מאמר שיטה

המחשת תנועתיות חיידקים בהתבסס על תגובת צבע

DOI:

10.3791/63706

⸱

15 בפברואר 2022

 , 
1Department of Microbiology, School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, 2National Experimental Teaching Demonstration Center of Biopharmaceuticals, China Pharmaceutical University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי תנועתיות חיידקים בהתבסס על תגובת צבע. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם כי קל להעריך ומדויק יותר, ואינו דורש ציוד מיוחד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תנועתיות חיידקים חיונית לפתוגני חיידקים, ליצירת ביופילם ולעמידות לתרופות. תנועתיות חיידקים חיונית לפלישה ו/או הפצה של מינים פתוגניים רבים. לכן, חשוב לזהות תנועתיות חיידקית. תנאי גדילה חיידקיים, כגון חמצן, pH וטמפרטורה, יכולים להשפיע על גדילת חיידקים ועל ביטוי שוטונים חיידקיים. זה יכול להוביל לתנועתיות מופחתת או אפילו לאובדן תנועתיות, וכתוצאה מכך הערכה לא מדויקת של תנועתיות חיידקים. בהתבסס על תגובת הצבע של 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) על ידי dehydrogenases תוך תאי של חיידקים חיים, TTC נוסף לאגר מוצק למחצה מסורתי לזיהוי תנועתיות חיידקית. התוצאות הראו כי שיטת אגר מוצקה למחצה TTC לזיהוי תנועתיות חיידקים היא פשוטה, קלה לתפעול ואינה מערבת מכשירים גדולים ויקרים. התוצאות הראו גם כי התנועתיות הגבוהה ביותר נצפתה בתווך מוצק למחצה שהוכן עם 0.3% אגר. בהשוואה למדיום המסורתי המוצק למחצה, התוצאות קלות יותר להערכה ומדויקות יותר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תנועתיות חיידקים ממלאת תפקיד קריטי בפתוגניות חיידקים, בהיווצרות ביופילם ובעמידות לתרופות1. תנועתיות חיידקים קשורה קשר הדוק עם פתוגניות והיא הכרחית להתיישבות חיידקים במהלך זיהום מוקדם של תאים מארחים2. היווצרות ביופילם קשורה קשר הדוק לתנועתיות חיידקים, שבה חיידקים נצמדים לפני השטח של מדיה מוצקה באמצעות תנועתיות. תנועתיות חיידקים נחשבת מזה זמן רב לקורלציה חיובית עם היווצרות ביופילם. רמה גבוהה של עמידות חיידקית לתרופות עקב ביופילם עלולה להוביל לזיהומים מתמשכים המהווים איום על בריאות האדם 3,4,5. לכן, חשוב לזהות תנועתיות חיידקית. בדיקת תנועתיות החיידקים משמשת בעיקר לבחינת תנועתיותן של צורות שונות של חיידקים במצב החי, אשר יכול לקבוע בעקיפין את נוכחותם או היעדרם של שוטונים, ולכן יש לו תפקיד חשוב בזיהוי חיידקים.

ישנן שיטות ישירות ועקיפות לזיהוי תנועתיות חיידקית6. מכיוון שחיידקים עם שוטונים מראים תנועתיות, ניתן לזהות אם חיידקים נעים בעקיפין על ידי זיהוי נוכחות או היעדר שוטונים. לדוגמה, ניתן לזהות תנועתיות בעקיפין על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים וצביעת שוטונים כדי להצביע על כך שהחיידקים הם תנועתיים. ניתן גם לזהות בשיטות ישירות, כגון נפילת השעיה ושיטות ניקוב מוצקות למחצה.

שיטת הניקור המוצק למחצה הנפוצה במעבדות מיקרוביולוגיה לתואר ראשון לאיתור תנועתיות חיידקית מחסנת את החיידקים לנקב בתווך האגר המוצק למחצה המכיל 0.4-0.8% אגר, בהתאם לכיוון צמיחת החיידקים. אם החיידקים גדלים לאורך קו הנקב כדי להתפשט, מופיעים עקבות צמיחה דמויי ענן (דמויי מברשת), המעידים על נוכחות שוטונים, ולכן תנועתיות. אם אין עקבות צמיחה של קו ניקוב, החיידק אינו שוטון ואינו תנועתי.

