אקס ויוו שחרור פפטיד הקשור לגן קלציטונין ממערכת Trigeminovascular במכרסמים

מיגרנה היא הפרעה נוירולוגית, על פי ארגון הבריאות העולמי, מוערך להשפיע על יותר מ -1 מיליארד אנשים והוא אחד הגורמים המובילים של נכות ברחבי העולם¹. לפיכך, למיגרנה יש השפעה משמעותית הן על המטופלים והן על החברה. למרות ההצלחה הקלינית האחרונה של תרופות נגד CGRP, חלק גדול מהחולים זקוקים לאפשרויות טיפול משופרות 2,3,4,5. נדרשת הבהרה של פתופיזיולוגיה של מיגרנה המובילה לטיפולים יעילים חדשניים. איתות בתוך המערכת הטריגמינווסקולרית המורכבת מקרום המוח, הגרעינים הטריגמינליים (TG) והגרעין הטריגמינלי caudalis (TNC) הוא מרכזי לפתופיזיולוגיה של מיגרנה ^6,7.

37 חומצות האמינו נוירופפטיד קלציטונין הקשורות לגן (CGRP) התגלה לראשונה בתחילת שנות ה-80 של המאה ה-20, כאשר אמארה ועמיתיו הראו כי ניתן לעבד את תעתיק ה-RNA הראשוני של הגן קלציטונין כדי לתת קידוד mRNA ל-CGRP בנוסף לקלציטונין ^8,9. המחקר שלאחר מכן הציע קשר לפתופיזיולוגיה של מיגרנה¹⁰. CGRP הוא נוירוטרנסמיטר עם תכונות מרחיבות כלי דם חזקות 11,12,13,14,15,16,1 ⁷, והוא מופץ באופן נרחב במערכת העצבים המרכזית וההיקפית 13,14,18,19,20,21,22 . המעורבות של CGRP במיגרנה הודגשה עם גילוי רמות CGRP מוגברות במחזור הדם התוך-מוחי במהלך התקפי מיגרנה^{בבני אדם 23}, וכי עירוי של CGRP גורם לכאב דמוי מיגרנה בחולים²⁴. שנתיים לאחר מכן, פורסם מחקר הוכחת ההיתכנות הראשון של האפקטיביות של אנטגוניסט CGRP olcegepant בטיפול במיגרנה²⁵.

CGRP מצוי בשפע במערכת הטריגמינווסקולרית כפי שהודגם ב-TG^21,26, סיבי עצב תחושתיים המעוררים את הדורה מאטר^27,28,29 ו-TNC³⁰. במערכת הטריגמינווסקולרית, CGRP נמצא בתאי העצב הקטנים עד בינוניים של ה-TG, בסיבי C לא מיאלינים, ומתבטא בכמעט 50% מהאוכלוסייה העצבית של ה-TG. קולטן CGRP מתבטא בעיקר בתאי עצב גדולים יותר ונמצא בסיבי Aδ^31,32. CGRP משתחרר מתאי עצב לאחר גירוי כימי או חשמלי^33,34. מחקרים על מסלולים המובילים לשחרור CGRP ומיקום הפעלה זו חיוניים להבנת פתופיזיולוגיה של מיגרנה. במהלך 5 העשורים האחרונים, מחקרים פרה-קליניים תרמו לרכישת ידע נרחב על איתותים הקשורים למיגרנה ותרמו לפיתוח טיפולים חדשים³⁵. שיטות רבות המתחשבות במעורבות וסקולרית ונוירוגנית שונו ויושמו בחקר המיגרנה. ניתן להזכיר מודלים in vivo ו- in vitro של תגובות עורקים לתרכובות ביולוגיות או טיפולים תרופתיים^17,36,37, וגירוי עצבי חשמלי^38,39. יתר על כן, נוירונים מופעלים ב- TNC יכולים להיות מזוהים על ידי ביטוי c-Fos 40,41,42 והקלטות אלקטרופיזיולוגיות באזור זה ^43,44. שתי השיטות מודדות אותות נוסיצפטיביים המועברים למוח מהראש, למשל דורה מאטר. השימוש במודל פרה-קליני אחד בלבד אינו מציג את התמונה המלאה של פתופיזיולוגיה של מיגרנה. לכן, חשוב לשלב מודלים שונים המכסים היבטים רבים ככל האפשר של פתופיזיולוגיה מיגרנה. המשך הפיתוח של מודלים חדשים יכסה היבטים שונים של מנגנוני מיגרנה, ועם הזמן תיחשף תעלומת הפתופיזיולוגיה של המיגרנה.

