הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצב הסיאטי על ידי נשימה ברזולוציה גבוהה

Summary

נשימה ברזולוציה גבוהה המוצמדת לחיישנים פלואורסצנטיים קובעת את צריכת החמצן המיטוכונדריה ואת ייצור מיני החמצן הריאקטיבי (ROS). הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה להערכת שיעורי הנשימה המיטוכונדריאליים וייצור ROS בעצב הסיאטי החודר.

Abstract

תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בעצבים היקפיים מלווה מספר מחלות הקשורות לנוירופתיה היקפית, אשר יכולות להיות מופעלות על ידי גורמים מרובים, כולל מחלות אוטואימוניות, סוכרת, זיהומים, הפרעות תורשתיות וגידולים. הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצבים ההיקפיים של העכבר יכולה להיות מאתגרת בשל גודל המדגם הקטן, מספר מוגבל של מיטוכונדריה הנמצאת ברקמה, ונוכחותו של נדן מיאלין. הטכניקה המתוארת בעבודה זו ממזערת את האתגרים הללו על ידי שימוש בפרוטוקול חדירה ייחודי המותאם מאחד המשמש לסיבי שריר, כדי להעריך את תפקוד המיטוכונדריה העצבית הסיאטית במקום לבודד את המיטוכונדריה מהרקמה. על ידי מדידת ייצור מינים תגובתיים פלואורימטריים עם Amplex Red/Peroxidase והשוואת מצעים ומעכבים מיטוכונדריאליים שונים בעצבים מחלחלים של סאפונין, ניתן היה לזהות מצבי נשימה מיטוכונדריאליים, מיני חמצן תגובתי (ROS) ופעילות של קומפלקסים מיטוכונדריאליים בו זמנית. לכן, השיטה המוצגת כאן מציעה יתרונות בהשוואה להערכת תפקוד המיטוכונדריה על ידי טכניקות אחרות.

Introduction

המיטוכונדריה חיונית לשמירה על כדאיות התאים ומבצעת תפקודים תאיים רבים כגון חילוף חומרים של אנרגיה (גלוקוז, חומצת אמינו, שומנים ומסלולי חילוף חומרים של נוקלאוטידים). כאתר העיקרי לייצור מיני חמצן תגובתי (ROS), המיטוכונדריה היא מרכזית במספר תהליכי איתות תאיים כגון אפופטוזיס ומשתתפת בסינתזה של צבירי ברזל-גופרית (Fe-S), ייבוא והבשלה של חלבונים מיטוכונדריאליים, ושמירה על הגנום והריבוזומים שלהם ^1,2,3. רשת הדינמיקה של הממברנות המיטוכונדריה נשלטת על ידי תהליכי היתוך וביקוע, ויש להם גם מכונות לבקרת איכות^{ומיטופגיה 4,5,6}.

תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור להופעתם של מספר מצבים פתולוגיים כגון סרטן, סוכרת והשמנת יתר⁷. הפרעות בתפקוד המיטוכונדריה מזוהות בהפרעות נוירודגנרטיביות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית, כמו במחלת אלצהיימר ^8,9, מחלת פרקינסון^10,11, טרשת אמיוטרופית צידית^12,13, ומחלת הנטינגטון^14,15 . במערכת העצבים ההיקפית, אובדן תפקוד המיטוכונדריה באקסונים נצפה בנוירופתיה חיסונית, כגון תסמונת Guillain-Barré^16,17, ובשילוב עם ייצור ROS מיטוכונדריאלי גבוה באקסונים, אירועים אלה מובילים להפעלת MAP Kinase בתאי שוואן¹⁸. זה מדגים כי פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית עשויה להיות חיונית לא רק עבור תא ספציפי לאתר, אלא עבור רקמה שלמה. בפולינוירופתיה חושית דיסטלית הקשורה ל- HIV (HIV-DSP), למיטוכונדריה יש תפקיד במנגנון שבאמצעותו הגורם הטרנס-מפעיל של חלבון שעתוק (HIV-TAT) מאפשר ל- HIV להשתכפל ביעילות, כמו גם מספר תפקידים אחרים בפתוגנזה של הידבקות ב- HIV^19,20.

