-חומצ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
ההליך המתואר לעיל מאפשר הערכה ישירה של חמצון חומצות שומן שכן התפוקות הנמדדות הן 14CO2 שנאספו על נייר הסינון הספוג NaOH ומטבוליטים מסיסים בחומצה שנאספו לאחר החמצת התרבית בחומצה פרכלורית. ערכות בדיקה זמינות מסחרית המשתמשות במולקולות ליפידים עם תווית פלואורסצנטית או אנלוגים של שומנים יכולות למדוד את ספיגת השומנים, אך הן אינן קובעות קטבוליזם לייצור אנרגיה. מדדים אחרים של קטבוליזם, כגון 13שטף מטבולי C14, דורשים ציוד ניתוח מיוחד. בדיקה ז.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
עבודה זו נתמכה על ידי פרס סקירת הצטיינות משירות המחקר והפיתוח של המעבדה הביו-רפואית של המשרד למחקר ופיתוח לענייני חיילים משוחררים (BX003724) ומענק מהמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (DK099134).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| [1-14C]-חומצה אולאית | פרקין אלמר | NEC317050UC | |
| 15 x 30 מ"מ פקקי שרוול גומי | VWR | 89097-542 | |
| 1 מ"ל מזרק | BD דיוק | 309628 | |
| מחט 25 גרם (25 גרם x 1 1/2 אינץ') | BD דיוק | 305127 | |
| חומצה אסקורבית | סיגמא אולדריץ' | A4403 | |
| BCA ערכת בדיקת חלבון | Thermo Fisher | 23225 | ערכות אחרות מתאימות גם |
| Beckman Scintillation Counter, או שווה ערך | בקמן קולטר | LS6000SC | |
| בטא-גליצרול פוספט | סיגמא אולדריץ' | G6626 | |
| סרום בקר אלבומין | סיגמא אולדריץ' | 126609 | |
| קרניטין | סיגמא אולדריץ' | C0283 | |
| מאגר ליזה סלולרי | הפרוטוקול מתאים למאגרי ליזה טיפוסיים (כלומר RIPA) | ||
| s | סרום | ||
| זמין ממספר מקורות | |||
| חומצה פרכלורית | סיגמא אולדריץ' | 50439 | |
| בארות מרכזיות פוליפרופילן | VWR | 72760-048 | |
| נתרן הידרוקסיד | סיגמא אולדריץ' | S5881 | |
| T-25 בקבוק תרבית רקמות | צוואר קורנינג | 430639 | |
| חממת | |||
| טריפסין (0.25%)-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Ultima Gold (תמיסת נצנוץ) | PerkinElmer | 6013329 | |
| Whatman נייר כרומטוגרפיה | Sigma Aldrich | WHA3030917 |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מאמר זה פורסם
הסרטון יגיע בקרוב