טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב דרך הפה בעכברים נגועים ב- HIV-1

תוחלת החיים של אנשים הנגועים בנגיף הכשל החיסוני האנושי הכרוני (HIV) השתפרה באופן משמעותי עם טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב (cART)^1,2. cART מפחית בהצלחה את שכפול ה- HIV-1 ומגדיל את ספירת תאי ה- CD4+ T לנורמליות אצל רוב המשתתפים הנגועים ב- HIV-1 באופן כרוני³, וכתוצאה מכך בריאות כללית משופרת והפחתה דרמטית בהתקדמות המחלה⁴. עם זאת, מאגר HIV-1 סמוי נוצר גם כאשר ART הוא יזם במהלך זיהום חריף ^5,6,7. המאגרים נמשכים לאורך שנים במהלך ART וריבאונד נגיפי מהיר לאחר שהפרעת ART מתועדת היטב ^8,9. אנשים החיים עם HIV על ART הם גם נטייה לסיכון גבוה יותר של תחלואה נלווית כגון מחלות לב וכלי דם, סרטן, והפרעות נוירו^10,11,12. לכן, יש צורך בתרופה פונקציונלית ל- HIV. מודלים של בעלי חיים לזיהום ב- HIV-1 מציעים יתרונות ברורים בפיתוח ואימות אסטרטגיות ריפוי HIV חדשניות^13,14,15. עכברים אנושיים, כמודל של חיה קטנה, יכולים לספק שחזור תאי חיסון אנושיים רב-שכבתיים ברקמות שונות, מה שמאפשר מחקר מקרוב של הידבקות ב- HIV^16,17,18,19. מבין המודלים האנושיים, המודל האנושי של מח עצם-כבד-תימוס (BLT) משחזר בהצלחה זיהום כרוני ב-HIV-1, כמו גם תגובות חיסוניות אנושיות פונקציונליות לזיהום ב-HIV-1 20,21,22,23,24. לכן, מודל עכבר BLT האנושי נמצא בשימוש נרחב כדי לחקור היבטים שונים בתחום המחקר של HIV. עכברי BLT אנושיים הם לא רק מודלים מבוססים היטב לסיכום של זיהום מתמשך ב- HIV-1 ופתוגנזה, אלא גם כלים תוצאתיים להערכת אסטרטגיות התערבות מבוססות טיפול בתאים. המחברים הנוכחיים ואחרים הראו כי מודל עכברי BLT האנושיים משחזר זיהום מתמשך ב- HIV-1 ופתוגנזה 25,26,27 ומספק כלים להערכת אסטרטגיות התערבות מבוססות טיפול תאי 28,29,30,31,32,33^.

משטרי cART המורכבים משילובים של תרופות אנטי-רטרו-ויראליות הנלקחות מדי יום מדכאות שכפול HIV-1 עד כדי כך שהעומס הנגיפי אצל אנשים שטופלו בהצלחה נותר בלתי ניתן לגילוי לאורך^{זמן 34}. התוצאות של טיפול בעכברים אנושיים נגועים ב- HIV עם משטרי cART רלוונטיים מבחינה קלינית דומות לאלה שנצפו אצל אנשים נגועים ב- HIV-1 שטופלו ב- ART²²: רמות HIV-1 מדוכאות מתחת לגבולות הגילוי וההפרעה של cART גורמת לריבאונד של שכפול HIV מהמאגר הסמוי³⁵. הזרקה תת-עורית (SC)27,36,37 או תוך-צפקית (IP)^37,38,39 היא המסלול המשמש בדרך כלל לטיפול ב-cART בעכברים אנושיים. עם זאת, הזרקה יומית אינטנסיבית גורמת ללחץ על בעלי חיים על ידי ריסון פיזי⁴⁰. היא גם דורשת עבודה רבה ועלולה להיות לא בטוחה לחוקרים בשל חשיפה מוגברת ל-HIV תוך שימוש בחדים. מתן אוראלי הוא אידיאלי כדי לחקות את הספיגה, ההפצה וההפרשה של תרופות cART כי הם נלקחים על ידי אנשים נגועים ב- HIV-1. מתן אוראלי כולל בדרך כלל הליכים מותאמים אישית ולעתים קרובות מייגעים כדי לשים את התרופות antiretroviral מעוקר (הכרחי בשל הכשל החיסוני של העכברים) מזון 24,37,41 או מים 42,43,44,45,46 אשר עשוי או לא יכול להיות תואם כימית עם תרופות אנטי-רטרו-ויראליות רבות, או לגרום למשהו שהעכברים לא יאכלו או ישתו בקלות (מה שישפיע על רמות המינון והתרופות בגוף)., שיטת ניהול ה- cART הפרולית החדשנית המוצעת כאן עולה על ניסיונות אספקה קודמים בשל תאימותה לסוגים שונים של תרופות אנטי-רטרו-ויראליות, בטיחות וקלות הכנה וניהולם, והפחתת מתח וחרדה של בעלי חיים הנובעים מההזרקה היומית.

