מיקרוסקופיית הרחבה לשמירת תוויות (LR-ExM) מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ועיצוב תוויות ביעילות גבוהה

מיקרוסקופיית הרחבה (ExM) שימשה חוקרים מאז שהוצגה לראשונה כגישה נוחה להשגת הדמיה ברזולוציה גבוהה עם מיקרוסקופים קונבנציונליים, כגון אפיפלואורסצנציה ומיקרוסקופים קונפוקליים 1,2,3,4,5,6,7 . באמצעות ExM, ניתן להשיג רזולוציה רוחבית של ~ 70 ננומטר גם עם מיקרוסקופים קונפוקליים רגילים. כאשר ExM משולב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה, הרזולוציה משופרת עוד יותר. לדוגמה, ניתן להשיג רזולוציה של כ-30 ננומטר באמצעות מיקרוסקופיית תאורה מובנית (SIM), ורזולוציה של כ-4 ננומטר באמצעות מיקרוסקופיית שחזור אופטית סטוכסטית (STORM)^1,5.

עם זאת, יעילות תיוג נמוכה היא בעיה קריטית בשיטות ExM סטנדרטיות. אובדן פלואורסצנטי יכול להשתנות בהתאם לסוג הקבוצות הפלואורסצנטיות וזמן העיכול. עם זאת, בממוצע, דווח כי יותר מ -50% מהפלואורופורים הולכים לאיבוד לאחר הפילמור ושלבי העיכול של החלבון של ExM, מה שפוגע באיכות ההדמיה ^3,4.

לפיכך, פותחה מיקרוסקופיה להרחבת שמירת תוויות (LR-ExM), שיכולה לשמור ביעילות על תוויות ולהפחית את אובדן האות¹. החידוש העיקרי של LR-ExM הוא השימוש בקבוצה של עוגנים תלת-תפקודיים במקום להשתמש רק בצבעים פלואורסצנטיים - כמו בנוהל ExM הסטנדרטי - להכתמת חלבונים מעניינים. המקשרים התלת-תכליתיים האלה מורכבים משלושה חלקים: (1) המחבר (למשל, N-הידרוקסיסוקינימיד (NHS)) כדי להתחבר לנוגדן, (2) העוגן (למשל, מתקרילאמיד (MA)) כדי לעגן חלבונים לפולימר, ו-(3) הכתב (למשל, ביוטין או דיגוקסיגנין (DIG)) כדי להצמיד לצבע אורגני. העוגנים התלת-תפקודיים שורדים את שלבי הפילמור ועיכול החלבונים, ולכן מונעים אובדן פלואורופור.

יתר על כן, שיטה זו טומנת בחובה פוטנציאל רב מכיוון שהיא תואמת לתיוג עצמי של תגים אנזימטיים כגון SNAP או CLIP. לגישות תג אנזימטיות יש כמה יתרונות על פני גישת החיסון לגבי ספציפיות גבוהה ויעילות תיוג ^8,9,10.

בכתב יד זה מודגם הליך מפורט של LR-ExM. LR-ExM היא שיטה יעילה וגמישה ביותר להשגת רזולוציה מרחבית גבוהה עם יעילות תיוג משופרת.

1. תרבית תאים

1. השתמש בתאי U2OS בתרבית במדיום 5A של McCoy בתוספת 10% FBS ב-37 °C ב-5% CO₂.
2. תאי תרבית על גבי 16 כיסויים תאיים נשלפים היטב (שטח תרבית 0.4 ס"מ²) לטיפול קל.

2. קיבעון וחדירה

הערה: תנאי הקיבוע והחדירה תלויים בפרוטוקולים הממוטבים של מערכת החיסון. להלן פרוטוקול קיבוע וחדירה למיקרוטובול קו-אימונוסטין ולבורות מצופים קלתרין (CCPs).

