המחקר של ריפוי פצעים הקשורים לפגיעה בשרירים-שלד דורש לעתים קרובות הערכה של אינטראקציות במבחנה בין תאי שוואן (SCs), קרטינוציטים ופיברובלסטים. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד, התרבות והאפיון של תאים ראשוניים אלה מהעורלה האנושית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד, תרבית ואפיון של תאי שוואן ראשוניים, קרטינוציטים ופיברובלסטים מעורלה אנושית
במאמר זה
סיכום
תקציר
פרוטוקול זה מתאר שיטות בידוד, תנאי גידול ואפיון של תאים ראשוניים אנושיים בעלי תפוקה גבוהה וכדאיות באמצעות דיסוציאציה אנזימטית מהירה של העור. קרטינוציטים ראשוניים, פיברובלסטים ותאי שוואן נקטפים כולם מעורלת היילוד האנושית, הזמינה בהתאם להליכי הטיפול הסטנדרטיים. העור שהוסר מחוטא, והשומן והשרירים התת עוריים מוסרים באמצעות אזמל. השיטה מורכבת מהפרדה אנזימטית ומכנית של שכבות אפידרמיס ודרמליות, ואחריה עיכול אנזימטי נוסף לקבלת תרחיפים חד-תאיים מכל אחת משכבות העור הללו. לבסוף, תאים בודדים גדלים במדיה מתאימה של תרביות תאים בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים של תרביות תאים כדי לשמור על גדילה וכדאיות במשך שבועות. יחד, פרוטוקול פשוט זה מאפשר בידוד, התרבות ואפיון של כל שלושת סוגי התאים מפיסת עור אחת לצורך הערכה חוץ גופית של מודלים של עור-עצבים. בנוסף, ניתן להשתמש בתאים אלה יחד בתרביות משותפות כדי לאמוד את השפעתם זה על זה ואת תגובותיהם לטראומה במבחנה בצורה של שריטות המבוצעות באופן רובוטי בתרבית הקשורה לריפוי פצעים.
מבוא
תאים ראשוניים שמקורם ברקמות חיות ובתרבית בתנאי מבחנה דומים מאוד למצב הפיזיולוגי1, מה שהופך אותם למודל אידיאלי לחקר תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. העור מכיל סוגי תאים מרובים, כולל קרטינוציטים, פיברובלסטים, סבוציטים, מלנוציטים ותאי שוואן (SCs), אותם ניתן לבודד ולתרבת אותם לניסויים במבחנה . שיטות לבידוד ותרבית קרטינוציטים, פיברובלסטים ו-SCs, מפיסת עור אחת, לא תוארו. מטרתו של פרוטוקול זה היא כפולה: 1) לבסס שיטה אמינה וניתנת לשחזור לבידוד וגידול של מעגלים עוריים ו-2) להשתמש בשיטה יעילה וחזקה לבידוד של קרטינוציטים, פיברובלסטים ו-SCs מעורלה אנושית אחת.
כיום, ישנם פרוטוקולים מבוססים לבידוד קרטינוציטים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
רכישה ושימוש ברקמת עורלה אנושית לא מזוהה למטרות מחקר נבדקה וקיבלה את הקביעה של "מחקר לא אנושי" על ידי מועצת הביקורת המוסדית של המכללה לרפואה של פן סטייט (IRB #17574).
הערה: על ידי ביצוע הפרוטוקול שלהלן, 2.4 x 106 קרטינוציטים, 4.4 x 106 פיברובלסטים ו 1.1 x 106 SCs מתקבלים מעורלה אחת. באופן כללי, תאים ראשוניים אלה יכולים לשמש עבור 3 מעברים, בהתאם לתנאי הניסוי.
