הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גידול המוני ומחקרים מולקולריים בחרקים מזיקים בטורטריים

2.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63737

⸱

25 במרץ 2022

 ,  ,  , 
1Department of Applied Biological Science, Tokyo University of Agriculture and Technology

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את שיטת הגידול של חרקים מזיקים טורטריים במעבדות. ההליכים להבחנה בין מין החרקים ולמיצוי חומצות גרעין לריצוף בתפוקה גבוהה נקבעים באמצעות שני מזיקים מומנטיים.

תקציר

Tortricidae (Lepidoptera), הידוע בכינויו טורטריקס או עש עלים, כולל מזיקים חקלאיים וייעוריים רבים, הגורמים להפסדים חקלאיים חמורים. כדי להבין את הביולוגיה של עשים מזיקים כאלה, טכניקות בסיסיות היו מבוקשות מאוד. כאן, שיטות לגידול מסה, תצפיות ומחקרים מולקולריים מפותחות באמצעות שני טורטריקס תה, Homona magnanima ו - Adoxophyes honmai (לפידופטרה: Tortricidae). חרקים גודלו באופן המוני עם תזונה מלאכותית פרוסה ונשמרו על ידי רבייה במשך יותר מ-100 דורות על ידי התחשבות בתכונות הביולוגיות שלהם. לחרקים יש דימורפיזמים מיניים שונים; לפיכך קשה להבחין בין המין בשלבי ההתפתחות, שמנעו בדיקות עוקבות. העבודה הנוכחית הדגישה כי ניתן לקבוע את המין של זחלי הטורטרידים על ידי התבוננות באשכים או בכתמי אורצין לקטיים-אצטיים כדי לדמיין את כרומוזום W הספציפי לנקבה. יתר על כן, באמצעות שיטות קביעת המין, המחקר הנוכחי איפשר מיצוי חומצות גרעין ממין קבע עוברים ויישום לקראת ריצוף בתפוקה גבוהה. טיפים אלה ישימים עבור חרקים מזיקים אחרים ויאפשרו מחקרים מורפולוגיים וגנטיים נוספים.

מבוא

חרקי לפידופטרן מייצגים יותר מ-10% מכלל המינים החיים המתוארים1, ומיני טקסה מסוימים גורמים נזק חמור לצמחים ולאובדן חקלאי חמור 2,3. למרות שמחקרים מולקולריים וגנטיים פותחו באמצעות חרקי מודל כגון תולעת המשי בומביקס מורי 4,5, חרקים מזיקים נותרים ללא התערבות, בין היתר בגלל קשיי הגידול והטיפולב-6,7. לכן, מחקרים בסיסיים וטכניקות נחוצים כדי להבין את הביולוגיה של חרקים מזיקים כאלה שאינם מודל.

ה-Tortricidae (Lepidoptera), הידוע בכינויו טורטריקס או עש עלים, כולל מזיקים חקלאיים וייעוריים רבים8. מבין טקסי החרקים, טורטריקס התה האוריינטלי Homona magnanima Diakonoff ופירות הקיץ Tortrix Adoxophyes honmai Yasuda הם מזיקים פוליפגוטיים רציניים הידועים כמזיקים לעצי תה במזרח אסיה7. שני המינים מטילים אשכולות ביצים שטוחים וסגלגלים דמויי קשקשים (או מסות ביצים) המורכבים מביצים דקות, רכות ושבריריות המכוסות בהפרשות אימהיות. אף על פי ששלבי העוברים הם חיוניים להתפתחות החרקים ולקביעת המין9, מבנים של הביציות מונעים ניתוח נוסף מהבנת הביולוגיה של החרקים. חשוב להתגבר על הקשיים למחקר נוסף על מזיקים המזיקים המסתבכים עם מסת ביצה מורכבת כזו.