הערכה של פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית של עצבים סיאטיים התגלתה כמטרה חיונית לחקר נוירופתיה ^7,21,22. בנוירופתיה סוכרתית, ניתוחים פרוטאומיים ומטבולומיים מצביעים על כך שרוב השינויים המולקולריים בסוכרת משפיעים על זרחון חמצון מיטוכונדריאלי של עצבים סיאטיים ועל חילוף החומרים של השומנים⁷. נראה כי שינויים אלה הם גם סימנים מוקדמים לסוכרת הנגרמת על ידי השמנת יתר²¹. במודל עכברי של נוירופתיה כואבת הנגרמת על ידי כימותרפיה, פגיעה מיטוכונדריאלית בעצב הסיאטי מזוהה כירידה בזרחון החמצוני²², והפחתה של פעילויות קומפלקסים מיטוכונדריאליים, פוטנציאל ממברנה ותכולת ATP²³. עם זאת, למרות שכמה קבוצות ציינו תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בנוירופתיה, מחקרים אלה מוגבלים למדידות של פעילות בקומפלקסים מיטוכונדריאליים ללא שימור של הממברנות המיטוכונדריה, ללא הערכה של שלמות המיטוכונדריה או מדידות של תוכן ATP כפרמטר לייצור ATP מיטוכונדריאלי. באופן כללי, הערכה נכונה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי וייצור ROS דורשת בידוד של מיטוכונדריה על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית בשיפוע פרקול/סוכרוז. בידוד המיטוכונדריה יכול גם להיות גורם מגביל לרקמת עצב סיאטית בגלל הכמות הגדולה של הרקמה הדרושה ואובדן מיטוכונדריה והפרעה.

המחקר הנוכחי נועד לספק פרוטוקול למדידת הפיזיולוגיה המיטוכונדרית כצריכה חמצן מיטוכונדריאלית וייצור ROS בעצב הסיאטי, תוך שמירה על ממברנות מיטוכונדריאליות וללא צורך בבידוד המיטוכונדריה. פרוטוקול זה מותאם ממדידות צריכת חמצן בסיבי שריר חודרניים²⁴ על ידי נשימה ברזולוציה גבוהה (HRR). היתרונות של הליך זה הם האפשרות להעריך את המיטוכונדריה בכמויות קטנות של רקמות כגון העצב הסיאטי ולהעריך פרמטרים מיטוכונדריאליים באתרם, ובכך לשמר את הסביבה המיטוכונדרית, המבנה והפרופיל הביו-אנרגטי, כדי להשיג תוצאה אמינה מבחינה פיזיולוגית. מצבי הנשימה המיטוכונדריים נקבעו עם מצעים ומעכבים לאחר חדירת עצבים סיאטיים כדי להעריך כראוי ביו-אנרגיה מיטוכונדריאלית ומקדם ציטוכרום c לשלמות הממברנה המיטוכונדרית, וסיפקו מדריך לצעדים של הערכת מערכת הובלת האלקטרונים המיטוכונדרית (ETS) וחישוב פרמטרים חיוניים. מחקר זה יכול לספק כלים למענה על שאלות במנגנונים פתופיזיולוגיים שבהם מעורב חילוף החומרים העצבי הסיאטי, כגון נוירופתיות היקפיות.

Protocol

הפרוטוקול הנוכחי אושר על ידי ועדת האתיקה לשימוש בבעלי חיים במחקר, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) והנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול בחיות ניסוי ושימוש בהן. העצב הסיאטי מבודד מעכברי C57BL/6 זכרים בני ארבעה חודשים, המתים על ידי נקע צוואר הרחם בהתאם להנחיות המוסדיות. שלבי הפרוטוקול ממוטבים כדי למנוע הידרדרות מיטוכונדריאלית. לכן, בפרוטוקול זה, כיול של חיישני חמצן פולארוגרפיים בוצע לפני כריתה וחדירה של רקמת עצבים סיאטית של עכבר.

