Method Article

מערכי הידרוג'ל מאפשרים תפוקה מוגברת לסינון השפעות של רכיבי מטריצה וטיפולים במודלים תלת-ממדיים של גידולים

DOI:

10.3791/63791

⸱

June 16th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of California Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר פלטפורמה ניסיונית להערכת ההשפעות של רמזים מכניים וביוכימיים על תגובות כימותרפיות של תאי גליובלסטומה שמקורם בחולה בתרביות מטריצה-מימטיות תלת-ממדיות באמצעות התקן תאורת UV מותאם אישית המאפשר פוטו-קרוסלינקינג בתפוקה גבוהה של הידרוג'לים עם תכונות מכניות הניתנות לכוונון.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות בין מטריצת תאים מתווכות תהליכים פיזיולוגיים מורכבים באמצעות רמזים ביוכימיים, מכניים וגיאומטריים, ומשפיעות על שינויים פתולוגיים ותגובות טיפוליות. התחשבות בהשפעות מטריצה מוקדם יותר בצנרת פיתוח התרופות צפויה להגדיל את הסבירות להצלחה קלינית של טיפולים חדשניים. קיימות אסטרטגיות מבוססות-חומר ביולוגי המשחזרות מיקרו-סביבה של רקמות ספציפיות בתרבית תאים תלת-ממדית, אך שילובן עם שיטות התרבית הדו-ממדיות המשמשות בעיקר לבדיקת תרופות היה מאתגר. לפיכך, הפרוטוקול המוצג כאן מפרט את פיתוח השיטות לתרבית תלת-ממדית בתוך מטריצות חומריות ביולוגיות ממוזערות בפורמט של לוחות רב-בארים כדי להקל על אינטגרציה עם צינורות סינון תרופות קיימים ומבחנים קונבנציונליים לכדאיות התא. מכיוון שתכונות המטריצה הקריטיות לשימור פנוטיפים רלוונטיים מבחינה קלינית בתאים בתרבית צפויות להיות ספציפיות מאוד לרקמות ולמחלות, יהיה צורך בסינון קומבינטורי של פרמטרי מטריצה כדי לזהות תנאים מתאימים ליישומים ספציפיים. השיטות המתוארות כאן משתמשות בתבנית תרבית ממוזערת כדי להעריך את תגובות התאים הסרטניים לשונות אורתוגונלית של מכניקת המטריצות והצגת הליגנד. באופן ספציפי, מחקר זה מדגים את השימוש בפלטפורמה זו כדי לחקור את ההשפעות של פרמטרי מטריצה על התגובות של תאי גליובלסטומה (GBM) שמקורם בחולה לכימותרפיה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העלות הצפויה של פיתוח תרופה חדשה עלתה בהתמדה בעשור האחרון, עם יותר ממיליארד דולר בהערכות הנוכחיות1. חלק מהוצאה זו הוא שיעור הכשל הגבוה של תרופות הנכנסות לניסויים קליניים. כ-12% מהמועמדים לתרופות מקבלים בסופו של דבר את אישור מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) בשנת 2019. תרופות רבות נכשלות בשלב I עקב רעילות בלתי צפויה2, בעוד שאחרות שעוברות ניסויי בטיחות עלולות להיכשל בשל חוסר יעילות3. התשה זו עקב אי-יעילות יכולה להיות מוסברת בחלקה על ידי העובדה שמודלים סרטניים המשמשים במהלך פיתוח תרופות ידועים לשמצה בכך שאינם מנבאים את היעילות הקלינית4.

ניתן לייחס ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קווי תאי GBM שמקורם בחולה (GS122 ו- GS304) סופקו על ידי פרופסור דיוויד נתנזון (משתף הפעולה שלנו), שפיתח קווים אלה תחת פרוטוקול שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של UCLA (IRB# 10-000655). התאים סופקו ללא זיהוי כך שלא ניתן היה לקשר את קווי התאים בחזרה לחולים הבודדים.