כאן, פרוטוקול מפורט מוצג של שיטת שחרור CGRP, שבוצעה ex vivo ב TG מבודד ו TNC מעכברים לאחר גירוי כימי. שחרור CGRP ניתן לחקור גם בדורה מאטר מחולדות. לפיכך, בפרוטוקול הניסוי לחולדות, דורה מאטר מתוארת יחד עם TG ו- TNC. הבסיס לשיטת שחרור CGRP תואר לראשונה בשנת 1999, שם אברסברגר ועמיתיו ערכו מחקר חלוצי ומצאו כי CGRP שוחרר מדורא מאטר לאחר גירוי כימי וחשמלי של אפרנטים דוראליים בחולדות⁴⁵. מאוחר יותר, גישה זו הורחבה לשחרור CGRP מה-TG⁴⁶ וה-TNC⁴⁷. לאחר מכן, השיטה שונתה כך שתחול על TG ו- TNC בעכברים. עד כה, שחרור CGRP מהדורה מאטר היה מאתגר בעכברים.

כל הליכי הטיפול והניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך הקהילה האירופית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (2010/63/UE). עכברי C57BL/6JBomTac זכרים, בני 10 שבועות, ועכברי ספראג דאולי זכרים, בני 10 שבועות, שימשו להדגמת פרוטוקול זה.

1. הכנת הנוזל הבין-תאי הסינתטי

1. הכינו נוזל אינטרסטיציאלי סינתטי (SIF) על פי המתכון הבא: 108 mM NaCl, 3.48 mM KCl, 3.50 mM MgSO 4, 26 mM NaHCO₃, 11.70 mM NaH 2 PO₄, 1.50 mM CaCl₂, 9.60 mM Na-gluconate, 5.50 mM גלוקוז ו-7.60 mM סוכרוז (ראו טבלת חומרים).
   הערה: SIF יכול להיות מגוון בהתאם ליעד הגירוי, למשל, ניתן להשתמש בתמיסה נטולת סידן בעת חקר תעלות סידן.
2. התאימו את ה-pH ל-7.4 וייצבו את ה-pH על ידי גז קרבוגן (5% CO 2 ו-95% O₂)⁴⁶.

2. המתת חסד

1. הרדימו עכברים וחולדות בוגרים בתערובת של 70% CO 2 ו-30% O₂. ערפו עכברים באמצעות זוג מספריים וחולדות באמצעות גיליוטינה (ראו טבלת חומרים).
   הערה: השתמש בזן ובגיל המתאימים למטרת המחקר. גם זכרים וגם נקבות יכולים לשמש במודל זה.
2. הפרד את הראש מהגוף ברמת C3-C4 של חוט השדרה.
   הערה: המתת חסד יכולה להתבצע גם עם הזרקה תוך-צפקית של פנטוברביטל (100-150 מ"ג/ק"ג).