1. הכנת ריאגנטים

1. הכן את מאגר שימור הרקמות (חיץ TP).
   1. הכן את הריאגנטים הבאים בתמיסת מים אולטרה-אפורה: 10 mM של חיץ Ca-EGTA עם 0.1 μM של סידן חופשי, 20 mM של אימידזול, 20 mM של טאורין, 50 mM של K-MES, 0.5 mM של DTT, 6.56 mM של MgCl₂, 5.77 mM של ATP, 15 mM של phosphocreatine (ראה טבלת חומרים), pH 7.1. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
2. הכן את מאגר הנשימה של המיטוכונדריה (MR Buffer).
   1. הכן את הריאגנטים הבאים בתמיסת מים אולטרה-אפורה: 0.5 mM של K₂EGTA, 3 mM של MgCl₂, 60 mM של MES, 20 mM של טאורין, 10 mM של KH₂PO₄, 20 mM של HEPES, 110 mM של D-סוכרוז, 1 מ"ג / מ"ל של BSA (ללא חומצות שומן) (ראה טבלת חומרים), pH 7.4. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
3. הכינו את תמיסת מלאי הספונין על ידי המסת 5 מ"ג של ספונין (ראו טבלת חומרים) ב-1 מ"ל של מאגר TP (שלב 1.1) ושמרו אותו על קרח. ספונין מוכן טרי.
4. הכן את Amplex Red על ידי שימוש חוזר באבקה (ראה טבלת חומרים) עם DMSO כדי להשיג ריכוז מלאי של 2 mM ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס בבקבוקון המוגן מפני אור.
   הערה: כדי להימנע מלשחוק את הגשושית על ידי הקפאה והפשרה, הכינו עליפוטים קטנים לאחסון לא יותר מ-6 חודשים^ו-25 חודשים.

2. כיול חיישני חמצן פולארוגרפיים לנשימה ברזולוציה גבוהה (HRR)

1. נקו את תאי ה-HRR של המכשיר והמזרקים (ראו טבלת חומרים).
   1. פתחו תאי HRR, התמלאו במים מזוקקים עד למעלה וערבבו במשך 5 דקות 3x. חוזרים על הפעולה עם אתנול ואז שוב עם מים. יש לשטוף פקקים ומזרקים במים/אתנול/מים פי 3 כל אחד.
2. החל את הגדרות הכיול הבאות בתוכנת HRR (ראה טבלת חומרים).
   1. בבקרת תוכנת HRR, הוסף את הטמפרטורה הניסיונית (37 °C), את הפרמטרים עבור חיישן חמצן (רווח, 2; מתח קיטוב, 800 mV), ועבור חיישן אמפרומטרי (רווח, 1000; מתח קיטוב, 100 mV).
3. כייל את חיישני החמצן.
   1. פיפטה 2.1 מ"ל של MR Buffer (שלב 1.2) לתוך כל תא. סגור עם הפקקים ושאב אוויר לתוך החדר עד שנוצרת בועה. מערבבים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת במצב כיול עד ששטף החמצן למסה יציב.
   2. בצע כיול אוויר של חיישני החמצן הפולבוגרפיים בתוכנה על פי פרוטוקול היצרן²⁴.
      הערה: שלב הכיול מבוצע רק פעם אחת לפני ניסוי. ניסויים נוספים באותו אמצעי נשימה וטמפרטורה יכולים להתבצע לאחר שטיפת תאים בלבד (שלב 2.1).

