Method Article

בדיקה ממוטבת של משיכה במולקולה בודדת לכימות של זרחון חלבונים

DOI:

10.3791/63665

⸱

June 6th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנת דגימה וניתוח נתונים לכימות זרחון חלבונים באמצעות מבחן משיכה משופר של מולקולה בודדת כלפי מטה (SiMPull).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פוספורילציה היא שינוי פוסט-טרנסלציוני הכרחי המווסת את תפקוד החלבון ומכוון את תוצאות האיתות של התאים. השיטות הנוכחיות למדידת פוספורילציה של חלבונים אינן יכולות לשמר את ההטרוגניות בזרחון על פני חלבונים בודדים. הבדיקה של משיכה חד-מולקולה (SiMPull) פותחה כדי לחקור את ההרכב של קומפלקסים מקרומולקולריים באמצעות מיצוי חיסוני של חלבונים על מכסה זכוכית ולאחר מכן הדמיה של מולקולה אחת. הטכניקה הנוכחית היא התאמה של SiMPull המספקת כימות חזק של מצב הזרחון של קולטני ממברנה באורך מלא ברמת המולקולה הבודדת. הדמיה של אלפי קולטנים בודדים בדרך זו מאפשרת לכמת את דפוסי הזרחון של חלבונים. הפרוטוקול הנוכחי מפרט את הליך SiMPull הממוטב, מהכנת דגימה ועד הדמיה. אופטימיזציה של הכנת זכוכית ופרוטוקולי קיבוע נוגדנים משפרת עוד יותר את איכות הנתונים. הפרוטוקול הנוכחי מספק קוד לניתוח נתונים של מולקולה בודדת המחשב את חלקם של הקולטנים הזרחניים בתוך דגימה. בעוד שעבודה זו מתמקדת בזרחון של קולטן גורם הגדילה האפידרמלי (EGFR), ניתן להכליל את הפרוטוקול לקולטני ממברנה אחרים ולמולקולות איתות ציטוזוליות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איתות הקשור לממברנה מכוון על ידי שילוב של הפעלת קולטן ממברנה המושרה על ידי ליגנד וגיוס של חלבוני אביזר במורד הזרם המפיצים את האות. זרחון של טירוזינים מרכזיים בזנבות ציטופלסמיים של קולטנים הוא קריטי לייזום היווצרותם של קומפלקסי איתות, או איתותים 1,2. לכן, שאלה חשובה בביולוגיה היא כיצד דפוסי זרחון נוצרים ומתוחזקים כדי לגייס שותפים לאיתות ולהכתיב את התוצאות התאית. זה כולל את הבנת ההטרוגניות של זרחון הקולטן, הן בשפע והן בדפוסי הפוספוטירוזין הספציפיים שיכולים לספק אמצעי למניפולציה של יציאות איתות על ידי הכתבת הרכב האיתות 3,4,5,6,7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת כיסוי

הערה: עבור שלב זה, יש ללבוש ציוד מגן אישי (PPE), הכולל שכבה כפולה של כפפות ניטריל, משקפי בטיחות או מגן פנים, ומעיל מעבדה.