כאן, כדי להבין את הביולוגיה של טורטרידים, פותחו שיטות לגידול מסה, תצפיות ומחקרים מולקולריים באמצעות A. honmai ו - H. magnanima. ראשית, שיטות גידול המוני שומרות על שני הטורטרידים במשך 100 דורות על ידי גזע. הפרדת הביציות ממסת הביצית דמוית הקשקשים המשורשרים אפשרה תצפית עוברית על הטורטרידים באמצעות ממיסים אלקליין ואורגניים שפותחו בעבר מטכניקות ששימשו בזבובים10. בנוסף, המחקר הנוכחי ביסס אפליה מינית של עוברים קטנים על ידי פיתוח שיטות צביעה של כרומטין המין של נקבות lepidopteran באמצעות orcein לקטי-אצטי11. על ידי שילוב שיטות אלה, חומצות גרעין באיכות גבוהה ובכמות הופקו מעוברים שנקבעו על ידי מין, שאחרת היה קשה לקבוע6. הרנ"א שחולץ שימש לריצוף הדור הבא. באופן קולקטיבי, השיטות המוצגות כאן חלות על חרקים לפידופטרנים אחרים ועל טקסות חרקים אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. איסוף חרקים וגידול המוני

  1. לאסוף חרקים טורטריים משדות בעקבות הפניות שפורסמו בעבר 8,12.
    הערה: זחלי H. magnanima ו-A. honmai נאספים מעלי תה פגומים (איור 1A); מבוגרים נמשכים באמצעות אור UV נייד של 4 W (אורך גל של 365 ננומטר, ראו טבלת חומרים, איור 1B).
  2. גבו את הזחלים שנאספו (איור 1C,D) בנפרד על פיסת תזונה מלאכותית בכוס של 1/2 אונקיה במשך 2-3 שבועות עד להסתרה בוגרת (איור 1E,F). אשרו את מין הגלמים והבוגרים על ידי תכונות מורפולוגיות (איור 1G,I).
  3. הצמידו את הזכרים והנקבות בקופסת פלסטיק (30 ס"מ על 20 ס"מ על 5 ס"מ) למסות ביצים אוביפוזיט על נייר פרפין (איור 1J-L). הניחו נקבה ושני זכרים בכוס פלסטיק של 120 מ"ל עם פיסת נייר פרפין כדי ליצור מטרלין.
    הערה: חשוב להכין קמטים על נייר הפרפין. עבור H. magnanima, נייר פרפין צריך להיות בתחתית המארז. בינתיים, עבור A. honmai, שים נייר על תקרת המארז כדי לאסוף ביצים (איור 1L) מכיוון שמסת הביצה של H. magnanima oviposit בצד העליון של עלי התה, אך A. honmai מטיל ביצים על החלק התחתון של העלים8. הנהלים אומתו גם במינים טורטריים אחרים, ועדיף להניח ניירות משני הצדדים אם האקולוגיה וההתנהגות של מיני המטרה אינם מסווגים.
  4. חותכים את מסות הביצים (בערך 100-200 ביצים למסת ביצה12, איור 1M) על נייר הפרפין עם מספריים. מניחים את הביצים בכוס של 1/2 אונקיה עם נייר זרוק למשך 5-7 ימים.