Tenofovir disoproxil fumarate (TDF), Elvitegravir (ELV) ו- Raltegravir (RAL) הן תרופות מסיסות במים. באופן מעניין, הזמינות הביולוגית המוגברת של TDF נצפתה עם מזונות שומניים, מה שמרמז על כך שעיכוב תחרותי של ליפאזות על ידי מזון שומני עשוי לספק הגנה מסוימת ל-TDF⁴⁷. לכן, כוסות DietGel Boost נבחרו להחליף צ'או מכרסם רגיל כשיטת אספקה המבוססת על תכולת השומן הצנועה שלהן (20.3 גרם ל-100 גרם) בהשוואה לצ'או מכרסמים רגיל (10 גרם ל-100 גרם) ודיאטה טיפוסית עתירת שומן של עכברים (40-60 גרם ל-100 גרם)⁴⁸. המשקל הכולל של אחת הוא 75 גרם; לפיכך, כל תכיל את כמות המזון, ולכן תרופות, מספיק עבור 5 עכברים במשך 3 ימים.

רקמת עובר אנושית אנונימית נרכשה באופן מסחרי. המחקר בבעלי חיים בוצע על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס, וועדת המחקר בבעלי חיים (UCLA) (ARC) בהתאם לכל ההנחיות הפדרליות, המדינתיות והמקומיות. באופן ספציפי, כל הניסויים בוצעו בהתאם להמלצות ולהנחיות לדיור וטיפול בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) והאגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה (AALAC) הבינלאומי תחת פרוטוקול ARC מספר UCLA 2010-038-02B. כל הניתוחים בוצעו תחת קטמין (100 מ"ג/ק"ג)/קסילזין (5 מ"ג/ק"ג) והרדמה איזופלורן (2-3 וולט%) וכל המאמצים נעשו כדי למזער את הכאב ואי הנוחות של בעלי החיים.

1. עכברים אנושיים נגועים ב- HIV-1

הערה: עכברים אנושיים נבנו כפי שתואר קודם לכן^ב-30,31,49. הפרוטוקול מתואר בקצרה להלן.