3. כריתה וחדירה של העצב הסיאטי

1. הסר את העצב הסיאטי בעקבות השלבים הבאים.
   1. להרדים את החיה על ידי נקע צוואר הרחם לאחר הוצאתה מהכלוב שלה וריסון בעדינות למנוחה על הספסל.
   2. בחיה המתת חסדת, לבצע חתך עם מספריים בגב התחתון, להתחיל ליד עמוד השדרה ולהמשיך במורד הירך לכיוון כף הרגל. הסר את העור והשריר המחוברים לעצב, ולאחר מכן חתך והסר את כל העצב הסיאטי.
   3. שקלו את הרקמה באופן מיידי והניחו אותה בבקבוקון מלא ב-TB Buffer קר (4 מעלות צלזיוס). בצע שלבים 3.2-3.3 על קרח.
      הערה: משקל הרקמה הרטובה משמש לנרמול צריכת החמצן וזרימת ייצור ה- ROS בשלבים הבאים. אם לא ניתן לשקול את הרקמה באופן מיידי, שמרו אותה ב-TB Buffer קר. ההליך מבוצע ברקמה טרייה ואין להקפיא אותו כדי למנוע נזק מיטוכונדריאלי.
2. להכנת הרקמה, מניחים את העצב הסיאטי בצלחת פטרי עם מספיק TP Buffer כדי לכסות אותו. החזק קצה אחד של העצב עם מלקחיים, ועם זוג מלקחיים נוסף, שלף את צרורות העצבים אופקית.
   הערה: הליך זה צריך להיעשות תוך פחות מ -10 דקות כדי למנוע הידרדרות רקמות. הרקמה תהיה מוכנה כאשר ניתן יהיה לדמיין אותה כשכבות ערפיליות שקופות, מול הרקמה הלבנה האטומה הקודמת (איור 1).
3. ראשית, העבירו את הרקמה המשוחקת לתוך צלחת קטנה המכילה 1 מ"ל של TP Buffer לצורך חדירת רקמות. כדי להתחיל permeabilization, להעביר את הרקמה עם מלקחיים לצלחת המכילה 1 מ"ל של TP Buffer ו 10 μL של saponin (מתוך תמיסת מלאי, שלב 1.3).
   1. יש לנער בעדינות שייקר של מיקרו-פלטה למשך 30 דקות, ואז מעבירים את הרקמה עם המלקחיים למנה טרייה המכילה MR Buffer (1 מ"ל) ומנערים בעדינות במשך 10 דקות. העבר את הרקמה עם מלקחיים לתא HRR מכויל.