    הערה: העובר הבוגר מציג קפסולת ראש שחור (איור 1N). התקופות של embryogenesis מיוחסות באופן מגוון למינים טורטריים, אך בדרך כלל 5 ימים לאחר ההטלה (dpo) עבור H. magnanima ו-4 dpo עבור A. honmai ב-25 °C עם 60% לחות יחסית, 16 שעות אור/8 שעות מחזורי חושך7.
  5. אחסנו את המוני הביצים המציגות כמוסות ראש שחורות בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים.
  6. פורסים כ-60 גרם דיאטות מלאכותיות באמצעות פומפיה לגידול המוני. מניחים את מסת הביצית המלאה בעוברים בוגרים על התזונה המלאכותית הפרוסה במיכל פלסטיק (23 ס"מ על 16 ס"מ על 8 ס"מ). הניחו ניירות פרפין על מסת הביצה בעזרת הדיאטות הפרושות (איור 10).
    הערה: מתחת ל-30% לחות יחסית נחשבת יבשה מדי, בעוד שלמעלה מ-70% לחה מדי. עדיף ליצור חורים במכסה של מיכל הפלסטיק כדי לאפשר אוורור טוב יותר. מלאו את החורים בכותנה כדי למנוע בריחות של זחלים קטנים.
  7. כדי לסלק מזהמים פני השטח מהביצים, להשרות את מסת הביצה לתוך 3% פורמלין ו 0.2% תמיסת בנזלקוניום כלוריד במשך 5 דקות, בהתאמה12. כדי למגר חיידקי מעיים או חיידקים תוך-תאיים, השתמשו בתזונה מלאכותית בתוספת 0.05% (w/w) טטרציקלין הידרוכלוריד או 0.06% (w/w) ריפאמפיצין במקום תזונה מלאכותית רגילה (ראו טבלת חומרים).
    הערה: שלב זה הוא אופציונלי. חשוב ללוש את Silk Mate 2S ו-0.05% (w/w) טטרציקלין הידרוכלוריד או 0.06% (w/w) ריפאמפיצין באופן שווה לצורך עקביות.
  8. אספו את הגלמים ממיכל הפלסטיק והבדילו את המין על סמך12 מאפיינים מורפולוגיים (איור 1G-I).
    הערה: באופן כללי, טורטרידים מציגים 5-6 אינסטארים עד לגור12. הזחלים H. magnanima ו - A. honmai לוקחים 3 שבועות ושבועיים, בהתאמה, לאחר הבקיעה עד הגור.
  9. הניחו 15 זכרים ו-10 נקבות בקופסת פלסטיק (30 ס"מ על 20 ס"מ x 5 ס"מ, איור 1K) להזדווגות עם 25 מעלות צלזיוס, 16 ליטר/8 ד', אספו ביצים ל-5-7 ימים וחזור על שלבים 1.4-1.9. לכל דור.
    הערה: אם יש צורך באיסוף המוני ביצים חדשים לניתוח מאוחר יותר, הגדר את ההתחלה והסיום של התקופה החשוכה, למשל, מ-9 בבוקר עד 17:00. במצב זה, H. magnanima ו - A. honami בדרך כלל ביצי oviposit לאחר 5 שעות (14:00).

