הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ההשפעה של חומצה היאלורונית 35 kDa על מודל in vitro של פגיעה מוקדמת במעי הדק וריפוי באמצעות מונולרים שמקורם באנטרואיד

1.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63758

⸱

28 ביולי 2022

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה לביסוס וביצוע בדיקת פצע שריטה על מונולרים דו-ממדיים (דו-ממדיים) שמקורם באנטרוידים תלת-ממדיים (3D) שבודדו מאילאום של פרימטים שאינם בני אדם.

תקציר

מבחני פצעי שריטה במבחנה משמשים בדרך כלל כדי לחקור את המנגנונים והמאפיינים של ריפוי אפיתל במגוון סוגי רקמות. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת מונולאייר דו-ממדי (2D) מאנטרואידים תלת-ממדיים (3D) של פרימטים לא אנושיים שמקורם בקריפטות מעיים של האילאום הטרמינלי. מונולרים אלה, שמקורם באנטרואידים, נוצלו לאחר מכן בבדיקת פצעי שריטה במבחנה כדי לבחון את יכולתו של היאלורונן 35 kDa (HA35), חיקוי של HA מחלב אדם, לקדם נדידת תאים והתפשטותם לאורך קצה פצע האפיתל. לאחר שהמונו-שכבות גודלו למפגש, הן נשרטו ידנית וטופלו ב-HA35 (50 מיקרוגרם/מ"ל, 100 מיקרוגרם/מ"ל, 200 מיקרוגרם/מ"ל) או בבקרה (PBS). נדידת התאים והתפשטותם לתוך המרווח צולמו באמצעות מיקרוסקופ אור מועבר המצויד בהדמיית תאים חיים. סגירת פצעים כומתה כאחוז ריפוי פצעים באמצעות תוסף גודל ריפוי פצעים ב- ImageJ. אזור השריטה וקצב נדידת התאים ואחוז סגירת הפצע נמדדו במשך 24 שעות. HA35 in vitro מאיץ ריפוי פצעים במונולרים אנטרואידים במעי הדק, ככל הנראה באמצעות שילוב של התפשטות תאים בקצה הפצע ונדידה לאזור הפצע. שיטות אלה יכולות לשמש כמודל לחקר התחדשות המעיים במעי הדק האנושי הפג.

מבוא

דלקת מעי נמקית (NEC) היא אחד ממצבי החירום הנפוצים ביותר במערכת העיכול בפגים1. המחלה מאופיינת בדלקת מעיים קשה שיכולה להידרדר במהירות לנמק מעיים, אלח דם ועלול למוות. למרות שהאטיולוגיה אינה ברורה, הראיות מצביעות על כך ש-NEC הוא רב-גורמי ותוצאה של אינטראקציה מורכבת של האכלה, התיישבות חיידקים חריגה ואפיתל מעיים לא בשל 2,3. לפגים יש חדירות מעיים מוגברת, התיישבות חיידקית חריגה ויכולת התחדשות אנטרוציטים נמוכה4,5, מה שמגדיל את הסיכון שלהם לתפקוד לקוי של מחסום המעי, טרנסלוקציה חיידקית והתפתחות NEC. לכן, זיהוי אסטרטגיות או התערבויות כדי להאיץ את הבשלת אפיתל המעי ולקדם התחדשות או ריפוי של אפיתל המעי הוא קריטי במניעת מחלה קטלנית זו.

מחקרים הראו כי חלב אם (HM) מגן מפני NEC בפגים 6,7,8,9,10,11. מחקרים בבני אדם ובבעלי חיים הראו כי נוסחה המבוססת על בקר מגבירה את חדירות המעיים והיא רעילה ישירות לתאי אפיתל במעיים 2,12. למרות שלא הובהר במלואו, הראיות מצביעות על כך שההשפעות המגנות של HM מתווכות באמצעות רכיבים ביו-אקטיביים כגון לקטופרין, אימונוגלובולין A (IgA) ו-HM אוליגוסכרידים13. HM עשיר גם בהיאלורונן (HA), גליקוזאמינוגליקן לא-סולפטי ייחודי עם חומצה D-גלוקורונית חוזרת ו-N-אצטיל-D-גלוקוזאמין דיסכרידים14,15. חשוב לציין שהראינו כי 35 kDa HA (HA35) אוראלי, חיקוי של HM HA, מחליש את חומרת הפגיעה במעיים, מונע טרנסלוקציה חיידקית ומפחית את התמותה במודל 16,17 של פגיעה במעיים דמוי מורין NEC.