1. ברגע שספירת התאים מגיעה ל-~0.04 x 10 6, תקן תאים עם 100 μL של 3.2% פרפורמלדהיד (PFA) במאגר PEM (100 mM PIPES, 1 mM EGTA ו-1 mM MgCl₂, pH^6.9) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (טבלה 1).
   הערה: קיבוע באמצעות PFA מתבצע במכסה בטיחות מאושר.
2. יש לשטוף תאים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 200 μL של מי מלח עם אגירת פוספט (PBS).
3. חלחלו לתאים עם חיץ חלחול של 100 μL בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות (טבלה 1).
   הערה: המשך בהתוויה בהקדם האפשרי כדי למנוע פגיעה בחלבון המטרה, ברנ"א או בדנ"א, וכדי להשיג תוצאה מיטבית. עם זאת, אם יש צורך בכך, ניתן לאחסן דגימות קבועות לזמן ממושך (עד חודש) במאגר PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. החלף כל PBS שהתאדה והגן על הדגימה מפני הלבנת תמונות.

3. סטרפטאבידין אנדוגני וחסימת ביוטין

1. דגירה של תאים עם תמיסת סטרפטאבידין מדוללת במאגר חוסם תאים (100 μL) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (טבלה 1).
2. יש לשטוף לזמן קצר עם 200 μL של מאגר חוסם תאים.
3. דגירה של תאים עם 100 μL של תמיסת ביוטין מדוללת במאגר חוסם תאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: בעת שימוש בגישת תיוג עצמי, כגון שימוש בתגיות SNAP או CLIP, דלג על שלב 4 והמשך לשלב 5.1: גישת תיוג עצמי.

4. מכתים נוגדנים ראשוניים

1. דגירה של תאים עם נוגדן נגד α-טובולין של חולדות (דילול של 1:500) ונוגדן נגד קלתרין של שרשרת כבדה (דילול של 1:100) ב-100 μL של חיץ חסימת תאים למשך 16 שעות ב-4 מעלות צלזיוס או שעה אחת בטמפרטורת החדר. הכפילו את זמן הדגירה של דגימות הרקמה.
2. יש לשטוף דגימות ארבע פעמים עם 200 μL של PBS למשך 5 דקות כל אחת.

5. מכתים נוגדנים משניים ספציפיים ל-LR-ExM

1. הצמידו נוגדני IgG עם המקשרים התלת-תפקודיים כגון N-הידרוקסיסוקינימיד (NHS) - מתקרילאמיד (MA) -ביוטין או NHS-MA-דיגוקסיגנין (Dig) (איור 1B). סינתזה של עוגנים תלת-תפקודיים והצמדה של הנוגדנים המשניים הוצגו בעבר ב- Shi et ^al.1. גישת תיוג עצמי: הצמדת נוגדני IgG עם המקשרים התלת-תפקודיים, כגון MA- בנזילגואנין (BG)-ביוטין או MA- בנזילציטוזין (BC)-Dig (איור 1B). סינתזה של עוגנים תלת-תפקודיים והצמדה של הנוגדנים המשניים הוצגו בעבר ב- Shi et ^al.1.
2. דגירה של תאים עם החמור נגד ארנב-Dig-MA (דילול 1:100) ונוגדנים משניים נגד חולדה-ביוטין-MA (1:100 דילול) ב-100 μL של חיץ חסימת תאים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הכפילו את זמן הדגירה הזה עבור דגימות הרקמה.
3. יש לשטוף דגימות ארבע פעמים ב-200 μL של PBS למשך 5 דקות כל אחת.

6. עיגון נוסף

1. דגירה של תאים עם 0.25% גלוטראלדהיד (GA) ב-PBS (100 μL) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר על מנת לעגן את החלבונים על ההידרוג'ל. לחלופין, יש להשתמש בחומצה מתקרילית N-הידרוקסיסוקיצינימיד אסטר (MA-NHS) של 25 מ"מ לעיגון. מומלץ לדגור של שעה בטמפרטורת החדר.
2. לשטוף דגימות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות כל אחד.

7. ג'לציה

הערה: מהירות ההתפשטות נקבעת על ידי זמן הדיפוזיה של מלח ומים החוצה או לתוך הג'ל; לפיכך, יציקת ג'לים דקים מאיצה את זמן ההתפשטות.