2. הפרדת ביצים וזחלי pharate ממסות ביצים לקיבוע, חלחול וכתמים

  1. השרו את מסת הביצה לתוך 1,000 μL של 1.2% נתרן היפוכלוריט תמיסה מימית למשך 10 דקות או לתוך 1,000 μL של 5 M אשלגן הידרוקסיד תמיסה מימית במשך 30 דקות כדי להפריד את הביצים.
  2. שטפו את הביצים המופרדות ב-1,000 μL של PBSt (137 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO4, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH2PO4, 0.05% של פוליאוקסיאתילן (20) סורביטן מונולאוראט [Tween-20] pH 7.4, ראו טבלת חומרים) בעקבות הדו"ח שפורסם בעבר7.
  3. השרו ביצים בתערובת של 500 μL של 100% הפטאן ו-500 μL של תמיסת 4% paraformaldehyde-PBSt (w/v). מערבבים במשך 10 דקות ב-1,500 סל"ד באמצעות מערבל מערבל מערבולות.
  4. השרו את הביצים לתערובת של 500 מיקרול'ל של 100% הפטאן ו-500 מיקרול' של 100% מתנול. מערבבים במשך 10 דקות ב-1,500 סל"ד.
  5. שטפו את הביצים פעמיים עם 1,000 μL של 100% מתנול ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ב-100% מתנול עד לניסויים נוספים (איור 2A).
    הערה: ניתן לאחסן את הביצים לפחות לשנה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  6. משרים את הביצים ברצף ב-99%, 70%, 50% אתנול ו-PBSt למשך 5 דקות כל אחת לצורך הידרופיליזציה בעקבות דו"ח7 שפורסם בעבר.
  7. שטפו את הביצים עם PBSt, טבלו את הביצים ב-1 מיקרוגרם/מ"ל של תמיסת DAPI למשך 5 דקות, ולאחר מכן שטפו את הביצים עם 1x PBS פעמיים. השרו את הביצים ב-20 מיקרול' של תמיסת אורצין לקטית-אצטית של 1.25% (w/w) (ראו טבלת חומרים)11 כדי לדמיין את ההטרוכרומטין עד שהגרעינים יציגו צבע אדום בוהק (זה נע בין 5-60 דקות) (איור 2B,C).
    הערה: תקופות הכתמת האורצין הלקטי-אצטי תלויות בטמפרטורה ובלחות. עדיף לבדוק אם יש צביעה נכונה באמצעות מיקרוסקופ עם הגדלה של 4x-10x.
  8. מעבירים את הביצים הוויטראז'יות באמצעות פיפטה למגלשת זכוכית. הצמידו את הביצים המוכתמות לריאגנט אנטיפאד (ראו טבלת חומרים) וזכוכית כיסוי7.
  9. חלצו את הזחלים pharate H. magnanima ו-A. honmai (4-5 ימים לאחר ההטבעה (dpo)) ממסות הביצים באמצעות מלקחיים (איור 2D). זחלים דו-כיווניים על מגלשת זכוכית (איור 2E).
  10. לתקן את כל הרקמות (למשל, גנגליון תת-וושט, גרעיני בית החזה, צינורית מלפיגית וכו ') עם תערובת של 1:3 (v/v) 99.7% חומצה אצטית/100% מתנול למשך 5 דקות. הכתימו את אלה בתמיסת אורצין לקטית-אצטית11 ב-1.25 % עד שהגרעינים מוכתמים (פעולה זו יכולה להימשך 5-60 דקות, בהתאם לטמפרטורה וללחות).
  11. קבעו את המין של כל דגימה על ידי התבוננות בנוכחות (נקבה) או בהיעדר (זכר) של הטרוכרומטין (כרומוזום W, איור 2F,G) תחת מיקרוסקופ.
    הערה: המין נקבע על ידי הדמיה של כרומטין המין. כל תא מייצג את כרומטין המין כנקודה אצל נקבות11,12, בעוד שהחלק הנותר של רקמות הזחל של pharate (לא קבוע) צריך להיות שקוע באופן מיידי במאגר ליזה של תאים12 (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, ו-1% SDS, pH 8.0) או ריאגנטים המכילים RNA המכילים פנול עבור מיצוי DNA או RNA. לפני הניתוחים, מחלקים מראש 20 μL של הריאגנטים לתוך צינורות PCR של 0.2 מ"ל (איור 3A). לטבול ולאחסן דוגמאות בטמפרטורה של -80 °C (80 °F) עד למיצוי נוסף. ניתן לאחסן את הדגימות במשך 3 חודשים לפחות, אך עדיף להמשיך בניסויים במורד הזרם כדי למנוע פירוק של חומצות גרעין.