  1. בצעו תחריט פיראנה כדי להסיר פסולת אורגנית מהזכוכית.
    זהירות: תמיסת פיראנה היא חומר מחמצן חזק שהוא קורוזיבי ותגובתי מאוד כאשר הוא בא במגע עם חומרים אורגניים. התגובה עם פסולת אורגנית היא אקסותרמית ובעלת פוטנציאל נפיץ. לכן, ההליך חייב להתבצע במכסה אדים כימי עם אבנט הוריד. כלי זכוכית Pyrex נדרשים כדי להתמודד עם פתרון פיראנה.
    1. הכינו את סביבת העבודה בתוך מכסה אדים כימי. מסדרים כיסויים ללא חפיפה בתחתית זכוכית 4 ליטר, "התגובה", ומניחים את התגובה על לוחית חמה בחום עדין. אפשרו לכלי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קריקטורה המתארת את תהליך SiMPull מוצגת באיור 1A. הכיסויים מתפקדים תוך שימוש ב-NeutrAvidin כעוגן לנוגדנים נגד EGFR שעברו ביוטינילציה כדי ללכוד EGFR-GFP מתוך סך כל החלבון ליזאטים. לאחר שטיפת חלבון לא מאוגד, הקולטנים הזרחניים מסומנים בנוגדן אנטי-פוספוטירוזין (אנטי-PY)15. איור 1B מציג תמונה של המערך ההידרופובי, שבו ניתן להכין דגימות מרובות ולדמות אותן על אותו כיסוי. אחד היתרונות של מחזיק מדגם זה הוא שנדרשים נפחי דגימה מינימליים של ~ 10 μL. ני.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול שתואר כאן הותאם כדי לאפשר מדידות כמותיות של זרחון הקולטן ברמת החלבון הבודד. פותחו מספר שינויים פשוטים אך חשובים בפרוטוקול SiMPull ששיפרו את אמינות המדידה לזיהוי פוספו-טירוזין, כולל הפחתת האוטו-פלואורסצנציה באמצעות טיפול ב-NaBH4 ופרסום הדגימה כדי למנוע דיסוציאציה של נוגדנים. שימוש במסכת התעלה הירוקה כדי לזהות מיקומי קולטנים לחישוב קולוקליזציה עם הנוגדן נגד PY גם משפר את דיוק המדידה על ידי הסרת ממצאים פוטנציאליים מהקשירה הלא ספציפית של הנוגדן לליסאט התא. ההדמיה הדו-צבעית שימשה לזיהוי חלקם של הקולטנים ש.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R35GM126934, R01AI153617, ו- R01CA248166 ל- DSL. EMB נתמך באמצעות תוכנית ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) ו- JAR על ידי תוכנית UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). אנו מודים על השימוש במשאב המשותף של מרכז הסרטן המקיף של אוניברסיטת ניו מקסיקו, הנתמך על ידי NIH P30CA118100. אנו רוצים להודות לד"ר אנקור ג'יין ולטאקיג'יפ הא, שהפיתוח המקורי שלהם של SiMPull היווה השראה לעבודה זו.
כתובת נוכחית של ES-C: קבוצת אימונודינמיקה, המעבדה לאימונולוגיה אינטגרטיבית של סרטן, המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן, בת'סדה