1. הכנת תמיסת הידרוג'ל

  1. הכינו תמיסה עם חציצה של HEPES על ידי המסת אבקת HEPES ב-20 mM בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS). התאם את ה- pH ל- 7 לאחר פתרון מלא.
  2. בתמיסה עם חציצה של HEPES, ממיסים HA thiolated (משקל מולקולרי נומינלי של 700 kDa, ראו טבלת חומרים), שהוכנו בעקבות הדו"ח הקודם31, כך ש-6%-8% משאריות ה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדידות AFM אישרו שליטה מדויקת במכניקת ההידרוג'ל כפונקציה של קרינת UV (mW/cm2) במהלך הצלבת תמונות באמצעות מערך LED שנבנה בהתאמה אישית, הנשלט על ידי Arduino (איור 2A). את נוסחת ההידרוג'ל המשמשת בפרוטוקול זה ניתן למצוא בטבלה 2. הריווח של נוריות ה-LED בתבנית שסופקה תואם את הריווח עבור כל באר אחרת של צלחת בת 384 בארות, מה שמאפשר היווצרות של ג'לים בתוך הצלחת (איור 2B). חקירת AFM של אזורים בקנה מידה של מיקרון על פני השטח של הידרוג'לים בודדים.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה הנוכחית מציגה שיטות ליצירת תרביות תלת-ממדיות ממוזערות בתוך תרבויות מבוססות HA ובמקביל לשנות את נוקשות המטריצה והפפטידים הזמינים למעורבות באינטגרין. טכניקה זו מאפשרת מחקר שיטתי של האופן שבו פרמטרים של מטריצה משפיעים על פנוטיפים תאיים (למשל, הכדאיות של תאים סרטניים שנחשפו לכימותרפיה) עם תפוקה מוגברת. גישות קודמות, כולל זו המוצגת כאן, כיוונו את נוקשות ההידרוג'ל על ידי שינוי אחוז הפולימר הכולל בפורמולה הסופית, שבה הידרוג'לים נוקשים יותר הם בעלי תכולת פולימר גבוהה יותר21,31