3. דיסקציה

1. הכינו את רקמת החולדה לפי השלבים הבאים.
   1. הסר את העור ואת השריר סביב הראש והצוואר באמצעות זוג מספריים (איור 1A).
   2. השתמשו בגוזם עצמות ובמספריים כדי להפריד בין הלסתות התחתונות לראש (איור 1B-C).
   3. פתחו את חוט השדרה על-ידי החדרת גוזם עצם לתוך החלק הגבי של החוליות והסירו את החלק הגבי של החוליות כדי לחשוף את חוט השדרה ואת גזע המוח (איור 1D).
   4. חתכו את החלק הקאודאלי של הגולגולת בגבולות העצמות העורפיות והבין-פריאטליות כדי להסיר את מבני העצם האלה שחושפים את המוח הקטן (איור 1E).
      הערה: חשוב לא לפגוע בגזע המוח ובחוט השדרה בעת חיתוך והסרה של החוליות.
   5. יש לבודד את ה-TNC (Sp5C) הפועל באופן קאודיאלי במרחק של כ-13-16 מ"מ מהברגמה מכל צד על ידי חיתוך החלק הגבי של גזע המוח באמצעות מספריים קפיציים. היסחף את ה-TNC השמאלי והימני לתוך SIF (איור 1E-I).
      הערה: התיאור מתאים לחולדות בוגרות.
   6. חתכו את הראש באמצע הגולגולת כדי לחלק את הגולגולת לשניים באמצעות מסור (איור 1J-L).
   7. הסירו בזהירות את המוח מבלי לגעת בדורה מאטר המחוברת לגולגולת באמצעות מרית וחתכו את העצב הטריגמינלי במקום שבו הוא נכנס לגזע המוח (איור 1M-P).
   8. כדי לבודד את ה- TG, חתוך אותו, כולל ענפיו סביב הגבולות החזותיים. חותכים את הענף המנדיבולרי שבו הוא נכנס לאובלה של פורמן. חותכים את ענפי העיניים והמקסילריים הנכנסים לגולגולת מכיוון שהם אינם מחולקים באופן מקרוסקופי. בזמן ניתוח ה-TG, הסירו את הדורה מאטר שמכסה את ה-TG (איור 1Q-T).
   9. לטבול את חצאי הגולגולת ואת ה- TGs ב- SIF.
2. הכן את רקמת העכבר לפי השלבים הבאים.
   1. הסירו את העור והשרירים סביב הראש והצוואר באמצעות מספריים קטנים (איור 2A-B).
   2. פתח את חוט השדרה על-ידי החדרת זוג מספריים קטנים לתוך החלק הגבי של החוליות והסר את החלק הגבי של החוליות כדי לחשוף את חוט השדרה ואת גזע המוח (איור 2C).
      הערה: חשוב לא לפגוע בחוט השדרה בעת חיתוך והסרה של החוליות.
   3. חתכו את הגולגולת בגבולות העצמות העורפיות והבין-פריאטליות כדי להסיר את מבני העצמות האלה שחושפים את המוח הקטן (איור 2D-F).
   4. לאחר מכן, חתכו את עצם הקודקוד באמצע הקשת והסירו את העצם כדי לחשוף את המוח הגס (איור 2G-I).
   5. הסירו בזהירות את המוח הקטן בעזרת מרית כדי לחשוף את גזע המוח (איור 2J).
   6. בודדו את החלק המכיל TNC בגזע המוח באמצעות מספריים קפיציים (איור 2K-N). טבול את גזע המוח עם TNC ב-SIF (איור 2O).
   7. הסירו את המוח וחתכו את העצב הטריגמינלי במקום שבו הוא נכנס לגזע המוח (איור 2P-Q).
   8. כדי לבודד את ה- TG, חתוך אותו, כולל ענפיו סביב הגבולות החזותיים. חותכים את הענף המנדיבולרי שבו הוא נכנס לאובלה של פורמן. חותכים את ענפי העיניים והמקסילריים הנכנסים לגולגולת מכיוון שהם אינם מחולקים באופן מקרוסקופי. בזמן ניתוח ה-TG, הסירו את הדורה מאטר שמכסה את ה-TG (איור 2R-S).
   9. לטבול TGs ב-SIF (איור 2T).