עם זאת, לשיטה זו חסרונות: החיידקים חסרי צבע ושקופים, פעילות השוטון מושפעת מהמאפיינים הפיזיולוגיים של החיידקים החיים וגורמים נוספים, ומריכוז האגר וקוטרה הקטן של המבחנה. יתר על כן, חיידקים אירוביים מתאימים רק לצמיחה על פני האגר, המשפיעים על התצפית על תנועתיות החיידקים. לפיכך, כדי לשפר את הניסוי הזה, 2,3,5-triphenyltetrazolium כלוריד (TTC) (חסר צבע) נוסף למדיום כדי לבסס שיטה אמינה ואינטואיטיבית יותר לקביעת תנועתיות חיידקים מאשר שיטת ניקוב ישיר הנוכחית באמצעות dehydrogenases תוך תאיים כדי לזרז את היווצרות של מוצר אדום של TTC 7,8,9,10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מדיום מוצק למחצה

  1. אגר מסורתי חצי מוצק
    1. הכינו את האגר המסורתי המוצק למחצה על פי המתכון הבינוני לבדיקת תנועתיות חיידקים תוך שימוש במרכיבים הבסיסיים11. להמיס 10 גרם טריפטוז, 15 גרם NaCl, 4 גרם אגר במים מזוקקים מספיק, להתאים את ה- pH ל 7.2 ± 0.2, ולהשלים את הנפח הסופי ל 1,000 מ"ל.
    2. הוציאו את האגר בטמפרטורה של 121°C למשך 20 דקות, וחלקו אותו למבחנות בנפח 10 מ"ל כמדיום מוצק למחצה בגובה 3 ס"מ.
  2. אגר מסורתי חצי מוצק עם TTC
    1. לאחר autoclaving המדיום הקונבנציונאלי מוצק למחצה, לקרר אותו ל 50 ° C, להוסיף 5 מ"ל של פתרון סטרילי 1% TTC ל 100 מ"ל של בינוני, לערבב, ולחלק אותו לתוך 10 מ"ל מבחנות הבדיקה כדי ליצור מדיום מוצק למחצה בגובה 3 ס"מ.

2. זני חיידקים

הערה: שמונים זנים בודדו מהסביבה הימית וזוהו באמצעות מכשיר זיהוי חיידקים אוטומטי (ראה טבלת חומרים), כולל Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae ו - Aeromonas hydrophila (טבלה 1). סטפילוקוקוס זהוב (Staphylococcus aureus ) (ראו טבלת חומרים) שימש כבקרה שלילית שאינה תנועתית; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, ו - Salmonella typhimurium (ראה טבלת חומרים) שימשו כזני בקרה חיוביים.

  1. זהה זני חיידקים לבדיקה שישמשו לניתוח תנועתיות.
  2. כלול בקרות שליליות שאינן נעות וזני בקרה חיוביים תנועתיים.

3. תצפית תנועתיות חיידקית משופרת TTC

  1. בחר מושבות בודדות של חיידקי בדיקה מצלחות אגר וחסן אותם לשני מדיה מוצקה למחצה לעיל (שלבים 1.1.2 ו 1.2.1) על ידי ניקוב באמצעות מחטים חיסון.
  2. תרבית את הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור במשך 24-48 שעות כדי לצפות בתוצאות.
  3. שימו לב למצב הצמיחה: אפיין את החיידקים כחסרי תנועה (-) אם רק קו הנקב אדום. אפיין את החיידקים כתנועתיים (+) אם הצבע האדום מתפשט קלות החוצה לאורך קו הניקוב12.