3. מיצויי דנ"א ורנ"א ממין קבעו זחלי פאראט

  1. רכזו 12 זחלי פאראט זכרים או נקבות שנקבעו על ידי המין (5 עוברי dpo) והוסיפו את מאגר הליזיס של התא או ריאגנטים להפקת RNA (ראו שלב 2.11 וטבלת החומרים) לצינור אחד של 1.5 מ"ל.
    הערה: בצע את שלבים 3.2-3.7 למיצוי DNA ואת שלבים 3.8-3.11 למיצוי RNA.
  2. הומוגניזציה של רקמות ב-600 μL של מאגר הליזיס של התא (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA ו-1% SDS, pH 8.0), וצנטריפוגות הדגימות ב-10,000 x g למשך 5 דקות ב-4 °C (74 °F).
  3. אספו את הסופרנאטנט (500 μL) באמצעות פיפטה ודגרו בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס עם 1.5 μL של פרוטאינאז K (20 מ"ג/מ"ל, ראו טבלת חומרים) למשך 5 שעות על בלוק חום.
  4. טפלו בדגימות עם 1.0 μL של 10 מ"ג/מ"ל של תמיסת RNase (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  5. הוסף 200 μL של תמיסת משקעים חלבונית (ראה טבלת חומרים) לצינורות7, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 17,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (76 °F).
  6. מערבבים את הסופרנאטל (500 μL) עם 500 μL של 100% איזופרופנול, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-20,400 x g למשך 10 דקות ב-4 °C (75 °F).
  7. לשטוף את הדנ"א הכדורי פעמיים עם 1,000 μL של 70% אתנול. לאחר מכן, יבש באוויר (5-10 דקות בטמפרטורת החדר), ממיס את הדנ"א ב-30 מיקרול'ל של חיץ Tris-Cl של 10 mM (pH 8.5).
  8. הומוגניזציה של הרקמות ב-600 μL של ריאגנטים להפקת RNA והוספת 240 μL של מים מזוקקים טהורים במיוחד לצינור. צנטריפוגה את הצינורות ב 12,000 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (64 °F).
  9. מערבבים את הסופרנאטנט (600 μL) עם 600 μL של 100% איזופרופנול ומעבירים את התערובת לעמודת ספין סיליקה (ראו טבלת חומרים). צנטריפוגה את הצינורות ב 17,900 x g במשך דקה אחת ב 4 °C (64 °F).
  10. שטפו את העמודה ב-750 μL של 70% אתנול, וצנטריפוגה של העמודה פעמיים ב-17,900 x גרם למשך דקה אחת כל אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  11. טען 15 μL של מים מזוקקים טהורים במיוחד לעמוד. צנטריפוגה של הצינורות ב-17,900 x g למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס כדי לחמוק מה-RNA.
  12. חישוב ואמת את האיכות והכמות של דנ"א ורנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר מבוסס UV. הערך את טוהר חומצות הגרעין באמצעות יחס A260/A280 (חומצות גרעין/חלבון) ו-A260/A230 (חומצות גרעין/מלחים ומזהמים אחרים)13.
    הערה: עבור מיצוי RNA, בוצע הליך12 שפורסם בעבר, אשר הביא לזיהום פנול (טבלה 1). הדנ"א והרנ"א המופקים מעובר יחיד או מזחלי pharate מניבים דגימות בעלות כמות נמוכה ובאיכות נמוכה. בדרך כלל, מיצוי דנ"א מ-12 זחלי pharate מניב 100-600 ננוגרם, בעוד שמיצוי RNA בשיטה הנוכחית מייצר 900-1,500 ננוגרם, כפי שמוצג בטבלה 1.
    הערה: שלבים 3.13-3.15 הם אופציונליים לבדיקות נוספות של ריצופי תפוקה גבוהה.
  13. חשב את כמויות הדנ"א והרנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר מבוסס פלואורסצנציה.
    הערה: היחס בין כמויות הרנ"א (ריכוז מבוסס UV (ng/μL)/ריכוז מבוסס פלואורסצנציה (ng/μL)) חושב כדי להעריך את האיכות ליישום ניסיוני נוסף. לדוגמה, כאשר ריכוזי UV וריכוזים פלואורסצנטיים הם 80 ng/uL ו-60 ng/uL, בהתאמה, היחס יהיה 1.5 (80/60). בדרך כלל, יחסים מתחת ל-1.5 מצביעים על טוהר מספיק עבור יישומים במורד הזרם באמצעות ריצוף תפוקה גבוהה13.
  14. נתח את איכות הרנ"א באמצעות שבב אלקטרופורזה14.
  15. השתמש ב-RNA המוסמך כדי להכין את ספריית הרנ"א באמצעות ערכת הכנת ספריית RNA (ראה טבלת חומרים). רוצף את הספריות באמצעות פלטפורמה המתאימה לספריות המוכנות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הקמת קווים מארחים ותחזוקתם
הכדאיות של זחלים שנאספו בשדה מיוחסת באופן שונה למיקום השדה, לעונות השנה ולתנאי הגידול (למשל, 90% מהכדאיות בטייוואן, טאויואן, כפי שמוצג ב-Arai et al.12). כ-30%-50% מהזוגות ייצרו את הדור הבא כרגיל. עבור H. magnanima ו - A. honmai, מטרילינים נשמרו על ידי רבייה במשך למעלה מ-100 דורות.