4. כביסה

1. שטפו חצאי גולגולת, TNCs ו-TGs ב-SIF למשך 30 דקות תוך החלפת ה-SIF כל 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: ניתן לבצע את שלבי הכביסה תוך שמירה על הרקמה במיכלי פלסטיק עם מכסה טול כדי לאפשר החלפת SIF קלה (איור 3A-B).
2. הכינו את רקמת החולדה לפי השלבים הבאים.
   1. העבר חצאי TNC למכסי צינורות מיקרוצנטריפוגה נפרדים עם 350 μL של SIF (איור 3C).
   2. העבר את ה-TGs למכסי צינורות מיקרוצנטריפוגה - TG אחד לכל מכסה צינור מיקרוצנטריפוגה עם 350 μL של SIF (איור 3C).
   3. הניחו את חצאי הגולגולת על פלטפורמות העשויות מחימר או מצלחת תרבית בעלת 6 בארות ומלאו את הגולגולת ב-400 מיקרו-ליטר של SIF (איור 3C).
3. הכן את רקמת העכבר לפי השלבים הבאים.
   1. העבירו את גזע המוח עם TNC למכסה צינור מיקרוצנטריפוגה עם 250 μL של SIF (איור 3D).
   2. העבירו את שני ה-TGs למכסה צינור מיקרוצנטריפוגה עם 250 μL של SIF (איור 3D).
      הערה: יש להניח שני TGs לכל מכסה צינור מיקרוצנטריפוגה בעת שימוש ברקמה מעכברים.
4. הניחו גולגולות חולדות וכובעי צינורות מיקרוצנטריפוגה עם רקמת חולדה ועכבר באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. החלף SIF באמצעות פיפטה כל 5 דקות למשך 20 דקות.
   הערה: חשוב לא לגעת ברקמה בעת הוספה והסרה של SIF.