כאן, ההשפעות של HA35 על ריפוי מעיים והתחדשות במבחנה נחקרות עוד יותר. נכון לעכשיו, הבדיקה הנפוצה ביותר במבחנה לפציעה ותיקון מעיים היא בדיקת פצע שריטה המבוצעת במונולרים של תאי סרטן המעי הגס (CRC). הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודל כזה למעי הפגים מוגבלת, שכן תיקון פצעים של תאי CRC מסתמך במידה רבה על האופי המתפשט מאוד של תאים סרטניים ולא על תהליכי תיקון מונחי תאי גזע18. כדי להתגבר על מגבלה זו, מתוארת כאן הקמתו של מודל פצע שריטה אנטרואידי דו-ממדי, כולל הליך של בידוד ושמירה על אנטרואידים ראשוניים שמקורם בתאי גזע במעי הדק מפרימטים פגים שאינם אנושיים (NHP). בהינתן NEC מוקדם המדווח לרוב במעי הדק הדיסטלי, השימוש באורגנואידים ראשוניים של תאי אפיתל במודל של נזק ותיקון מעיים מספק מודל מבחנה הניתן לתרגום פיזיולוגי יותר בהשוואה למודלים קיימים המשתמשים במונו-שכבות המעי הגס מסורתיות18,19.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל נהלי בעלי החיים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה. לאחר אישור מוסדי, התקבלו דגימות נוחות עובריות של המעי הדק מפרימט לא אנושי פג (NHP, 90% הריון, בבון זיתים, Papio anubis) בעקבות המתת חסד למחקר נפרד (פרוטוקול #101523-16-039-I)20.