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לMTC BioC2000
10 מ"מ Tris-HCl pH 7.4
10 מ"מ Tris-HCl pH 8.0 / 50 מ"מ NaClT50 מאגר
100 מ"מ צלחת תרבית רקמותCELLTREAT229620אחסון זכוכית/מערכים חרוטים פיראנה
15 מ"ל צינור
16% פרפורמלדהיד מימי מדעימיקרוסקופיה אלקטרוניתתמיסה15710
חרוטי מסוכן 50 מ"לאחסון זכוכית פונקציונלית/ שימוש חוזר KOH
50 מ"מ Tris-HCl pH 7.2/150 מ"מ רכיבחיץ ליזה
60 מ"מ צלחת תרביתרקמות קורנינג430166
8% גלוטראלדהיד תמיסה מימיתמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית16020
אצטון מסוכן (C3H6O)Millipore Sigma270725Dangerous
Alexa Fluor 647 NHSEster Thermo Fisher ScientificA-20006
ללא בעלי חיים רקומביננטי אנושיEGF PeprotechAF-100-15
אנטי-אנושי EGFR (תחום חיצוני) – ביוטיןLeinco Technologies, IncE101
נוגדן נגד p-Tyr (PY99) Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-7020 AF647
Bath-sonicatorBranson1200
BCA ערכת בדיקת חלבוןPierce23227
Biotin-PEGLaysan BioBiotin-PEG-SVA, MW 5,000
אלבומיןסרום בקרGold BiotechnologyA-420-1רכיב החיץ של Tyrode
משפך בוכנר מבער
בונסן
סידן כלורי (CaCl2)Millipore SigmaC4901Tyrode's Buffer Component
מגרד תאיםBioworld30900017-1
בקבוק סינון חרוטיפישר ScientificS15464
צנצנת קופליןWHEATON900470
Countess II מונה תאים אוטומטיתרמו פישר
מדעיים 24 x 60 #1.5מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית63793
DipImagehttps://diplib.org/
DMEMCaisson LabsDML19-500
מצלמת emCCDAndor iXon
סרום בקר עוברי, OptimaBio-TechneS12450Hחום מושבת
היתוך 360 תוכנהAutodesk
Geneticin G418 DisulfateCaisson LabsG030-5GM
חומצה אצטית קרחונית (CH3COOH)JT BakerJTB-9526-01מסוכן
פיפטות סרולוגיות
מזכוכית מוט
זכוכית גלוקוז (D-(+)-גלוקוז)Millipore SigmaD9434רכיב החיץ של טירוד
קוקטייל מעכב פוספוטאז ופרוטאז (100X)Thermo Fisher Scientific78446רכיב חיץ ליזה
HEPESMillipore SigmaH3375Tyrodeרכיב חיץ
חומצה הידרוכלורית (HCl)VWRBDH7204-1
מי חמצן מסוכנים (H2O2) (3%)HX0645
מי חמצן (H2O2) (30%)EMD MilliporeHX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 ( NP-40)Sigma AldrichI8896רכיב חיץ ליזה
ImmEdge מחסום הידרופובי עטוקטור מעבדותH-4000
Immersol 518F שמן טבילהZeiss444960-0000-000
ואקום פנימי
L-גלוטמיןתרמו פישר מדעי25030-164
מגנסיום כלוריד הקסהידראט (MgCl2-6H2O)MPBio2191421Tyrode's Buffer Component
MatlabMathworksארגז כלים להתאמת עקומה, ארגז כלים למחשוב מקבילי וארגז כלים לסטטיסטיקה ולמידת מכונה
מתנול (CH3OH)IBIS ScientificMX0486-1
מסוכנים Milli-Q
ערכות תיוג נוגדנים לצבע Mix-n-StainCF Biotium92245ערכת צימוד מוצעת
mPEGLaysan BiomPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilaneUCT United ChemicalA0700
Dangerous NanogridMiraloma Tech
NeutrAvidin Biotin חלבון מחייבתרמו פישר סיינטיפיק31000
חנקן (גז דחוס)
NVIDIA GPU עם CUDAחפש תאימות ב-https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 מיקרוסקופאולימפוס
פרפילם M סרט איטוםמחסן המעבדהHS234526C
PBS pH 7.4Caisson LabsPBL06
PC-200 אנלוגי פלטה חמהקורנינג6795-200
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-163
קולטן פוספו-EGF (Tyr1068) (1H12)טכנולוגיית איתות תאים2236BF
אשלגן כלורי (KCl)Millipore Sigma529552 רכיב החיץ של Tyrode
אשלגן הידרוקסיד (KOH)Millipore Sigma1050330500פרימיום מסוכנת
, קוטר 1.75 מ"מלהעלות PMS תלת מימדי: 2035U / RAL: 3028טווח טמפרטורות הדפסה: 205-235 & deg; מדפסת תלת
מימד C Pro2להעלות תלת מימד
פיירקס 1 ליטר
PYREX 100 מ"ל בקבוקי אחסוןקורנינג1395-100CH3OH/C3H6O לשימוש חוזר
פיירקס 250 מ"ל כוסות
פיירקס 4 ליטר תמונה
עם ארבע תצוגות פוטומטריהמפצל דגם QV2
צנטריפוגה מקוררתEppendorfEP-5415R
RevCount מוני תאים, שקופיות ספירת תאים EVEVWR10027-446
מסנני פליטה של Semrock: כחול (445/45 ננומטר), ירוק (525/45 ננומטר), אדום (600/37 ננומטר), אדום רחוק (685/40 ננומטר)SemrockLF405/488/561/635-4X4M-B-000
בקר פיפטה סרולוגי
פיפטות
מריחות חבילתhttps://github.com/LidkeLab/smite.git
נתרן ביקרבונט (NaHCO3)Sigma AldrichS6014
נתרן בורוהידריד מסוכן (NaBH4)Millipore Sigma452874Tyrode' s רכיב חיץ
נתרן כלורי (NaCl)Millipore SigmaS9625מופעל על ידי מחזור חום ו-pH עוקב
נתרן הידרוקסידVWRBDH3247-1
נתרן אורתוואנדאט (Na3VO4)Millipore SigmaS6508
חומצה גופרתית מסוכנת (H2SO4)Millipore Sigma258105מסוכן
TetraSpeck MicrospheresThermo Fisher ScientificT7279חרוזים רב-פלואורסצנטיים
בסיס Tris (Trizma) בסיסMillipore SigmaT1503
Trypan Blue Stain, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA 0.05%Thermo Fisher Scientific25300120
חרוטיצינור NaCl כיסויי AMQAX1000 ערבובקו מים mAb של עכבר נימה PLA סרולוגיות ניתוח מולקולה בודדת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule Pull DownProtein PhosphorylationPhosphorylation QuantificationEGFR PhosphorylationImmunoprecipitation AssayAntibody LabelingGlass PreparationSingle Molecule ImagingColocalization AnalysisGaussian Localization

Related Articles