5. בדיקות סמים

1. קבע את רמות השחרור הבסיסיות של CGRP.
   1. לאחר הכביסה האחרונה, יש להוסיף 250 μL של SIF לעכבר TG ו-TNC. הוסיפו 350 μL לחולדה TG ו-TNC ו-400 μL לכל גולגולת חולדה.
   2. לאחר 10 דקות של דגירה, אסוף 200 μL של הדגימה בצינור microcentrifuge והוסף 50 μL של 10x EIA buffer (מסופק עם ערכת האנזים CGRP immunoassay, ראה טבלת חומרים) כדי לאפשר מדידה של שחרור CGRP הבסיסי (שלב 6). יש להשליך את הנוזל הנותר.
      הערה: זמן הדגירה חייב להיות זהה עבור כל הדגימות.
   3. מיד, לאחסן את הדגימות ב -20 מעלות צלזיוס.
   4. לאחר דגימה של רמות שחרור CGRP בסיסיות, בצע אחת משלוש השיטות: (A) גירוי יחיד (שלב 5.2); (B) גירוי ריכוז-תגובה (שלב 5.3); ו-(C) עיכוב גירוי (שלב 5.4) (איור 4).
      הערה: תרכובת הבדיקה והריכוזים שבהם נעשה שימוש תלויים במטרת המחקר.
2. בצע גירוי יחיד בהתאם לשלבים הבאים.
   1. הוסיפו תרכובת בדיקה או רכב לרקמה והשאירו אותה למשך 10 דקות (נפח: 250 μL עבור עכבר TG ו-TNC, 350 μL עבור TG ו-TNC של חולדה, ו-400 μL עבור כל גולגולת חולדה).
   2. לאחר 10 דקות של דגירה, לאסוף 200 μL של הדגימה בצינור microcentrifuge עם 50 μL של 10x EIA חיץ. יש להשליך את הנוזל הנותר ולאחסן מיד את הדגימות בטמפרטורה של -20°C.
      הערה: זמן הדגירה חייב להיות זהה עבור כל הדגימות.
3. בצע גירוי תגובת ריכוז בהתאם לשלבים הבאים.
   1. יש לדלל את תרכובת הבדיקה או הרכב לריכוזים הרצויים. הוסף את תרכובת הבדיקה בהגדלת הריכוזים החל מהריכוז הנמוך ביותר.
      הערה: תרכובת הבדיקה והריכוזים שבהם נעשה שימוש תלויים במטרת המחקר. לדוגמה, 1 μM, 10 μM, ו 100 μM supercinnamaldehyde שימשו במחקר הנוכחי.
   2. הוסף את הריכוז הנמוך ביותר (1 μM עבור המחקר הנוכחי) של תרכובת הבדיקה והרכב המתאים לשני תכשירי רקמה זהים ודגרה במשך 10 דקות (נפח: 250 μL עבור רקמת עכבר, 350 μL עבור חולדה TG ו- TNC, ו 400 μL עבור כל גולגולת חולדה).
   3. לאחר 10 דקות של דגירה, לאסוף 200 μL של הדגימה בצינור microcentrifuge עם 50 μL של 10x EIA חיץ.
   4. יש להשליך את הנוזל הנותר ולהוסיף את הריכוז השני הנמוך ביותר (10 מיקרומטר למחקר הנוכחי) לרקמה.
   5. מיד, לאחסן את הדגימות ב -20 מעלות צלזיוס.
   6. חזור על הליך זה עם הריכוזים הנותרים (100 μM עבור המחקר הנוכחי).
4. בצע עיכוב של גירוי בעקבות השלבים הבאים.
   1. מוסיפים את החוסם או הרכב לרקמה ודוגרים במשך 10 דקות (נפח: 250 μL עבור רקמת עכבר, 350 μL עבור חולדה TG ו- TNC, ו- 400 μL עבור כל גולגולת חולדה).
      הערה: החוסם והריכוז שבהם נעשה שימוש תלויים במטרת המחקר. לדוגמה, 3 μM glibenclamide שימשו לתוצאה המייצגת באיור 5.
   2. לאחר 10 דקות של דגירה, לאסוף דגימה של 200 μL בצינור microcentrifuge עם 50 μL של 10x EIA חיץ. יש להשליך את הנוזל הנותר ולאחסן מיד את הדגימות בטמפרטורה של -20°C.
   3. מוסיפים את האגוניסט או האגוניסט + החוסם (ראו טבלת חומרים) לרקמה ודוגרים במשך 10 דקות.
      הערה: האגוניסט, החוסם והריכוזים שבהם נעשה שימוש תלויים במטרת המחקר. במחקר הנוכחי נעשה שימוש ב-3 מיקרומטר של גליבנקלמיד ו-1 מיקרומטר של קפסאיצין, איור 5.
   4. לאחר 10 דקות של דגירה, לאסוף דגימה של 200 μL בצינור microcentrifuge עם 50 μL של 10x EIA חיץ. יש להשליך את הנוזל הנותר ולאחסן מיד את הדגימות בטמפרטורה של -20°C.
5. בצע בקרה חיובית עבור הניסוי.
   1. בעת הצורך, הוסף בקרה חיובית (למשל, 1-10 μM של קפסאיצין, ראה טבלת חומרים) לרקמה בסוף הפרוטוקול ואסוף דגימה של 200 μL בצינור microcentrifuge עם 50 μL של 10x EIA buffer לאחר תקופת דגירה של 10 דקות.
      הערה: כדאי לכלול בקרה חיובית כדי להבטיח שההתקנה והרקמות מתפקדות. קפסאיצין 48,49,50 או הגירוי הדה-פולריזציה של אשלגן (40-60 מ"מ של KCl)^46,47,49 משמשים באופן שגרתי כדי לגרום לשחרור CGRP מהמערכת הטריגמינווסקולרית. 40-60 mM של KCl SIF מוכן כמו SIF, למעט NaCl מוחלף עבור KCl על בסיס שווה.

6. ניתוח ריכוזי CGRP

1. מדוד את כמות ה-CGRP המשתחררת באמצעות ערכת בדיקת אנזימים (EIA) בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים).
2. מדוד את הצפיפות האופטית ב-410 ננומטר באמצעות פוטומטר צלחת. אם נעשה שימוש בערכת CGRP EIA אחרת, מדוד את הצפיפות האופטית באורך הגל המסופק בפרוטוקול היצרן.
   הערה: יש לדלל את הדוגמאות כך שיתאימו לעקומה הסטנדרטית.
3. בצע ניתוח נתונים.
   1. הצג את הנתונים כריכוזים מוחלטים או נרמל לשחרור CGRP הבסיסי מהרקמה הספציפית.