1. הקמת פגים שאינם פרימטים אנושיים אנטרואידים במעיים

  1. היערכות למדיה
    הערה: ניתן להכין מדיה עד שבוע לפני בידוד הקריפטה בהתאם לטכניקה אספטית סטנדרטית. ניתן להשתמש בפניצילין/סטרפטומיצין (ריכוז סופי 1%) במקום אנטיביוטיקה רחבת טווח לתאים ראשוניים במידת הצורך.
    1. הכן מדיה גידול אורגנואידית אנושית + Y-27632 (HOGMY) על ידי ערבוב 50 מ"ל של בינוני צמיחה אורגנואידית בינונית בסיסית אנושית עם 50 מ"ל של תוסף אורגנואידי (טבלת חומרים). הוסף 200 μL של אנטיביוטיקה רחבת טווח (ריכוז סופי 100 מיקרוגרם / מ"ל) (טבלת חומרים) ו- Y-27632 (לריכוז סופי של 10 μM). מחממים על הספסל לטמפרטורת החדר.
    2. הכן את מדיית הצמיחה האורגנואידית האנושית (HOGM) על ידי ערבוב 50 מ"ל של מדיום גידול אורגנואידי בינוני בסיסי אנושי עם 50 מ"ל של תוסף אורגנואידים. יש להוסיף 200 מיקרוגרם של אנטיביוטיקה רחבת טווח (100 מיקרוגרם/מ"ל). מחממים על הספסל לטמפרטורת החדר.
      הערה: HOGM ישמש בעת שינוי מדיה מעבר ל-2-3 הימים הראשונים שלאחר המעבר.
    3. יש לצנן 100 מ"ל של 1x תמיסת מלח (PBS) נטולת פוספטים ללא סידן או מגנזיום עד לקבלת תערובת קרה כקרח.
    4. הכינו 50 מ"ל של מאגר כביסה על ידי שילוב של PBS אחד ללא סידן או מגנזיום עם אלבומין (BSA) מסרום בקר (BSA) של 0.1%. מצננים אותו עד שהוא קר כקרח.
    5. הכינו את מאגר הכביסה של DMEM-F12 על ידי הוספת 1 מ"ל של אנטיביוטיקה רחבת טווח (100 מיקרוגרם/מ"ל) ל-500 מ"ל של DMEM/F12 (תערובת הבשר הבינוני/מזין של דולבקו F12 + חיץ HEPES של 15 mM). שמרו על קור כקרח.
  2. בידוד קריפטה וציפוי
    הערה: הידרוג'ל מבוסס מטריצה חוץ-תאית (ECM) חייב להישאר על הקרח במהלך כל ההליך. הליך זה מניח מספיק רקמות כדי לאכלס שש כיפות הידרוג'ל מבוססות ECM. אם נקצרת צפיפות שונה של קריפטות, יש לשנות את מספר הכיפה בהתאם.
    1. להפשיר 150 μL של גורם גדילה מופחת (GFR) תמצית קרום מרתף (BME) (פנול אדום חינם) לילה על הקרח ב 2-8 מעלות צלזיוס.
    2. לדגום צלחת פוליסטירן עם 24 בארות, תחתית שטוחה, שטופלה בתרבית רקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 30 דקות לפחות לפני השימוש.
    3. לאחר המתת חסד של NHP ואיסוף רקמות, שטפו את מקטע הפסולת של האילאום עם קצה פיפטה של 1,000 μL באמצעות PBS קר כקרח 1x בצלחת פטרי חד פעמית.
      הערה: יש לקטוף רקמות טריות במהירות ולשמור על קור כקרח כדי לקצור אנטרואידים בריאים.
    4. חותכים את האילאום לאורך כל המעי, ושוטפים עם PBS קר כקרח 3x. טחנו את הרקמה לשברים קטנים (באורך של כ-2 מ"מ) עם מספריים סטריליים מעל צינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל PBS קר כקרח של 15 מ"ל, החל מהחלק של המקטע האיליאלי הקרוב ביותר לצינור.
    5. השתמש פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל כדי לשבש את הקריפטות על ידי צנרת למעלה ולמטה 5-10x. תן למקטעי הרקמה להתיישב לתחתית הצינור, ולאחר מכן הסר את הסופרנטנט והחלף אותו ב- PBS טרי וקר כקרח. חזור על תהליך זה לפחות 7x-10x עד שהסופרנטנט יהיה נקי ונקי מפסולת.
    6. לאחר ההבהרה, הסר את הסופר-נאטנט ושלח מחדש את הקריפטות ב-25 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תאים. מניחים את הצינור על פלטפורמת נדנדה ב 20 סל"ד במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. הסר את הצינור מן הנדנדה, לאפשר לתאים להסתפק כ 30 s עד 1 דקה, ולהסיר את supernatant. יש להוסיף 10 מ"ל של מאגר שטיפה קר כקרח. פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה p1000 כדי להתנתק עוד יותר לקריפטות בודדות.