תצפיות מורפולוגיות וקביעות מין
הטיפול באשלגן הידרוקסיד (3 או 5 M KOH) או בנתרן היפוכלוריט (1.2% Cl2

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

טורטרייד כולל מספר מזיקים חקלאיים וייעוריים; המחקר הנוכחי הציג שיטות לגידול טורטריקס במשך דורות, התבוננות באמבריוגנזה ובמין של החרקים, וביצוע אנליזה מולקולרית באמצעות עוברים בוגרים.

אחד המכשולים בחקר חרקי ההדברה הוא קביעת שיטות גידול. במיוחד, הרבייה לפעמים להשפיע על הכושר של המין באופן שלילי. ירידת הכושר על ידי הגזע, הנקרא דיכאון רבייה, נצפתה באופן נרחב בצמחים ובבעלי חיים שונים, כולל חרקים 15,16,17,18.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות על תמיכת האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) במלגות מחקר למדענים צעירים [מענק מספר 19J13123 ו- 21J00895].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1/2 גרםFP CHUPACP070009גידול חרקים; https://www.askul.co.jp/p/6010417/
1/2 אונקיות מכסהFP CHUPACP070011גידול חרקים; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether
99.7% חומצה אצטיתFUJIFILM Wako Chemicals Co., אוסקה, יפןקיבוע 36289; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent Technologiesלא הוצגהכימות חומצות גרעין; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Agilent RNA6000 nano kitAgilent Technologies5067-1511כימות חומצות גרעין; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG
.pdf
תמיסת בנזלקוניום כלורידNihon Pharmaceutical Co., Ltdמס' 4987123116046עיקור; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html
כותנהAOUME8-1611-02גידול חרקים;
https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 תמיסת DAPIDojindo, טוקיו, יפן340-07971מכתמים; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/
דיסודיום הידרוגנפוספטFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Na2HPO4;
ערכת כימות https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html dsDNA HSInvitrogenQ33231כימות חומצות גרעין; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230
עמודת Econospin RNA IIEpoch Life Science Inc.מיצוי RNAEP-11201
אתנולFUJIFILM Wako Chemicals Co., אוסקה, יפןקיבוע 4.98748E+12; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html
אתילנדיאמין-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית מלח טטרה-הידרט (4NA)FUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12מאגר ליזה תאים (EDTA);
https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html נייר זכוכיתHEIKO2100010גידול חרקים; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla&
utm_medium=cpc& utm_source=
בלוק
חום Adw WSC-2620 PowerBLOCKATTO, טוקיו, יפן4002620דגירה; https://www.attoeng.site/
הפטןFUJIFILM Wako Chemicals Co., אוסקה, יפן4.98748E+12קיבוע; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html
INSECTALF Nosan Co., Ltdלא מוצגדיאטה מלאכותית; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
מיצוי RNAשל ISOGENIINippon Gene311-07361
https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html איזופרופנולFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12מיצוי חומצות גרעין; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html
חומצה לקטיתFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12מכתמים; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html
מתנולFUJIFILM Wako Chemicals Co., אוסקה, יפן4.98748E+12קיבוע; מערבולת
https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html MSV-3500BiosanBS-010210-TAKמערבל Voltex; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/
ננו פוטומטר NP 80Implenלא הוצגכימות חומצות גרעין; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/
באריזה טבעית רחבהInomata chemical1859; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3%
83%A9%E3%83%AB%E3%83%91%
E3%83%83%E3%82%AF%E3%83%
AF%E3% 82%A4%E3%83%89
ערכת הכנה לספריית RNA של NEBNext Ultra II להכנת ספריית IlluminaNew England BioLabsE7770S;
https://www.nebj.jp/products/detail/2039FUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12מכתמים; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html
ParaformaldehydeFUJIFILM Wako Chemicals Co.קיבוע 160-16061; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html
פוליאוקסיאתילן (20) סורביטן מונולאורטFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html
אור שחור UV נייד (אורך גל 4W, 365 ננומטר)Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, יפןלא מוצגאוסף חרקים; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328
אשלגן כלוריFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html
אשלגן דימימן פוספטFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html
ProLong Diamond Antifade MountantInvitrogen, MA, ארה"בP36965antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965
Proteinase K SolutionMerck71049-4CNמיצוי DNA; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049
תמיסת משקעי חלבוןQiagen158912מיצוי DNA; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_
BIOCOMPARE_ProductListing_
0121_RD_MarketPlace_ProductC
Qubit V4InvitrogenQ33238כימות חומצות גרעין; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238
ריפמפיציןFUJIFILM Wako Chemicals Co., אוסקה, יפן4.98748E+12עיקור
ערכת כימות https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html RNA HSכימות חומצות גרעיןInvitrogenQ32855
תמיסת RNaseNippon Gene313-01461מיצוי RNA; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html
Silk Mate 2SNosan Co., Ltdלא הוצגהתזונה מלאכותית; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
נתרן כלוריFUJIFILM Wako כימיקלים ושות'4.98748E+12NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html
נתרן דודציל סולפטFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12מאגר ליזה של תאים (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html
תמיסה מימית של נתרן היפוכלוריטFUJIFILM Wako Chemicals Co., אוסקה, יפן4.98748E+12הפרדת ביצים; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html
טטרציקלין הידרוכלורידFUJIFILM Wako Chemicals Co., אוסקה, יפן4.98748E+12עיקור; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html
Tris-HClFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12מאגר ליזה של תאים; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html
מים מזוקקים טהורים במיוחדמיצוי10977023 RNA של Invitrogen
; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx;גידול חרקים ; ; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015