1. בידוד של תאים ראשוניים ותנאי תרבית
- הליך ההפרדה של אפידרמיס ודרמיס
- לרכוש עורלה יילודית בעקבות נהלי טיפול סטנדרטיים על ידי רופא תחת פרוטוקולים רגולטוריים מאושרים של בית החולים. הרופא קובע את....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עורלה יילודית תקינה שימשה לבידוד של קרטינוציטים אפידרמליים ראשוניים ו-SCs עוריים ופיברובלסטים. התאים הראשוניים המבודדים עברו תרבית במדיה המתאימה של תרביות תאים שהכילו גורמי גדילה. לאחר זריעה של SCs ופיברובלסט בצלוחיות תרבית, רוב התאים דבקו בתחתית הבקבוקון תוך 2 שעות. במקרה של קרטינוציטים, רוב הקרטינוציטים דבקו ב -24 שעות. קרטינוציטים ראשוניים אפידרמליים מבודדים הגיעו למפגש של 85% ביום ה-7 והפגינו מורפולוגיה אופיינית של התא (צורת אבן מרוצפת) (איור 1A). ה-SCs הגיעו למפגש של 95% ביום ה-5 ונראו .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד שלוש אוכלוסיות תאים נפרדות מחתיכה אחת של העורלה, כלומר קרטינוציטים, פיברובלסטים ותאי שוואן. ישנם מספר פרוטוקולי בידוד זמינים לבידוד קרטינוציטים ופיברובלסטים 2,3,5,6, אך אף אחד מהם אינו מתאר בידוד SC. מלבד התאים המבניים המרכזיים בעור, בקרטינוציטים ובפיברובלסטים, העור גם מופנם מאוד על ידי מבנים חושיים חושיים ופרפרנטים אוטונומיים. אפרנטים חושיים ממלאים תפקיד משמעותי בה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
כל המחברים האחרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
ברצוננו להודות לד"ר פאדיה כמאל ולד"ר ריאד אלברברי על שאפשרו לנו להשתמש במכשירי מעבדה ובתמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מה- NIH (K08 AR060164-01A) ו- DOD (W81XWH-16-1-0725) ל- J. C. E. בנוסף לתמיכה מוסדית מהמרכז הרפואי הרשי של אוניברסיטת פנסילבניה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.22 ומיקרו; מסננים סטריליים M (יחידת מסנן מזרק Millex-GP, פוליאתרסולפון) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 ומיקרו; מסנני תאים M | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 ומיקרו; מסנני תאים M | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 מ"ל מזרקים חד פעמיים | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 מ"ל מזרקים חד פעמיים (מזרק סטרילי, לשימוש חד פעמי) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 מ"ל מזרקים חד פעמיים | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | מוכן בזמן השימוש |
| 4% תמיסת פרפורמלדהיד | ThermoFisher Scientific | J19943. K2 | מוכן לשימוש ולאחסון בטמפרטורה של 4 מעלות; C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | מוכן בזמן השימוש |
| 70% אתנול | Pharmco | 111000200 | |
| אנטיביוטיקה | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| קולגנאז | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | ||
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM מדיום בסיסי | ScienCell Research | 9221 | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco ללא Ca2+ ו-Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן סטריליים חרוטיים | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן סטריליים חרוטיים | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 מ"ל צינורות מיקרו-צנטריפוגה | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| פיברובלסט מדיום שלם | ScienCell Research | 2331 | |
| עיזים נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני נספג מאוד, דילול Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | (1:500) |
| נוגדן משני נגד ארנב IgG (H+L) נספג צולב, דילול Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | (1:500) |
| תמיסת מלח חוצצת של הנקס (מאגר HBSS) | Lonza | CC-5022 | |
| עורלה | הסרת רקמת עורלה אנושית למטרות מחקר (מועצת ביקורת מוסדית- IRB #17574). | ||
| מדיום קרטינוציטים KGM-GOLD (KGM זהב ותוספי מזון) | נוגדן אקטין לונזה | 00192151 ו-00192152 | |
| עכבר אלפא שריר חלק | דילול ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | (1:200) |
| נוגדן Mouse Cytokeratin14 | Abcam | ab7800 | דילול (1:100) |
| נוגדן Mouse S100 | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | (1:200) |
| Multi Chambered (שקופית זכוכית 4 בארות) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-Fade Mountant עם DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 | דילול SAB4501656 (1:100) | ||
| דילול ארנב p75-NTR | Millipore | AB1554 | (1:500) |
| דילול וימנטין ארנב | ProteinTech | 10366-1-AP | (1:200) |
| מדיום תרבית תאים שוואן | ScienCell Research | 1701 | |
| פינצטה מדויקת DUMONT ישר עם קצוות עדינים במיוחד Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | עיקור עם 70% אלכוהול לפני השימוש |
| מספריים של איריס, חדים/חדים. אורך 4– 3/8 אינץ' (111 מ"מ) | Codman | 54-6500 | עיקור עם 70% אלכוהול לפני השימוש |
| להב כירורגי מעוקר - חד (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | חברת סכיני גילוח | 94-0120 | עיקור עם 70% אלכוהול לפני השימוש |
| בקבוק תרבית T25 | קורנינג | 353109 | |
| טריפסין (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| טריפסין/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| מיקרוסקופ הפוך | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – מיקרוסקופ Apotome.2 | לאימונופלואורסצנציה של שקופית תא המכילה תאים מוכתמים |
| מיקרוסקופ הפוך | ZEISS | Primovert | לצפייה / התבוננות בחיבור או ניתוק תאים |
מקורות
- Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
