הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצב הסיאטי על ידי נשימה ברזולוציה גבוהה

Summary

נשימה ברזולוציה גבוהה המוצמדת לחיישנים פלואורסצנטיים קובעת את צריכת החמצן המיטוכונדריה ואת ייצור מיני החמצן הריאקטיבי (ROS). הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה להערכת שיעורי הנשימה המיטוכונדריאליים וייצור ROS בעצב הסיאטי החודר.

Abstract

תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בעצבים היקפיים מלווה מספר מחלות הקשורות לנוירופתיה היקפית, אשר יכולות להיות מופעלות על ידי גורמים מרובים, כולל מחלות אוטואימוניות, סוכרת, זיהומים, הפרעות תורשתיות וגידולים. הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצבים ההיקפיים של העכבר יכולה להיות מאתגרת בשל גודל המדגם הקטן, מספר מוגבל של מיטוכונדריה הנמצאת ברקמה, ונוכחותו של נדן מיאלין. הטכניקה המתוארת בעבודה זו ממזערת את האתגרים הללו על ידי שימוש בפרוטוקול חדירה ייחודי המותאם מאחד המשמש לסיבי שריר, כדי להעריך את תפקוד המיטוכונדריה העצבית הסיאטית במקום לבודד את המיטוכונדריה מהרקמה. על ידי מדידת ייצור מינים תגובתיים פלואורימטריים עם Amplex Red/Peroxidase והשוואת מצעים ומעכבים מיטוכונדריאליים שונים בעצבים מחלחלים של סאפונין, ניתן היה לזהות מצבי נשימה מיטוכונדריאליים, מיני חמצן תגובתי (ROS) ופעילות של קומפלקסים מיטוכונדריאליים בו זמנית. לכן, השיטה המוצגת כאן מציעה יתרונות בהשוואה להערכת תפקוד המיטוכונדריה על ידי טכניקות אחרות.

Introduction

המיטוכונדריה חיונית לשמירה על כדאיות התאים ומבצעת תפקודים תאיים רבים כגון חילוף חומרים של אנרגיה (גלוקוז, חומצת אמינו, שומנים ומסלולי חילוף חומרים של נוקלאוטידים). כאתר העיקרי לייצור מיני חמצן תגובתי (ROS), המיטוכונדריה היא מרכזית במספר תהליכי איתות תאיים כגון אפופטוזיס ומשתתפת בסינתזה של צבירי ברזל-גופרית (Fe-S), ייבוא והבשלה של חלבונים מיטוכונדריאליים, ושמירה על הגנום והריבוזומים שלהם ^1,2,3. רשת הדינמיקה של הממברנות המיטוכונדריה נשלטת על ידי תהליכי היתוך וביקוע, ויש להם גם מכונות לבקרת איכות^{ומיטופגיה 4,5,6}

Protocol

הפרוטוקול הנוכחי אושר על ידי ועדת האתיקה לשימוש בבעלי חיים במחקר, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) והנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול בחיות ניסוי ושימוש בהן. העצב הסיאטי מבודד מעכברי C57BL/6 זכרים בני ארבעה חודשים, המתים על ידי נקע צוואר הרחם בהתאם להנחיות המוסדיות. שלבי הפרוטוקול ממוטבים כדי למנוע הידרדרות מיטוכונדריאלית. לכן, בפרוטוקול זה, כיול של חיישני חמצן פולארוגרפיים בוצע לפני כריתה וחדירה של רקמת עצבים סיאטית של עכבר.

1. הכנת ריאגנטים

1. הכן את מאגר שימור הרקמות (חיץ TP).
   1. הכן את הריאגנטים הבאים בתמיסת מים אולטרה-אפורה: 10 mM של חיץ Ca-EGTA עם 0.1 μM של סידן חופשי, 20 mM של אימידזול, 20 mM של טאורין, 50 mM ....

Results

צריכת החמצן המיטוכונדריאלית על ידי העצב הסיאטי המחלחל מיוצגת באיור 2. העקבה האדומה מייצגת את שטף O₂ ליחידת מסה ב-pmol/s.mg. לאחר רישום צריכת חמצן בסיסית עם מצעים אנדוגניים (נשימה שגרתית), מוזרק סוקינט (SUCC) לנשימה מונעת קומפלקס II (סוקסינט דהידרוגנאז), וכתוצאה מכך לעלייה בקצב צריכת החמצן. ברצף, מתווסף ריכוז רווי של ADP, המפעיל ATP סינתאז ומניע זרחון חמצוני. התוצאה היא מצב פוספורילטיבי של נשימה מיטוכונדריאלית. נשימת מצב זרחני פירושה ש-ATP synthase יכול לייצר ATP מ-ADP + Pi (פוספט .......