1. לטהר את CD34+ תאי אב המטופויאטיים מהכבד העוברי האנושי באמצעות מיקרובים אנטי-CD34 בהתאם לפרוטוקול היצרן.
2. להרדים עכברים זכרים ונקבות בני 6-8 שבועות מסוג NOD/SCID/IL2Rγ−/− (NSG) ולהקרין באופן תת-קטלני (2.7 Gy) לפני הניתוח.
3. שתל תימוס, המופק מאותו תורם כמו כבד העובר, מתחת לכמוסת הכליה יחד עם הכבד.
4. לאחר ההשתלה, הזריקו לעכברים 0.5 מיליון עד מיליון תאי CD34+, דרך הווריד.
5. לאחר 8-10 שבועות, אסוף 100 μL של דם עכבר באמצעות דימום רטרו-אורביטלי⁵⁰ לתוך צינורות microcentrifuge המכילים 5 μL של EDTA וצנטריפוגה ב 350 x g במשך 3 דקות.
6. אחסן את הפלזמה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי לפקח על העומס הנגיפי לאחר שהעכבר נדבק ב- HIV-1. יש להוסיף 2 מ"ל של תמיסת NH4C 83% ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי ללזות תאי דם אדומים.
7. יש להוסיף 10 מ"ל של RPMI עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) כדי לעצור את התזה. סובב ב 300 x גרם במשך 5 דקות.
8. לשאוף סופרנטנט. תאי כתם עם פאנל נוגדנים (ראו טבלת חומרים) ונתחו על ידי ציטומטריה של זרימה כדי לבדוק את השתלת תאי החיסון האנושיים.
9. להדביק עכברים המציגים יותר מ-50% מתאי CD45+ במחזור הדם על ידי הזרקת ורידים רטרו-אורביטליים^51,52 עם לפחות 200 ננוגרם של p24 של זן HIV-1 (כלומר, NFNSXSL9 30,53,54) באמצעות מזרק אינסולין. לאסוף דם דו שבועי לניתוח ציטומטריה זרימה ולמדוד את העומס הנגיפי.

2. הכנת תרופות ART

1. לשקול תרופות בודדות; לדוגמה, כדי להכין 10 כוסות מזון עם cART, השתמש במגרדי תאים סטריליים כדי לשקול 250 מ"ג של FTC (Emtricitabine), 375 מ"ג של TDF ו-500 מ"ג של RAL או ELV לצינורות צנטריפוגה סטריליים בודדים של 15 מ"ל בארון בטיחות ביולוגית.
2. הוסף 1 מ"ל של DMSO לתוך 250 מ"ג צינור FTC (ריכוז סופי של 250 מ"ג / מ"ל), הוסף 1.5 מ"ל של DMSO לתוך 375 מ"ג TDF צינור (ריכוז סופי של 250 מ"ג / מ"ל), והוסף 1 מ"ל של DMSO לתוך 500 מ"ג RAL או צינור ELV (ריכוז סופי של 500 מ"ג / מ"ל). מערבבים או מקטרים את תערובת התרופות עד להמסה מלאה ומתקבל פתרון ברור.
3. השתמש במסנן קרום PVDF הידרופילי בגודל 0.22 μM כדי לעקר תמיסות באמצעות מזרק סטרילי. פתרונות סמים בודדים ניתן לאחסן ב -20 °C (75 °F) במשך 12 שבועות.
4. כאשר הוא מוכן לשימוש, יש להפשיר אליקוט אחד של כל תמיסת תרופה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהפתרון מתבהר. מערבבים היטב באמצעות פיפט.
5. שלבו תרופות וערבבו היטב כדי ליצור תערובת מאסטר: 1 מ"ל של FTC ב-DMSO, 1.5 מ"ל של TDF ב-DMSO, ו-1 מ"ל של ELV או RAL ב-DMSO.
   הערה: כמות זו תכין 10 כוסות מזון.
6. הוסיפו 350 מיקרון של תמיסת תערובת מאסטר cART לכוס אחת כדי להכין cART אחת של DietGel Boost.
7. הוסיפו לכוס 0.75 מ"ל של טרימתופרים-סולפאמתוקסזול (ריכוז סופי של 0.48 מ"ג/מ"ל).
8. מערבבים היטב באמצעות 1 מ"ל קצוות פיפטה סטריליים.
9. אליקוט את המזון המכילה cART מהכוס המקורית עם מיקרו מרית על צלחת פטרי 60 מ"מ לפי הצורך. שקלו את המזון בסולם כדי לחשב את כמות המזון המכילה cART עבור כל כלוב בהתאם למספר העכברים.