טכניקה זו היא כלי לחקור את המנגנונים המולקולריים הקשורים ל-CGRP המעורבים במיגרנה. יש לו את היתרון של הערכת שחרור CGRP מרמות שונות של מערכת trigeminovascular והוא יכול להיות מיושם הן על עכברים מסוג בר וטרנסגניים וחולדות בשילוב עם תרכובות פרמקולוגיות שונות. כאן מוצגים ניסויי ריכוז-תגובה וחסימה מחולדות ותוצאות תגובת ריכוז מעכברים מסוג בר ועכברים מהונדסים.

שיטת השחרור של CGRP שימשה כדי לחקור את ההשפעה של מעכב ערוץK ATP גליבנקלמיד על שחרור CGRP מ-TG ודורה מאטר אצל נקבות חולדות אלודינליות טריגמינליות ספונטניות (STA). ראשית, הריכוז האופטימלי של קפסאיצין נמצא באמצעות תכנון מחקר תגובה-ריכוז. חשיפה לקפסאיצין גרמה לשחרור CGRP משמעותי מדורא מאטר ו-TG בהשוואה לרכב (איור 5). בדורה מאטר, השחרור המרבי של CGRP נמצא ב-1 μM של קפסאיצין, וב-TG, השחרור המרבי של CGRP נמצא ב-10 μM של קפסאיצין (איור 5A-B). בהתבסס על ניסויי תגובת הריכוז, 1 μM של קפסאיצין ו-3 μM של גליבנקלמיד שימשו לניסויים חוסמים. גליבנקלמיד לא הראה השפעה על שחרור CGRP בסיסי מדורא מאטר (P = 0.441) ו- TG (P = 0.881) כאשר נותח עם ANOVA51 חד-כיווני. גליבנקלמיד הפחית באופן משמעותי את שחרור ה-CGRP המושרה על-ידי קפסאיצין בדורה מאטר ב-40% (P = 0.031) וב-TG ב-39% (P = 0.003) בהשוואה לקפסאיצין עם הרכב כאשר נותח באמצעות ANOVA חד-כיווני (איור 5C-D)51.

בעכברים, הפרוטוקול שימש לבחינת המעורבות של תעלת היונים הפוטנציאלית של הקולטן החולף אנקירין 1 (TRPA1) במודל עכבר GTN של מיגרנה, שבו רגישות יתר הנגרמת על ידי GTN הייתה תלויה לחלוטין בערוצי TRPA1. נמצא כי אגוניסט TRPA1 supercinnamaldehyde (SCA) משחרר CGRP באופן תלוי מינון מה-TG עם 1 μM, 10 μM ו-100 μM של SCA, וכתוצאה מכך 9% (P = 0.23), 51% (P = 0.011) ו-69% (P = 0.0097) הגדילו את השחרור של CGRP בהשוואה לרכב, בהתאמה כאשר נותחו עם ANOVA דו-כיווני. שחרור זה נעדר ב-TG מעכברי Trpa1 null שבהם חשיפה ל-1 μM, 10 μM ו-100 μM של SCA הביאה ל-11% (P > 0.99), -13% (P > 0.99) ו-9% (P = 0.97) אחוז שינוי בשחרור CGRP בהשוואה לרכב, בהתאמה כאשר נותח עם ANOVA דו-כיווני. הגירוי הבא עם 10 מיקרומטר של קפסאיצין (בקרה חיובית) מראה שכל דגימות הרקמה יכולות לשחרר CGRP (איור 6)50.