    8. סננו את הרקמה דרך מסננת תאים בקוטר 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מ"ל. שטפו את הצינור החרוטי המקורי בנפח 50 מ"ל עם 10 מ"ל של מאגר שטיפה קר כקרח וסנן דרך מסננת 70 מיקרומטר כדי לוודא שכל הקריפטות הוסרו מהצינור המקורי. חזרו על שטיפת הרקמות הזו למשך 4 שטיפות בסך הכל.
    9. צנטריפוגה את התסנין ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. הוסיפו 600 μL של HOGMY ושיבשו את הכדור על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עם פיפטה של 200 μL. מניחים את הצינור על קרח עד שהתמיסה הופכת קרה כקרח.
      הערה: אם התמיסה אינה קרה כקרח, הכיפה לא תשמור על המבנה התקין כאשר היא מצופה. הימנעו מהחדרת בועות בעת צנרת כיפות הידרוג'ל מבוססות ECM, שכן בועות ימנעו היצמדות נכונה לתחתית הצלחת.
    10. הוסיפו 600 μL של הידרוג'ל מבוסס ECM קר כקרח כדי להשעות את כדור התא ולערבב היטב עם פיפטה של 200 μL.
    11. הסר את צלחת 24 באר מן האינקובטור ומניחים אותו על צלחת 37 מעלות צלזיוס חם יותר. פיפטה 50 μL של תערובת הידרוג'ל מבוססת HOGMY/ECM קרה כקרח למרכז 24 בארות של צלחת תרבית 24 בארות (50 μL לכיפה).
    12. לאחר הציפוי, הניחו לכיפות לשבת על צלחת חמה יותר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת כדי לאפשר היצמדות לתחתית הצלחת. הפוך בזהירות את הצלחת, ודא שלא הצטבר עיבוי בתחתית הצלחת, והנח את הצלחת ההפוכה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2.
    13. לאחר 15 דקות, סובבו את הצלחת ימינה כלפי מעלה ופיפטה 750 μL של HOGMY בטמפרטורת החדר לכל באר.
      הערה: פיפטה מדיה באיטיות על דופן בארות, נזהר לא לשבש את כיפת הידרוג'ל מבוססת ECM 3D שנוצרה לאחרונה.
    14. לאחר שכל הבארות התמלאו במדיה, מניחים את הצלחת באינקובטור ומשנים את המדיה כל 3 ימים עם 750 מיקרון של HOGM. מעבר אנטרואידים כל 7-10 ימים.
  3. מעבר אנטרואיד במעיים
    הערה: הפרוטוקול הבא הוא עבור צלחת תרבית אחת בת 24 בארות המכילה אנטרואידים של NHP בקצב מפוצל של 1:2.
    1. הסר את המדיה האנטרואידית מכל באר, נזהר שלא לשבש את כיפת ה- ECM המכילה אנטרואידים, הוסף 500 μL של מגיב דיסוציאציה של תאים קרים כקרח לכל באר באמצעות פיפטה של 1,000 μL, ודגרה בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.
    2. לשבש את ה-ECM באופן ידני על-ידי צנרת למעלה ולמטה 8-12x. העבר את התוכן של 12 בארות לצינור חרוטי אחד של 15 מ"ל.
    3. לאחר שכל התמיסה נאספה מצלחת התרבית בת 24 הבארות, הוסף 250 μL של מגיב הפרעה לתאים לכל באר כדי להבטיח שכל האנטרוידים של NHP הוסרו מכל באר, והוסף את השטיפה האחרונה הזו לצינורות החרוטיים הקיימים של 15 מ"ל.
    4. מניחים על משטח נדנדה ב-40 סל"ד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (20°C). לחלופין, יש לנער ידנית את הצינורות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. לאחר 15 דקות, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant מן צינורות 15 מ"ל עד רק את הכדור נשאר.
    6. הוסיפו 8 מ"ל של DMEM קר כקרח + אנטיביוטיקה רחבת טווח לצינור חרוטי אחד של 15 מ"ל, וודאו שהגלולה משובשת מספיק. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant.
    7. הוסיפו 600 μL של HOGMY ושיבשו את הכדור על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עם פיפטה של 1,000 μL. מניחים את הצינור על קרח עד שהתמיסה הופכת קרה כקרח. ברגע שהתמיסה קרה כקרח, הוסיפו 600 μL של ECM קר כקרח כדי להשעות את כדור התא ולערבב היטב עם פיפטה של 1,000 μL. חזור על שלבים 1.3.2.-1.3.7. עבור 12 הבארות הנותרות.
      1. לקבלת השלבים הנותרים, עיין בשלבים 1.2.11.-1.2.16.