3. מתן תרופות ART לעכברים נגועים ב- HIV-1

1. הוציאו צ'או רגיל מהכלוב והחליפו אותו בכוס מזון המכילה cART.
   הערה: בממוצע, עכבר יאכל עד 5 גרם מזון ביום. ניתן לתת בערך מזון אחת לחמישה עכברים למשך יומיים.
2. רעננו את האוכל של cART שלוש פעמים בשבוע.
3. שקלו כוסות משומשות כדי לעקוב אחר הצריכת. שקלו עכברים מדי שבוע כדי לאשר את הצריכה.

4. עקוב אחר עומס ויראלי על ידי PCR בזמן אמת

1. הערך את תאי מערכת החיסון האנושית (רמות תאי T מסוג CD4 ו-CD8) ואת שכפול ה-HIV-1 בעכברי BLT כל שבועיים על-ידי דימום רטרו-אורביטלי. קציר פלזמה על ידי ביצוע ההוראות בשלבים 1.5-1.8.
2. עקוב אחר עומסים נגיפיים בפלזמה של עכברים הנגועים ב- HIV-1 לפני ובמהלך מתן cART דרך הפה במשך 8 שבועות. חלצו RNA נגיפי פלזמה מפלזמה באמצעות ערכת מיצוי RNA נגיפית וכמתו על ידי PCR בזמן אמת באמצעות פריימרים וגששים (ראו טבלת חומרים) כפי שתואר קודם לכן 27,30,31. השתמש בפרוטוקול המחזור הבא: 48 °C (15 דקות), 95 °C (10 דקות), ולאחר מכן רכיבה על אופניים 95 °C (15 שניות), 60 °C (דקה אחת) במשך 45 מחזורים.

5. הערך את יחסי CD4/CD8 לפי ציטומטריה של זרימה

1. הכן תרחיפים חד-תאיים מדם היקפי של דימומים דו-שבועיים בשלבים 1.5-1.8.
2. תאי כתם עם סמני פני השטח ולנתח על ידי ציטומטריה זרימה. השתמש בנוגדנים הבאים של סמן פני השטח 27,30,43,49 בציטומטריית זרימה: CD45 (שיבוט HI30), CD8 (שיבוט SK1), CD3 (שיבוט OKT3), CD4 (שיבוט RPA-T4)^27,30,42,49.

בהנחה שעכבר ממוצע השוקל 25 גרם צורך 4 גרם מזון ביום, מינון התרופה היומית באמצעות צריכה פומית מתאים ל-2.88 מ"ג/ק"ג TFV, 83 מ"ג/ק"ג FTC ו-768 מ"ג/ק"ג RAL. כדי לבחון אם משטר המזון הממוטב רעיל ומשפיע על הבריאות הכללית בהשוואה להזרקה יומית של cART, משקל העכברים היה מנוטר מדי שבוע לפני ובמהלך cART באמצעות הזרקה דרך הפה או התת עור. לא היו הבדלי משקל משמעותיים לפני מתן cART בכל קבוצה (איור 1). עם זאת, משקל העכבר ירד ללא הרף במהלך הזרקת cART SC יומית. לעומת זאת, FTC/TDF/ELV או FTC/TDF/RAL ב-DietGel החזירו את משקל העכבר לרמות התחלת טרום-ART לאחר 5 שבועות של מתן cART דרך הפה. בנוסף, לא נצפו שינויים משמעותיים במשקל בין קבוצות Raltegravir או Elvitegravir.