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות באופן ספציפי לקרולין קים, אמליה לאו, ריאן סטוטמור ואיטאי סולומון על תרומתם לאיטרציות מוקדמות יותר של תוכנית הפוטוגלציה. קווי הסלולר GS122 ו-GS304 סופקו בנדיבות על ידי דייוויד נתנזון. כל הדמויות נוצרו עם BioRender.com. מתקני הליבה של UCLA, המשאבים המשותפים לסינון מולקולרי והמעבדה לאפיון ננו ופיקו סייעו לעבודה. צ'ן צ'יה-צ'ון נתמך על ידי מרכז ההכשרה לרפואה רגנרטיבית ותאי גזע באוניברסיטת UCLA. גריגור ורוז'אניאן נתמך על ידי תוכנית הכשרה לביולוגיה של תאי הגידול מענק NIH (T32 CA 009056).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
נגדי 1.1 kOhm, 6 WDigikey35601k1ft
1.7 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגהGenesse Scientific21-108
15 מ"ל צינור חרוטיפישר סיינטיפיק14-959-70C
365 ננומטר LEDDigikeyltpl-c034uvh365
384 צלחת בארBio Greiner One781090
40 µ מסננת תאיםm MTC bioC4040
4-זרועות תיול סיומת פוליאתלן גליקול (20 kDa)Laysan Bio4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTsנגדי Digikey2n5550ta
80 אוהם, 0.125 WDigikeyerjj-6enf80r6v
8-Armed norbornene סיים פוליאתילן גליקול (20 kDa)Jenkem TechnologyA7025-1
Accutaseטכנולוגיות תאים חדשניותAT104500  דיסוציאציה של תאים  מגיב
AFM בדיקותNovascan0.01 N/m קבוע קפיץ נומינלי, 2.5 ומיקרו; m SiO2 חלקיק
Arduino IDEArduino1.8.19
Arduino NanoMakerfireMini Nano V3.0 ATmega328P לוח
bFGFPeprotech100-18B20 ng/mL
CCK8Abcamab228554
צנטריפוגהThermoscientific sorvall legend xtr
CP100STGilsonF148415טיפים לפיפטה תזוזה חיובית
Cubis Semi-Micro BalanceSartoriusMSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50)Life Technologies113300571x
DMSOFisher ScientificBP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-) GenesseScientific25-508
EGFPeprotechAF100-1550 ננוגרם/מ"ל
אתנול,נטול מים פישר סיינטיפיקA405Pהוסף מי DI לדילול ל-70%
פישרברנד Class B בקבוקוני הברגה מזכוכית ענברפישר סיינטיפיק03-339-23C
פישרברנד נייר שקילהפישר סיינטיפיק09-898-12B
G21 תוסףג'מיני ביו400-16050x
תמיסת מלח מאוזנת HanksThermo Fisher Scientific14175095
HCl, ACS, 12MSigma AldrichS25838Aהוסף מי DI לדילול ל-1 M
מלח נתרן הפרין מרירית המעי של חזירSigma AldrichH3149-100Ku25 µ g/mL
HEPESSigma AldrichH7006-100G
אקדח אוויר חםWagnerHT1000
אינטגרין-קושר סיאלופרוטאין (IBSP) פפטידGenscriptהזמנה מותאמת אישיתGCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
ליתיום פניל-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95%Sigma Aldrich900889-1G
צלחת ערבוב מגנטיתתרמו מדעיSP194715
מיקרוצנטריפוגהתרמו מדעיSorvall אגדה מיקרו 21R
מיקרומן E פיפטור ערוץ יחידגילסוןFD10004תזוזה חיובית
פיפטה מיקרופיפטה טיפיםיצרניםגדלים שונים
מיקרופיפטה mLine Sartorious
N-אצטיל ציסטאיןSigma AldrichA7250-10G
Nanowizard 4BrukerAFM מיקרוסקופ
NaOHFisher Scientificss255-1הוסף מי DI לדילול ל -1 M
NormoicinInvivogenant-nr-1500x
Osteopontin PeptideGenscriptהזמנה מותאמת אישיתGCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
Pipet AidDrummond4000102
שקופיות מיקרוסקופ רגילותגלובוס סיינטיפיק1301
מבודד סיליקון לחץ לאיטום, קוטר 12-4.5 מ"מ x 2 מ"מ עמוקGrace Bio Labs664201-Aחתוך כך ש-8 תבניות בודדות עשויות מגיליון יחיד
עיבודעיבוד 3.5.4
Repeater M4Eppendorf4982000322
טיפיםלפיפטה משחזרSartorious300894301 מ"ל גדלים
RGD פפטידGenscriptGCGYGRGDSPG
Scoth Tape
פיפטות סרולוגיותGenesse Scientific12-102,12-1045,10 מ"ל פיפטות
משחת הלחמהDigikey315-NC191LT15T5-ND
חוט
ישר מלקחיים לניתוחVWR Scientific82027-408
קורא צלחות Synergy H1Biotek
T-75 בקבוק מטופל בתרבית תאיםGenesee Scientific25-209
TemozolomideSigma AldrichT2577משמש בדרך כלל מ-10 ומיקרו; M עד 100 ומיקרו; M
Tenascin-C פפטידGenscriptGCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR
GV חומצה היאלורונית עם תיול (700 kDa), 6-8% שונהLifecore BiomedicalHA700K5
VWR Spinbar, Flea MicroVWR58948-375
מיקרו-בקר שונים הלחמה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
  2. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hydrogel Arrays3D Tumor ModelsMatrix ComponentsDrug ScreeningCell Matrix InteractionsGlioblastoma CellsMiniaturized 3D CultureMatrix MechanicsCell Viability AssayPhoto Cross Linking

Related Articles