1. הסר את המבנה העליון של צלחת ג'ל 16 באר. הוסף 40 μL של תמיסת מונומר לכל באר כדי לרכך תאים על קרח. דגירה על קרח במשך 5 דקות.
   1. כדי להכין פתרון מונומר, ראה טבלה 2.
2. הכינו את תמיסת הג'לציה על קרח. הוסף מים מזוקקים כפולים ומאיץ N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) לתמיסת המונומר (10% TEMED: תמיסת מונומר = 1:47); אל תוסיף עדיין את היוזם (טבלה 3).
3. עבור תא תרבית תאים עם שטח של 0.4 ס"מ², השתמש בנפח תמיסת ג'לציה של כ- 40 μL. הכן 45 μL של תמיסת ג'לציה עבור כל באר.
4. הוסיפו 10% אמוניום פרסולפט (APS) לתמיסת הג'לציה, דגירה על קרח, ומיד פיפטה 40 μL של תמיסת ג'לציה לתוך כל אטם סיליקון על קרח. דגירה על קרח במשך 3 דקות (10% APS:10% TEMED:פתרון מונומר = 1:1:47).
5. הגנו על הדגימה מפני אור והזיזו את הכיסוי בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי לג'לציה. כדי לשמור על הלחות של הג'ל במהלך הדגירה 37 מעלות צלזיוס, לכסות את צלחת פטרי עם המכסה, ולשים כמה טיפות מים בצלחת פטרי.

8. עיכול

1. לאחר הג'לציה, הסר את הזכוכית כדי להפריד את הג'ל והעבר את הג'ל לצלחת 6 באר. לעכל תאים משובצים עם 2 מ"ל של חיץ עיכול (טבלה 1) בלילה בטמפרטורת החדר או 4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. יש להשתמש בנפח עודף של לפחות פי 10 ממאגר העיכול.
2. יש לשטוף ג'לים עם נפח מים עודף של פי 10 לפחות מנפח הג'ל הסופי. חזרו על שלב הכביסה ארבע פעמים למשך 20 עד 30 דקות בכל פעם. הג'ל מתרחב בערך פי שניים בכל ממד.
   הערה: ניתן לאחסן דגימות ג'ל למשך עד חודש אחד במאגר PBS בטמפרטורה של 4 °C. החלף את כל המים שהתאדו כדי למנוע ייבוש, והגן על הדגימה מפני אור במהלך האחסון. כדי למנוע השפלה של עוגנים תלת-תפקודיים, יש להכתים דגימות בהקדם האפשרי לאחר העיכול והשטיפה.

9. צביעה פלואורסצנטית לאחר העיכול

1. דגירה של ג'לים בנפח של 2 מ"ל של סטרפטווידין (STV)/דיגוקסיגנין (DIG) עם 2 עד 5 מיקרומטר STV-צבע ו/או צבע נגד DIG למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. שמור את הדוגמאות בחושך.

10. הרחבה

1. יש לשטוף ולהרחיב את הג'ל ארבע פעמים עם עודף מים (2-3 מ"ל) למשך 30 דקות עד שעה בכל פעם.
2. להדמיה קלה יותר של תאים תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הכתימו תאים עם DAPI במהלך השטיפה השלישית מתוך חמש. דילול ריכוז מלאי DAPI (5 מ"ג/מ"ל, מאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס) ב-1:5,000 דילולים במי שטיפה. דגירה של הג'ל עם תמיסת מים DAPI (2 מ"ל) למשך 30 דקות עד שעה.
3. לשטוף פעמיים נוספות עם 3 מ"ל של מים.
4. הרחיבו את הג'לים בכל מנה שטוחה שגדולה מספיק כדי להכיל את הדגימות. הג'לים המורחבים אשר מוכנים על 0.4^ס" מ 2 שטח כיסוי זכוכית משתלבים יפה בתחתית זכוכית 6 - צלחת היטב.
   הערה: ניתן לאחסן דגימות מוכתמות לאחר הרחבה למשך עד 4 חודשים במאגר PBS בטמפרטורה של 4° C. יש להוסיף כמות מספקת של מים כדי למנוע התייבשות ולהגן על הדגימה מפני הלבנת תמונות. חזור על שלב ההרחבה וצביעת DAPI לפני ההדמיה. כדי למנוע כל סיכון של השפלה פלואורופור, דגימות צריך להיות בתמונה בהקדם האפשרי.