איור 1: כריתה שלב אחר שלב של רקמות מחולדות. הפרטים (A-T) מופיעים בסעיף הפרוטוקול (שלב 3.1). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: ניתוח שלב אחר שלב של רקמה מעכברים. הפרטים (A-T) מופיעים בסעיף הפרוטוקול (שלב 3.2). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: שטיפה ודגירה של רקמת מכרסמים. (א-ב) רקמה מבודדת טרייה במיכלי פלסטיק עם SIF. המכלים מכוסים טול כדי לאפשר החלפה קלה של SIF. (C) רקמת חולדה - שני חצאי גולגולת עם דורה מאטר המכסים את הבטנה הפנימית של הגולגולת מונחים על צלחת תרבית 6 בארות. הגרעין הטריגמינלי הימני והשמאלי caudalis במכסי צינורות מיקרוצנטריפוגה נפרדים (שורה עליונה של מכסים). שני הגרעינים הטריגמינליים במכסי צינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים (שורה תחתונה של מכסים). (D) רקמת עכבר - הגרעין הטריגמינלי המכיל חלק מגזע המוח במכסה צינור מיקרוצנטריפוגה נפרד (למעלה). שני גרעינים טריגמינליים של עכברים נמצאים במכסה צינור מיקרוצנטריפוגה אחד (למטה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: תכנוני מחקר לשחרור CGRP. שלושה פרוטוקולים שונים לביצוע ניסויי שחרור CGRP. יש לדלל את התרופות בנוזל אינטרסטיציאלי סינתטי (SIF). (A) גירוי יחיד. (B) גירוי ריכוז-תגובה. (C) עיכוב של גירוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: גליבנקלמיד מעכב שחרור CGRP המושרה על-ידי קפסאיצין מחולדות דורה מאטר ומגנגליון טריגמינלי. רמות CGRP מגנגליון טריגמינלי ודורה מאטר שבודדו מנקבות חולדות אלודינליות טריגמינליות ספונטניות (STA) (215-318 גרם) שמקורן במקור באוניברסיטת תומאס ג'פרסון52 נמדדו באמצעות ערכות CGRP EIA אנושיות מסחריות. (א-ב) שחרור CGRP מ-(A) דורה מאטר ו-(B) גנגליון טריגמינלי לאחר הגדלת ריכוזי קפסאיצין (10 ננומטר, 100 ננומטר, 1 מיקרומטר ו-10 מיקרומטר) (n = 4). הנתונים מוצגים כנקודות בודדות ונותחו עם ANOVA דו-כיווני. p < 0.0001 (C-D) רמות של CGRP ששוחררו מ-(C) דורה מאטר ו-(D) גנגליון טריגמינלי לאחר חשיפה של 10 דקות לרכב, 3 μM glibenclamide (glib), 1 μM קפסאיצין ו-1 μM קפסאיצין + 3 μM glib (n = 6-11). הנתונים מוצגים כנקודות בודדות וערכים ממוצעים ונותחו עם ANOVA חד כיווני. *בהשוואה לרכב. #קפסאיצין לעומת קפסאיצין + גליב. #P < 0.05, ** ו##P < 0.01, ****P < 0.0001. הניתוחים בוצעו באמצעות מבחן ההשוואה המרובה של בונפרוני. רמה משמעותית של α = 0.05 שימשה לכל הבדיקות. נתון זה שונה מכריסטנסן ואחרים. 51. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 6: חשיפה ל-SCA גורמת לשחרור CGRP תלוי TRPA1 מגנגליון טריגמינלי של עכברים. רמות CGRP ששוחררו מגנגליון טריגמינלי שבודד מ-WT ו-Trpa1 null (Trpa1tm1/Dpc)53 עכברים זכרים (8-10 שבועות) נמדדו עם ערכות CGRP EIA של חולדות לאחר חשיפה לסופר-סינמאלדהיד (SCA) ב-1 מיקרומטר, 10 מיקרומטר ו-100 מיקרומטר וקפסאיצין ב-10 מיקרומטר כבקרה חיובית (n = 6). הנתונים מכל עכבר מוצגים כנקודות נפרדות, ופסים מציינים את הערכים הממוצעים. סטטיסטיקה: ההשוואה בין SCA לרכב בכל ריכוז ובין בקרה בסיסית לחיובית בוצעה עם ANOVA דו-כיווני חוזר. רמה משמעותית של α = 0.05. *P < 0.05, **P < 0.01. נתון זה שונה מכריסטנסן ואחרים. 50. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

למחברים אין מה לחשוף.