2. הקמת מונולאייר אנטרואיד ובדיקת פצע שריטה

  1. מדיה והכנה לטיפול
    1. יש לצנן 5 מ"ל של PBS ללא סידן או מגנזיום עד להצטננות כקרח.
    2. הכינו את מאגר הכביסה של DMEM-F12 על ידי הוספת 1 מ"ל של אנטיביוטיקה רחבת טווח (100 מיקרוגרם/מ"ל) ל-500 מ"ל של DMEM/F12 (תערובת הבשר הבינוני/מזין של דולבקו F12 + חיץ HEPES של 15 mM). שמור על קור כקרח.
    3. הכינו 100 מ"ל של HOGMY, כמתואר בשלב 1.1.1., וחממו אותו על הספסל לטמפרטורת החדר.
    4. חם 25 מ"ל של 0.25% טריפסין-אתילנדיאמינטטראצטי חומצה (EDTA) באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
    5. הכינו ריכוזים של 50 מיקרוגרם/מ"ל, 100 מיקרוגרם/מ"ל ו-200 מיקרוגרם/מ"ל של HA35 לטיפול בתאים, תוך שימוש ב-PBS סטרילי ללא סידן או מגנזיום כממס. הדילול הסופי של HA35 ישתמש ב- HOMGY כממס.
      הערה: תכשיר HA35 עשוי לדרוש מספר דילולים, שכן HA35 יוצא לעתים קרובות מתמיסה בריכוז גדול מ-5 מ"ג/מ"ל.
  2. היווצרות מונולאייר אנטרואידי
    הערה: ההליך הבא מספק אמצעי אחסון המספיקים ליצירת צלחת אחת של 24 בארות של מונולרים אנטרואידים. התאם את אמצעי האחסון למספר הרצוי של מונולאיירים.
    1. הפשרה של 96 μL של הידרוג'ל BME מבוסס ECM (פנול ללא אדום) למשך הלילה על קרח בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס. דילול הידרוג'ל מבוסס ECM ב-PBS קר כקרח ללא סידן או מגנזיום ביחס של 1:50. מצפים כל באר של צלחת תרבית רקמה בת 24 בארות עם 200 μL של הידרוג'ל מדולל קר כקרח על בסיס ECM.
    2. דגרו את הצלחת המצופה בהידרוג'ל על בסיס ECM למשך שעה אחת לפחות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. שאפו מדיה מצלחת התרבית בעלת 24 הבארות המכילה את האנטרוידים התלת-ממדיים המיועדים למונו-שכבות והחליפו אותה ב-500 μL של ריאגנט/באר דיסוציאציה של תאים.
    3. לשבש באופן ידני כיפות הידרוג'ל מבוססות ECM על ידי צינורות למעלה ולמטה 8x-12x ולהעביר את התוכן של 12 בארות לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
    4. לשטוף את 12 בארות ריקות עם 250 μL של מגיב דיסוציאציה התא כדי להבטיח את כל enteroids הוסרו ולהעביר את התוכן לצינור חרוטי 15 מ"ל. חזור על שלב 2.2.5. ושלב 2.2.6. עבור 12 הבארות הנותרות באמצעות צינור חרוטי שני של 15 מ"ל.
    5. צנטריפוגה של צינורות חרוטיים ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant. הוסף 10 מ"ל של חיץ כביסה DMEM-F12 קר כקרח לצינורות חרוטיים של 15 מ"ל והשעה את הכדוריות האנטרואידיות על ידי היפוך הצינורות. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    6. הסר את supernatant ו resuse את כדורי התא ב 12 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס טריפסין-EDTA. מניחים את הצינורות באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות או עד שהתאים נראים מסיסים. הוסיפו 3 מ"ל של מאגר כביסה DMEM-F12 לכל צינור כדי לדלל את טריפסין-EDTA, לערבב על ידי היפוך הצינורות ולהניח על קרח.