11. הדמיה

1. מצפים את תא ההדמיה התחתון מזכוכית 6 בארות עם 0.01% פולי-L-ליזין (3 מ"ל כל אחד) כדי לשתק את דגימות הג'ל.
2. מעבירים דגימות ג'ל לתא ההדמיה המצופה.
3. צלמו את הדגימות עם טווחי הפלואורסצנציה הרצויים.

בורות מצופים קלתרין (CCPs) עוברים תהליך חיסוני באמצעות עוגנים תלת-תפקודיים (איור 1B) ו-LR-ExM מבוצע כמתואר באיור 1A. LR-ExM (איור 2C,E) מראה עוצמה פלואורסצנטית גבוהה בהרבה בהשוואה למיקרוסקופיית הרחבת שימור חלבונים (proExM, איור 2A) או ביוטין-ExM (איור 2B); האות עבור LR-ExM היה גבוה בערך פי שישה מ-proExM (איור 2D). LR-ExM יכול ללכוד ביעילות מבנים קטנים כמו CCPs, שהם אפילו קטנים יותר ממגבלת הדיפרקציה (איור 2F,G).

כמה תוצאות מייצגות של LR-ExM מוצגות לראווה באמצעות גישת החיסון. מיקרוטובולים ו-CCPs עוברים תהליך חיסוני משותף באמצעות עוגנים תלת-תפקודיים, כולל NHS-MA-DIG ו-NHS-MA-ביוטין (איור 3A,B). LR-ExM זמין עבור הגישה האנזימטית המבוססת על תגים. התוצאה מודגמת באמצעות עוגנים תלת-תפקודיים BG-MA-ביוטין (עבור תג SNAP) ו-BC-MA-DIG (עבור CLIP-tag) באיור 3C-F. יתר על כן, ניתן לשלב הן את הגישה החיסונית והן את גישת תג החלבון ב-LR-ExM כפי שמוצג באיור 3G-J. מתוצאות אלה, הוא אישר כי LR-ExM מועיל כדי לקבל תמונות באיכות גבוהה עם יעילות תיוג משופרת ורזולוציה.

LR-ExM מראה ביצועים מעולים גם בדגימות רקמות. LR-ExM מבוצע על רקמת המוח של העכבר על ידי שיתוף אימונוסטרינג של הסמן הקדם-סינפטי בסון והסמן הפוסט-סינפטי הומר1. שתי התוויות ברורות ומופרדות היטב, התומכות ברזולוציה גבוהה וביעילות תיוג (איור 4A-E).