4. צריכת חמצן וקביעת ייצור ROS

1. מלאו את תאי ה-HRR ב-2.1 מ"ל של MR Buffer, הוסיפו את Amplex Red (שלב 1.4) לריכוז סופי של 5 μM ופרוקסידאז ל-2 U/mL, והוסיפו את העצב הסיאטי החודר (שלב 3).
   1. חברו את חיישני הפלואורסצנציה של המכשיר, כבו את האורות בחלק הבקרה של התוכנה ולחצו על Connect to oxygraph. ב"פרוטוקולי עריכה" בתוכנה, הכנס את משקל הרקמה שנמדד בשלב 3.1.3.
2. עבור אל "פריסה", בחר באפשרות "שטף ספציפי ליחידת דגימה", ובחר Plots כדי לגשת בו זמנית לקריאת צריכת החמצן, ואם תרצה, את ייצור H₂O₂ . המתן ~ 10 דקות.
   הערה: זמן זה נדרש כדי לייצב את הזרימה הבסיסית של צריכת החמצן ללא תוספת מצע (בסיסית). לפני זריקות נוספות, ודא שזרימת החמצן מתייצבת.
3. הזריקו שני פולסים של H₂O₂, כל אחד מהם לריכוז סופי של 260 מיקרומטר, לכיול מאוחר יותר בתא.
4. הזריקו 20 μL של סוקסינט (ראו טבלת חומרים), מצע קומפלקס מיטוכונדריאלי II, כדי להפעיל את מערכת הובלת האלקטרונים המיטוכונדרית.
   הערה: ניתן להוסיף מצעים מיטוכונדריאליים שונים בנקודה זו כדי להעריך את תפקוד המיטוכונדריה על ידי קומפלקסים שונים. תוצאות מייצגות עם מצעים משתנים עבור קומפלקסים מיטוכונדריאליים I ו-II מוצגות באיור 2 ובאיור 3. בשלב זה, עלייה בצריכת O₂ ובייצור H₂O₂ , בו זמנית, נצפית באיור 3.
5. הוסף 20 μL של אדנוזין דיפוספט (ADP) כדי להפעיל סינתזת אדנוזין טריפוספט (ATP).
   הערה: ADP מגרה סינתזת ATP ומפחית את פוטנציאל הממברנה. עלייה בצריכת O₂ וירידה בייצור של H₂O₂ צפויים להיות נצפים^26,27.
6. ברצף, הוסף 5 μL של ציטוכרום c (ראה טבלת חומרים) כאינדיקטור לשלמות הממברנה.
   הערה: אם הרקמה מוכנה היטב וחודרת, ציטוכרום c לא אמור להגדיל את צריכת החמצן ביותר מ -15%. אם היא מתרחשת, עיין בסעיף פתרון בעיות לקבלת המלצות.
7. טיטרט עם אליקוטים של 0.2 מיקרוגרם/מ"ל של אוליגומיצין (ראו טבלת חומרים) עד שלא נצפתה ירידה נוספת בצריכת O₂ .
   הערה: אוליגומיצין פועל על ידי עיכוב סינתזת ATP המובילה לירידה בזרימת O₂ ולשיפור בהיווצרות H₂O_{2 המועדף} על ידי פוטנציאל הממברנה הגבוה^26,27.
8. טיטרט עם אליקוטים של 0.5 מיקרומול/ליטר של קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומתוקסי)פניל-הידרזון (FCCP) (ראה טבלת חומרים), הלא-קופלר המיטוכונדרי, עד שלא ניתן להבחין בעלייה נוספת בצריכת O₂ . כדי לסיים את הניסוי, הזריקו 2 μl של אנטימיצין A לריכוז סופי של 5 μM והמתינו לייצוב זרימה.
   הערה: נצפתה ירידה בייצור H₂O₂ עקב פיזור פוטנציאל הממברנה לאחר הזרקת FCCP. אנטימיצין A מעכב את קומפלקס III, ובכך מונע את זרימת האלקטרונים. לכן, צריכת O₂ התלויה במיטוכונדריה נפגעת, מפחיתה את שטף החמצן למסה ומעוררת דליפת אלקטרונים, מה שמגדיל את ייצור H₂O₂ ^26,27.
9. עבור אל סרגל הפקודות, חפש "רב-חושי" בתוכנה, לחץ על שליטה > שמור קובץ והתנתק.
   הערה: תוספת של מצעים ומעכבים אחרים יכולה להתבצע על פי השאלה הנחקרת. דוגמה מתוארת בתוצאות הייצוגיות. כיול H₂O₂ מבוצע לאחר סיום הניסוי, על פי פרוטוקול היצרן²⁸.
10. פתח את הקובץ שנשמר ובחר את המעקב "שטף חמצן למסה" כדי לקבל את תוצאות צריכת החמצן הניסיונית. בחר ידנית את החלון בין הזרקות על-ידי לחיצה על לחצן Shift + Left mouse.
    1. עבור אל Marks > סטטיסטיקה כדי לדמיין את התוצאות עבור כל זריקה של מצע / מעכבים / פרוטוקול לא משותף. עבור ייצור H₂O₂ , בצע את אותו הליך עם עקבות "Amp-Slope".
       הערה: בעת בחירת החלון, הימנע מממצאים של זריקות נפח על-ידי בחירת חלון שבו חמצן (או H₂O₂) יציב וקבוע יותר. דוגמאות לחלונות שנבחרו מיוצגות על-ידי סוגריים מסולסלים שחורים בתוצאות המייצגות (איור 2 ואיור 3).

Results

צריכת החמצן המיטוכונדריאלית על ידי העצב הסיאטי המחלחל מיוצגת באיור 2. העקבה האדומה מייצגת את שטף O₂ ליחידת מסה ב-pmol/s.mg. לאחר רישום צריכת חמצן בסיסית עם מצעים אנדוגניים (נשימה שגרתית), מוזרק סוקינט (SUCC) לנשימה מונעת קומפלקס II (סוקסינט דהידרוגנאז), וכתוצאה מכך לעלייה בקצב צריכת החמצן. ברצף, מתווסף ריכוז רווי של ADP, המפעיל ATP סינתאז ומניע זרחון חמצוני. התוצאה היא מצב פוספורילטיבי של נשימה מיטוכונדריאלית. נשימת מצב זרחני פירושה ש-ATP synthase יכול לייצר ATP מ-ADP + Pi (פוספט ...