כדי לבדוק אם מתן cART דרך הפה מדכא את העומס הנגיפי באותה יעילות כמו הזרקה יומית, הוערכו עומסים נגיפיים דו-שבועיים בפלזמה באמצעות RT-PCR. איור 2 מראה שמשטר המזון FTC/TDF/ELV ART דיכא ביעילות 100% את שכפול הנגיף לרמות בלתי ניתנות לגילוי תוך 4 שבועות; משטר המזון FTC/TDF/RAL ART יכול לדכא 80% מהעכברים לרמות בלתי ניתנות לגילוי תוך 4 שבועות, בעוד שרק 70% מהעכברים שקיבלו זריקת SC הגיעו לרמות בלתי ניתנות לגילוי לאחר 4 שבועות של טיפול. התוצאות הראו כי מתן פומי מדכא את שכפול הנגיף מהר יותר וביעילות רבה יותר מאשר הזרקת SC. יתר על כן, משטר המזון cART מנע ירידה נוספת של יחסי CD4/CD8 בדם ההיקפי מוקדם יותר מההזרקה היומית של SC (איור 3). תוצאות אלה הציעו כי משטר cART האוראלי המוצע יכול לדכא בהצלחה וירמיית פלזמה מתחת לרמת הזיהוי, לשחזר במהירות את רמות תאי ה- CD4 T ולשפר את הבריאות הכללית של בעלי החיים בעכברים אנושיים נגועים ב- HIV-1.

איור 1: משקל הגוף של עכבר משתנה לפני ובמהלך טיפול ב-cART לאחר הידבקות ב-HIV-1 בקבוצות שונות. עכברים שעברו הומניזציה נדבקוב-HIV NFNSXSL9 לאחר שיקום מערכת החיסון. לאחר 4 שבועות של הידבקות ב-HIV-1, עכברים טופלו במשך 7.5 שבועות נוספים עם משטר FTC/TDF/RAL באמצעות הזרקה תת-עורית (SC), או על ידי מתן פומי של FTC/TDF/RAL או FTC/TDF/ELV. משקלי הגוף של העכברים נמדדו החל משבוע לפני הידבקות ב-HIV. כל ההשוואות הסטטיסטיות נערכו באמצעות מבחן מאן-וויטני, ממוצע קבוצת דיווח (± S.E.). כוכבי כוכבית ירוקים מראים הבדלים סטטיסטיים בין קבוצת הזרקת המזון FTC/TDF/ELV לבין קבוצת הזרקת FTC/TDF/RAL SC. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. n=6-7 בכל קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: מתן cART פומי למזון מראה דיכוי נגיפי מהיר יותר. כפי שמתואר באיור 1, עכברים לא טופלו או טופלו במשטר FTC/TDF/RAL באמצעות הזרקה תת-עורית, ובאמצעות מתן פומי של משטרי מזון מדומים, FTC/TDF/RAL או FTC/TDF/ELV למשך 7.5 שבועות נוספים. (A) עומס נגיפי בפלזמה לאורך זמן לאחר הידבקות ב- HIV-1 בקבוצות שונות. (B) סיכום העומס הנגיפי לאורך זמן לאחר הידבקות ב- HIV-1 בקבוצות שונות, דיווח על ממוצע גיאומטרי קבוצתי עם רווח בר-סמך של 95% (CI). חיצים שחורים מציינים את זמן התחלת cART עבור קבוצות שטופלו ב-cART. (C) ניתוח הישרדות של טיפול זמן לאחר cART לעומס ויראלי בלתי ניתן לגילוי עבור כל קבוצה. n= 6-7 בכל קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: מתן אוראלי של מזון ART מראה שחזור מהיר יותר של יחס CD4/CD8. יחס CD4/CD8 בדם היקפי לאורך זמן לאחר הידבקות ב- HIV-1 עבור כל קבוצה. כל ההשוואות הסטטיסטיות נעשו באמצעות מבחן מאן-וויטני, ממוצע קבוצת דיווח (± S.E.). כוכביות אדומות מראות הבדלים סטטיסטיים בין קבוצת הזרקת המזון FTC/TDF/RAL לבין קבוצת הזרקת FTC/TDF/RAL SC. *P < 0.05. n=6-7 בכל קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

SK היא המייסדת של CDR3 Inc. שאר המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.