מקורות

  1. Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
  2. Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1(2002).
  3. Matsuura, H., Naito, A. Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan. Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).
  4. Mita, K., et al. The construction of an EST database for Bombyx mori and its application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).
  5. Kawamoto, M., et al. High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).
  6. Fukui, T., et al. In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).
  7. Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis. Entomological Science. 25 (1), 12497(2022).
  8. vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. Tortricid pests: their biology, natural enemies and control. , Elsevier Science Publishers. Amsterdam. (1991).
  9. Kiuchi, T., et al. A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).
  10. Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
  11. Kageyama, D., Traut, W. Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis. Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).
  12. Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima. Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).
  13. Schalamun, M., et al. Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora. Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).
  14. Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10 (1), 159(2010).
  15. Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments. Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).
  16. Saccheri, I., et al. Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation. Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).
  17. Crnokrak, P., Roff, D. A. Inbreeding depression in the wild. Heredity. 83 (3), 260-270 (1999).
  18. Keller, L. F., Waller, D. M. Inbreeding effects in wild populations. Trends in Ecology & Evolution. 17 (5), 230-241 (2002).
  19. Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).
  20. Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host. Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

קביעת מיןתזונה מלאכותיתצביעת lactic acetic orceinמיצוי DNAמיצוי RNAריצוף מהדור הבאצביעת עוברים
גידול המוני ומחקרים מולקולריים בחרקים מזיקים בטורטריים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.