Discussion

מספר מחלות או מצבים המלווים נוירופתיות סובלים מתפקוד לקוי של המיטוכונדריה כגורם סיכון. ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה בעצבים היקפיים חיונית כדי להבהיר כיצד המיטוכונדריה פועלת במצבים נוירודגנרטיביים אלה. ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה היא מייגעת בשל הקושי של שיטת הבידוד והמחסור בחומר. לפיכך, התפתחות של טכניקות חדירת רקמות שאינן דורשות בידוד של מיטוכונדריה היא חיונית.

כדי להעריך את תפקוד המיטוכונדריה ברקמות מחלחלות, בחירת כימיקל שיכול לחלחל לקרום הפלזמה של התא מבלי להפריע לנשימה של התא היא קריטית. ב.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אדנוזין 5' טריפוספט מלח דיססודיום הידרט	סיגמא-אולדריץ'	A26209
אדנוזין 5&פריים;-דיפוספט מלח נתרן	סיגמא-אולדריץ'	A2754
אמפלקס אדום ריאגנט	תרמו פישר מדעי	A12222	אמפלקס אדום מוכן ב-DMSO בהתאם לגיליון הנתונים של המוצר
Antimycin A (מ-Streptomyces sp.)	Sigma-Aldrich	A8674
סרום בקר אלבומין	Sigma-Aldrich	A7030	שבר הלם חום, ללא פרוטאז, ללא חומצות שומן, למעשה ללא גלובולין, pH 7, ≥ 98%
סידן פחמתי	סיגמא-אולדריץ'	C6763
קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומטוקסי)פנילהידרזון (FCCP)	סיגמא-אולדריץ'	C2920
ציטוכרום c	סיגמא-אולדריץ'	C7752	(מלב סוסים; המפרוטאין קטן)
DataLab גרסה 5.1.1.91	OROBOROS INSTRUMENTS, אוסטריה		זכויות יוצרים (c) 2002 - 13 מאת ד"ר אריך גנייגר
שייקר מיקרופלייט אורביטלי דיגיטלי 120V	תרמו פישר	88882005
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
EGTA מלח נתרן	Sigma-Aldrich	E8145
מזרק המילטון	Sigma-Aldrich	HAM80075	10 uL, 25 uL ו-50 uL
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
מימן תמיסת מי חמצן 30% W/W	Merck	H1009
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
L-(−)-חומצה מאלית	Sigma-Aldrich	M7397
מגנזיום כלוריד הקסהידרט	Sigma-Aldrich	M2393
MES מלח נתרן	Sigma-Aldrich	M3885
מלקחיים מיקרו-ניתוחים, מלקחיים מיקרו-ניתוחים מעוקלים	Sigma-Aldrich	F4142
ישר	Sigma-Aldrich	F4017
O2K - סט מסננים Amplex Red	OROBOROS INSTRUMENTS, אוסטריה	44321-01	Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: ייצור HRR ו- H2O2 במיטוכונדריה של מוח העכבר. רשת מיטוכונדר פיזיול 17.17.
O2K - פלואורסצנטי LED2 - רכיב מודול חיישן פלואורסצנטי ירוק	OROBOROS INSTRUMENTS, אוסטריה	44210-01
אוליגומיצין	סיגמא-אולדריץ'	O4876	(מ- Streptomyces diastatochromogenes; תערובת של אוליגומיצינים A, B ו- C
OROBOROS Oxygraph-2k	OROBOROS INSTRUMENTS, אוסטריה	http://www.oroboros.at
פלמיטוילקרניטין (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)	Sigma-Aldrich	P4509
פרוקסידאז מחזרת	Sigma-Aldrich	P8375
צלחות פטרי, פוליסטירן	MERCK	P5606
פוספוקריאטין דיסודיום מלח הידרט	Sigma-Aldrich	P7936
אשלגן דימימן פוספט מונו-בסיסי	Sigma-Aldrich	PHR1330
אשלגן הידרוקסיד	סיגמא-אולדריץ'	221473
רוטנון	סיגמא-אולדריץ'	R8875
ספונין	סיגמא-אולדריץ'	SAE0073
נתרן פירובט	סיגמא-אולדריץ'	P5280
נתרן סוקסינט הקסהידרט דו-בסיסי	סיגמא-אולדריץ'	S2378
סוכרוז	סיגמא-אולדריץ'	S9378
טאורין	סיגמא-אולדריץ'	T0625