4. השפעת ריכוזי אגר שונים על תנועתיות החיידקים

  1. הכינו מדיה מוצקה למחצה המכילה 0.3%, 0.5% ו-0.8% אגר וחסנו אותם על ידי ניקוב, כמתואר לעיל. שימו לב לתוצאות לאחר 24-48 שעות של דגירה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הן זנים סטנדרטיים והן זנים מבודדים הושוו לצורך זיהוי תנועתיות, והתוצאות מוצגות בטבלה 1. בשל היעדר שוטונים, Staphylococcus aureus ו Klebsiella pneumoniae רק גדל לאורך הקו מחוסן על מדיה מסורתית TTC מוצק למחצה. לעומת זאת, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli ו-Salmonella typhimurium הראו צמיחה בכל הכיוונים סביב הקו המחוסן לאחר תרבית במשך 24 שעות על מדיום מוצק למחצה TTC. זה היה אפילו יותר ברור אחרי תרבית של 48 שעות (איור 1). למרות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי תנועתיות החיידקים בשיטת המדיום המוצק למחצה מושפע מגורמים רבים13,14. תנאי גידול חיידקים, כגון חמצן (אירובי על משטח אגר, לא אירובי בתחתית הצינור עם המדיום המוצק למחצה), pH וטמפרטורה, יכולים להשפיע על הכדאיות של שוטונים חיידקיים, מה שעלול להוביל לתנועתיות מופחתת או אפילו לאובדן תנועתיות15. בנוסף, כמה חיידקים מסוג ריר כמו תנועתיות שלהם יכול להיות מושפע על ידי ייצור של podoconjugates.

הוספת TTC למדיום המוצק למח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי פיתוח התוכנית האקדמית המועדפת של מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו (PAPD) ופרויקט המחקר של רפורמת ההוראה של אוניברסיטת התרופות של סין (2019XJYB18).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Bacto AgarDifco
Escherichia coliATCCATCC25922בקרה חיובית
Pseudomonas aeruginosaATCCATCC27853בקרה חיובית
Salmonella typhimuriumATCCATCC14028שליטה חיובית
Staphylococcus aureusATCCATCC25923בקרה שלילית לא תנועתית
טריפטוז  OXOID
TTCSigma298-96-4
VITEK 2 מערכת זיהוי מיקרוביאלית אוטומטיתBio Mé ריו
:

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D. Bacterial motility. Journal of Bacteriology. 27 (2), 165(1934).
  2. Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis. Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).
  3. Ding, S. S., Wang, Y. Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review. Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), in Chinese 417-422 (2009).
  4. Zeng, J., Wang, D. Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance. Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).
  5. Xu, M., Zhou, M. X., Zhu, G. Q. Progress in the mechanism of bacterial flagellum motility, adhesion and immune escape. Chinese Journal of Veterinary Science. 37 (2), 369-375 (2017).
  6. Leboffe, M. J., Pierce, B. E. Microbiology: laboratory theory and application. Third edition. , Morton Publishing Company. Colorado. (2015).
  7. Ball, R. J., Sellers, W. Improved motility medium. Applied Microbiology. 14, 670-673 (1966).
  8. An, S., Wu, J., Zhang, L. H. Modulation of Pseudomonas aeruginosa biofilm dispersal by a cyclic-di-GMP phosphodiesterase with a putative hypoxia-sensing domain. Applied and Environmental Microbiology. 76 (24), 8160-8173 (2010).
  9. Chouhan, O. P., et al. Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae. AMB Express. 6 (1), 2(2016).
  10. McLaughlin, M. R. Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica. Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).
  11. Difco Laboratories. Difco manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology. Difco Laboratories. , Detroit. (1984).
  12. Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575(1936).
  13. Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. Explore the influencing factors of bacterial motility. Health Care Today. 6, 50-51 (2018).
  14. Wang, J., et al. Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility. Frontiers in Microbiology. 11, 581511(2020).
  15. Kühn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369(2018).
  16. Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria. Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).
  17. Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).
  18. Bartley, S. N., et al. Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule. PLoS One. 8, 55798(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TTC

מאמרים קשורים