    7. סנן את האנטרואידים המנותקים דרך מסננת תאי רשת של 37 μM, ואסף את התוכן לצינורות חרוטיים נקיים של 15 מ"ל. צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    8. בזמן שהתאים מתגלגלים בצנטריפוגה, הסר את הצלחת המצופה בהידרוג'ל מבוססת ECM מהאינקובטור ושאף כל תמיסת הידרוג'ל עודפת מבוססת ECM מבלי לגרד את פני השטח המצופים או לתת לצלחת להתייבש לחלוטין.
    9. הסר את supernatant מן הצינורות החרוטיים לתלות מחדש את כדורי התא עם 6 מ"ל של HOMGY. הוסף 500 μL של תרחיף תאי HOMGY משולב של 12 מ"ל לכל באר של צלחת 24 באר המצופה בהידרוג'ל מבוסס ECM בצפיפות זריעה של בערך 3 x 105 תאים / באר. סובבו את הצלחת עם מכסה כדי להבטיח חלוקה שווה של תאים בתוך הבארות.
    10. דגירה על הצלחת ב 37 °C ו 5% CO2, החלפת מדיה HOMGY כל 2 ימים עד monolayers להגיע >90% מפגש.
  3. טיפול חד שכבתי ובדיקת פצע שריטה
    1. ברגע שהמונו-שכבות מגיעות למפגש של >90%, שאפו מדיה כדי להסיר תאים שלא מצליחים להתחבר. לטפל בתאים עם 500 μL של HA35 (50 מיקרוגרם / מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל, 200 מיקרוגרם / מ"ל) או PBS, מומס ב HOMGY, במשך 24 שעות.
    2. לאחר 24 שעות, להסיר את התקשורת, נזהר לא לשבש את פני השטח של monolayer. באמצעות קצה פיפטה של 200 μL, בצע שריטה ליניארית על פני קוטר המשטח המלא של המונולייר בכל באר, תוך זהירות שלא לתת למונוליירים להתייבש.
    3. לשטוף את monolayers שרוט 1x עם 500 μL של 1x PBS. הוסף 500 μL של HA35 (50 מיקרוגרם / מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל, 200 מיקרוגרם / מ"ל) או PBS מומס ב- HOMGY והעבר את הצלחת למכשיר ניתוח התא החי (טבלת החומרים) בתוך אינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו- 5% CO2 .
    4. תחת סמל לוח הזמנים בתוכנת ניתוח התאים החיים (טבלת חומרים), לחץ על סמל אשף ההשקה הוסף כלי שיט חדש והגדר את תדירות הסריקה לסריקה לפי לוח זמנים. צור כלי קידוח שלם חדש תחת סוג סריקה, ציין את הגדרות הסריקה (כלומר, שלב לערוצי תמונה ו- 4x למטרה) ולחץ על הבא.
    5. בחר את יצרן הצלחת ואת מספר הקטלוג מהרשימה שסופקה. תחת סמל לוח זמנים , בחר את סמל הפלוס שבו הצלחת תוצב בתוך מכשיר ניתוח התאים החיים. בחר את תבנית הסריקה הרצויה ולאחר מכן צור מפת לוחות על-ידי בחירה באפשרות "+" בדף 'פריסת לוח'. בחר דחה ניתוח למועד מאוחר יותר, ולאחר מכן הגדר את לוח הזמנים לסריקה עבור כל 4 שעות למשך 24 שעות ואמת את הגדרות הרכישה תחת הדף סיכום אשף כלי השיט . לבסוף, בחר הוסף לתזמון.