Discussion

מספר מחלות או מצבים המלווים נוירופתיות סובלים מתפקוד לקוי של המיטוכונדריה כגורם סיכון. ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה בעצבים היקפיים חיונית כדי להבהיר כיצד המיטוכונדריה פועלת במצבים נוירודגנרטיביים אלה. ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה היא מייגעת בשל הקושי של שיטת הבידוד והמחסור בחומר. לפיכך, התפתחות של טכניקות חדירת רקמות שאינן דורשות בידוד של מיטוכונדריה היא חיונית.

כדי להעריך את תפקוד המיטוכונדריה ברקמות מחלחלות, בחירת כימיקל שיכול לחלחל לקרום הפלזמה של התא מבלי להפריע לנשימה של התא היא קריטית. ב...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אדנוזין 5' טריפוספט מלח דיססודיום הידרט	סיגמא-אולדריץ'	A26209
אדנוזין 5&פריים;-דיפוספט מלח נתרן	סיגמא-אולדריץ'	A2754
אמפלקס אדום ריאגנט	תרמו פישר מדעי	A12222	אמפלקס אדום מוכן ב-DMSO בהתאם לגיליון הנתונים של המוצר
Antimycin A (מ-Streptomyces sp.)	Sigma-Aldrich	A8674
סרום בקר אלבומין	Sigma-Aldrich	A7030	שבר הלם חום, ללא פרוטאז, ללא חומצות שומן, למעשה ללא גלובולין, pH 7, ≥ 98%
סידן פחמתי	סיגמא-אולדריץ'	C6763
קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומטוקסי)פנילהידרזון (FCCP)	סיגמא-אולדריץ'	C2920
ציטוכרום c	סיגמא-אולדריץ'	C7752	(מלב סוסים; המפרוטאין קטן)
DataLab גרסה 5.1.1.91	OROBOROS INSTRUMENTS, אוסטריה		זכויות יוצרים (c) 2002 - 13 מאת ד"ר אריך גנייגר
שייקר מיקרופלייט אורביטלי דיגיטלי 120V	תרמו פישר	88882005
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
EGTA מלח נתרן	Sigma-Aldrich	E8145
מזרק המילטון	Sigma-Aldrich	HAM80075	10 uL, 25 uL ו-50 uL
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
מימן תמיסת מי חמצן 30% W/W	Merck	H1009
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
L-(−)-חומצה מאלית	Sigma-Aldrich	M7397
מגנזיום כלוריד הקסהידרט	Sigma-Aldrich	M2393
MES מלח נתרן	Sigma-Aldrich	M3885
מלקחיים מיקרו-ניתוחים, מלקחיים מיקרו-ניתוחים מעוקלים	Sigma-Aldrich	F4142
ישר	Sigma-Aldrich	F4017
O2K - סט מסננים Amplex Red	OROBOROS INSTRUMENTS, אוסטריה	44321-01	Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: ייצור HRR ו- H2O2 במיטוכונדריה של מוח העכבר. רשת מיטוכונדר פיזיול 17.17.
O2K - פלואורסצנטי LED2 - רכיב מודול חיישן פלואורסצנטי ירוק	OROBOROS INSTRUMENTS, אוסטריה	44210-01
אוליגומיצין	סיגמא-אולדריץ'	O4876	(מ- Streptomyces diastatochromogenes; תערובת של אוליגומיצינים A, B ו- C
OROBOROS Oxygraph-2k	OROBOROS INSTRUMENTS, אוסטריה	http://www.oroboros.at
פלמיטוילקרניטין (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)	Sigma-Aldrich	P4509
פרוקסידאז מחזרת	Sigma-Aldrich	P8375
צלחות פטרי, פוליסטירן	MERCK	P5606
פוספוקריאטין דיסודיום מלח הידרט	Sigma-Aldrich	P7936
אשלגן דימימן פוספט מונו-בסיסי	Sigma-Aldrich	PHR1330
אשלגן הידרוקסיד	סיגמא-אולדריץ'	221473
רוטנון	סיגמא-אולדריץ'	R8875
ספונין	סיגמא-אולדריץ'	SAE0073
נתרן פירובט	סיגמא-אולדריץ'	P5280
נתרן סוקסינט הקסהידרט דו-בסיסי	סיגמא-אולדריץ'	S2378
סוכרוז	סיגמא-אולדריץ'	S9378
טאורין	סיגמא-אולדריץ'	T0625