איור 1: זרימת עבודה של מיקרוסקופיית הרחבת תוויות (LR-ExM). (A) זרימת עבודה של LR-ExM. (B) סכמות של עוגנים תלת-תפקודיים. נתון זה שונה מ-Shi et al.1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: כימות של שימור אותות (A-C) מיקרוסקופיית התפשטות (ExM) תמונות קונפוקליות של בורות מצופים קלתרין (CCPs) בתאי U2OS שעברו בעקיפין כתמי חיסון עבור שרשרת כבדה של קלתרין (POI). (A) שימור חלבונים ExM (ProExM) באמצעות נוגדנים משניים מצומדים AF488. (B) ExM עם תיוג לאחר ההרחבה באמצעות נוגדנים מצומדים לביוטין. (C) LR-ExM באמצעות נוגדנים המצומדים לעוגנים תלת-תפקודיים של NHS-MA-ביוטין. דגימות ב- B ו- C מוכתמות לאחר ההרחבה ב- streptavidin-AF488. (D) כימות העוצמה של A-C. קווי שגיאה מייצגים SD. n = 3 עבור כל מקרה. יחסי האורך של תמונות ב-A, B, C ו-E-G הם 4.3, 4.5, 4.6 ו-4.3, בהתאמה. יחס הרחבת האורך עבור הדגימות המשמשות בחלקה D הוא 4.5 ± 0.2. פסי קנה מידה, 500 ננומטר (A-C ו-E) ו-100 ננומטר (F ו-G). כל סרגלי קנה המידה נמצאים ביחידות טרום-הרחבה. ארב. ארה"ב, יחידות שרירותיות; STV, סטרפטאווידין. כל התמונות מתקבלות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בעל דיסק מסתובב (Nikon CSU-W1) עם מטרת טבילה במים פי 60 (NA1.27). נתון זה שונה מ-Shi et al.1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: תוצאות מייצגות של LR-ExM באמצעות מיקרוסקופים קונפוקליים. (A,B) תמונות קונפוקליות LR-ExM של מיקרוטובולים המסומנים בנוגדנים משניים מצומדים ל-NHS-MA-ביוטין (מגנטה) ו-CCPs המסומנים בנוגדנים משניים מצומדים NHS-MA-DIG (ירוק) בתא U2OS. (ב) תצוגה מוגדלת. (ג-ו) תמונות קונפוקליות של LR-ExM של CCPs ו/או מיטוכונדריה בתאי HeLa המסומנות באמצעות גישת תג חלבון (C) קלתרין עם תווית תג SNAP, (D) CLIP עם תווית תג TOMM20, ו-(E) הדמיה בשני צבעים. (ו) תצוגה מוגדלת. (G) תמונות LR-ExM קונפוקליות בשני צבעים באמצעות שילוב של גישת אימונוסטינינג (NPC, אדום חם) וגישת תג חלבון (מיזוג אוויר לאמין (ציאן)). (ח) תצוגה מוגדלת. (א,י) תצוגות של ערוצים בודדים של H. שימו לב שהרקע הציטופלסמי ב-G נגרם על-ידי הנוגדן anti-NUP153. יחסי הרחבת האורך של תמונות ב-A-B: 4.7, C-D: 4.4, E-F: 4.5 ו-G-J הם 4.5. סרגלי קנה מידה, 1 מיקרומטר עבור A, 200 ננומטר עבור B ו- F, 500 ננומטר עבור C-E, 2 מיקרומטר עבור G ו- 500 ננומטר עבור H, I ו- J. כל סרגלי קנה המידה נמצאים ביחידות טרום-הרחבה. כל התמונות מתקבלות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בעל דיסק מסתובב (Nikon CSU-W1) עם מטרת טבילה במים פי 60 (NA1.27). נתון זה שונה מ-Shi et al.1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: תוצאות מייצגות של LR-ExM על דגימות רקמות. (A) תמונה קונפוקלית LR-ExM של פרוסת מוח עכבר בעקיפין עבור הסמן הקדם-סינפטי בסון (מג'נטה) והסמן הפוסט-סינפטי הומר1 (ירוק). (ב,ג) תמונות מוגדלות של סינפסות. (ד,ה) פרופילי עוצמה רוחביים לאורך הצירים הארוכים של הקופסה הצהובה. בסון מסומן בנוגדנים משניים מצומדים NHS-MA-DIG, והומר1 מסומן בנוגדנים משניים מצומדים של NHS-MA-ביוטין. כל הדגימות מוכתמות לאחר ההרחבה בסטרפטבינדין-AF488 ו-או אנטי-דיגוקסין-AF594. יחסי האורך של תמונות ב-A-C הם 4.2. פסי קנה מידה, 1 מיקרומטר (A) ו- 200 ננומטר (B,C). כל סרגלי קנה המידה נמצאים ביחידות טרום-הרחבה. כל התמונות מתקבלות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בעל דיסק מסתובב (Nikon CSU-W1) עם מטרת טבילה במים פי 60 (NA1.27). נתון זה שונה מ-Shi et al.1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: כימיקלים ומאגרים אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: פתרון מונומר אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: פתרון ג'לציה אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.