    6. לאחר השלמת הבדיקה 24, תחת סמל התצוגה, לחץ פעמיים על שם כלי השיט וייצא תמונות וסרטים. בחר בארות וסדרת תמונות להצגה ולייצוא כקובץ JPEG. נתח תמונות לקבלת אחוזי ריפוי פצעים באמצעות תוסף גודל ריפוי פצעים עבור ImageJ21, לפי שלב 2.4. מתחת.
  4. ניתוח פצע שריטה
    1. פתח את תוכנת ImageJ. העלה את תמונות בדיקת פצע השריטה (. TIFF או .JPG).
    2. בחרו ' תמונה > סוג' > 8 סיביות כדי לשנות את התמונה מ- RGB של 24 סיביות ל- 8 סיביות. התקן את תוסף גודל ריפוי הפצעים על-ידי בחירת תוספים > פקודות מאקרו > התקן > תוסף בגודל ריפוי פצעים.
    3. סובב את התמונה כך שהשריטה תהיה אנכית ואתחל את תוסף הכלי לריפוי פצעים.
    4. בחר את הפרמטרים של התוסף בתיבת הדו-שיח כדי להתאים בצורה הטובה ביותר לפצע השריטות. קבעו את ערך הפרמטרים לאפשרויות גודל ריפוי פצעים באופן הבא: רדיוס חלון שונות ב- 20, ערך סף ב- 100 ואחוז פיקסלים רוויים ב- 0.001, ובחרו 'כן' בתיבה 'קבע קנה מידה כללי'. סיים את הבחירה על ידי לחיצה על בסדר לחצן. בדוק אם האזור שנבחר הוא אזור הפצע. הפרמטרים הנ"ל עשויים לדרוש סטנדרטיזציה ממעבדה למעבדה.
    5. חזור על שלבים 2.4.2.-2.4.4. עבור נקודות הזמן הנותרות עבור כל שריטה.
    6. חשב את אחוז ריפוי הפצע באזור הגירוד של תאים נודדים או מתרבים במשך 24 שעות באופן הבא:
      % ריפוי פצעים = figure-protocol-1
      כאשר T 0 = % שטח בזמן 0 h ו- Tc = % שטח ב- 0 h, 4 h, 12 h, או 24 h.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ההשפעות של HA על תיקון רקמות וריפוי פצעים ברקמות ואיברים שונים מתועדות היטב; עם זאת, ההשפעות הספציפיות של HA עם משקל מולקולרי של 35 kDa על ריפוי והתחדשות מעי דק עוברי או ילודים אינם ידועים כיום. כדי לבחון את היכולת של HA35 לקדם ריפוי פצעים במודל של המעי הדק העוברי או היילודים, יצרנו אנטרואידים תלת-ממדיים מרקמת האיליאל של NHP וניתקנו את הרקמה הזו לתאים בודדים כדי ליצור מונו-שכבות דו-ממדיות שמקורן באנטרואידים (איור 1A,B). המונו-שכבות גודלו למפגש ונשרטו ידנית באמצעות קצה פיפטה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מערכת העיכול של פג נמצאת תחת לחץ רגנרטיבי מתמשך כתוצאה מחשיפה חוזרת ונשנית לעלבונות סביבתיים הקשורים לדיסביוזיס, מטבוליטים ורעלנים חיידקיים דלקתיים, והיפוקסיהלסירוגין 23,24. למרבה הצער, אפיתל המעיים של הפג אינו מסוגל לקבוע במהירות שלמות תפקודית23, וכתוצאה מכך תפקוד לקוי של המחסום, חדירות מעיים מוגברת, ובמקרים חמורים, דלקת מעיים משתוללת ופיתוח NEC.

גליקוזאמינוגליקנים (GAGs) הם קבוצה של פוליסכרידים הנפוצים בחלב אד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף ואין ניגודי עניינים.

תודות

תוכן זה הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. HC נתמך על ידי מענק P20GM134973 מהמכונים הלאומיים לבריאות. KB נתמך על ידי מענק של קרן בית החולים לילדים (CHF) וקרן הבריאות הפרסביטריאנית (PHF). שירותי הדמיה של תאים חיים שסופקו על ידי ליבת הגנומיקה הפונקציונלית של הסרטן נתמכו בחלקם על ידי מענק המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית P20GM103639 ומענק המכון הלאומי לסרטן P30CA225520 של המכונים הלאומיים לבריאות, שהוענק למרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, מרכז סטיבנסון לסרטן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10 מ"ל פיפט סרולוגיפישר סיינטיפיק13-675-49
100x21 מ"מ צלחת, Nunclon DeltaThermoFisher Scientific172931
15 מ"ל צינור חרוטיVWR89039-666
24 בארות, מטופל TC, צלחת תחתונה שטוחהקורנינג3524
37 ומיקרו; מסננת תאים הפיכה MSTEMCELL Technologies27215
צינור חרוטי 50 מ"לVWR89039-658
70 ומיקרו; m מסנני תאים סטרילייםפישר סיינטיפיקFB22-363-548
אלבומין, בקר (BSA)VWR0332-100G
CellTiter-Glo בדיקת כדאיות תאים תלת מימדייםPromegaG9681
תערובת חזיר בינוני/מזין של Dulbecco F-12 (DMEM-F12) עם 15 מ"מ מאגר HEPESSTEMCELL Technologies36254
תא עדין מגיב דיסוציאציהSTEMCELL Technologies100-0485
ImageJNIHimagej.nih.gov/ij/
Incucyte S3 מכשיר לניתוח תאים חייםSartorius4647
מודול תוכנה לניתוח פצעי שריטות IncucyteSartorius9600-0012
מדיום גידול אורגנואיד IntestiCult (אנושי)STEMCELL Technologies06010זה HOGMY, אבל בלי Y-27632 או אנטיביוטיקה. משמש גם כבסיס ל-HOGM, אבל אז חסרה רק האנטיביוטיקה.
ליפופוליסכרידים מ-Escherichia coli O111:B4, מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה של סינון ג'לMillipore SigmaL3012-10MG
מטריג'ל גורם גדילה מופחת (GFR) מטריצת ממברנת בסיס, פנול ללא אדום356231Nunc
MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Careated, Flat-Bottom MicroplateThermoFisher Scientific136101
PBS (מי מלח עם פוספט), 1X [-] סידן, מגנזיום, pH 7.4Corning21-040-CM
PrimocinInvivogenant-pm-1זוהי אנטיביוטיקה רחבת ספקטרום
נתרן היאלורונאט, דרגת מחקר, HA20KLifecore BiomedicalHA20K-1
TC20 חברת מונה תאים אוטומטית: Bio-Rad1450102
Trypsin-EDTA 1X, 0.25% טריפסיןפישר סיינטיפיקMT25053CI
Y-27632טכנולוגיות תאי גזע72302

מקורות

  1. Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1(2001).
  2. Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants. Nutrients. 13 (2), 550(2021).
  3. Duffy, L. C. Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine. The Journal of Nutrition. 130, 2S Suppl 432-436 (2000).
  4. Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776(2011).
  5. Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).
  6. He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation. Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).
  7. Walker, W. A., Iyengar, R. S. Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis. Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).
  8. Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants. British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).
  9. vanden Berg, A., et al. The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).
  10. Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).
  11. Maffei, D., Schanler, R. J. Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis. Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).
  12. Patel, A. L., Kim, J. H. Human milk and necrotizing enterocolitis. Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).
  13. Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis. Nutrients. 12 (1), 14(2019).
  14. Hill, D. R., et al. Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).
  15. Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review. Nutrients. 12 (2), 546(2020).
  16. Chaaban, H., et al. Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice. Nutrients. 13 (6), 2030(2021).
  17. Gunasekaran, A., et al. Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis. Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).
  18. Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
  19. Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013(2021).
  20. Gurung, S., et al. Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons. Journal of Virology. 94 (11), 00058(2020).
  21. Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).
  22. Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system. Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).
  23. de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229(2021).
  24. Yu, Y., et al. Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis. PLoS One. 8 (7), 69620(2013).
  25. Kessler, S. P., et al. Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).
  26. Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover. Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).
  27. Kim, Y., et al. Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo. Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).
  28. Prehm, P., Schumacher, U. Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters. Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).
  29. Stenson, W. F., Ciorba, M. A. Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection. Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510(2021).
  30. Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).
  31. Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).
  32. Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).
  33. Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).
  34. Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
  35. Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272(2020).
  36. Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).
  37. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
  38. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology. Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ImageJ
ההשפעה של חומצה היאלורונית 35 kDa על מודל in vitro של פגיעה מוקדמת במעי הדק וריפוי באמצעות מונולרים שמקורם באנטרואיד
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.