מאמר שיטה

מיקרוסקופיית הרחבה לשמירת תוויות (LR-ExM) מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ועיצוב תוויות ביעילות גבוהה

3.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63793

⸱

11 באוקטובר 2022

 ,  , 
1Center for Complex Biological Systems, University of California Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California Irvine, 3Department of Chemistry, University of California Irvine

במאמר זה

סיכום

הודגם פרוטוקול של מיקרוסקופיה להרחבת שמירת תוויות (LR-ExM). LR-ExM משתמשת במערך חדשני של עוגנים תלת-תכליתיים, המספקים יעילות תיוג טובה יותר בהשוואה למיקרוסקופיות הרחבה שהוצגו בעבר.

תקציר

מיקרוסקופיית הרחבה (ExM) היא טכניקת הכנת דגימות שניתן לשלב עם רוב שיטות המיקרוסקופיה הקלה כדי להגדיל את הרזולוציה. לאחר הטמעת תאים או רקמות בהידרוג'ל מתנפח, ניתן להרחיב פיזית דגימות פי שלושה עד שש עשרה (ממד ליניארי) בהשוואה לגודל המקורי. לכן, הרזולוציה האפקטיבית של כל מיקרוסקופ גדלה על ידי גורם ההרחבה. מגבלה מרכזית של ExM שהוצגה בעבר היא פלואורסצנטיות מופחתת לאחר פילמור והליך העיכול. כדי להתגבר על מגבלה זו, פותחה מיקרוסקופיית הרחבה לשמירת תוויות (LR-ExM), המונעת אובדן אותות ומשפרת מאוד את יעילות הסימון באמצעות קבוצה של עוגנים תלת-תכליתיים חדשניים. טכניקה זו מאפשרת להשיג רזולוציה גבוהה יותר בעת חקירת מבנים תאיים או תת-תאיים בקנה מידה ננומטרי עם אובדן אות פלואורסצנטי מינימלי. ניתן להשתמש ב- LR-ExM לא רק לתיוג אימונופלואורסצנטי, אלא גם עם תגי חלבון עם תיוג עצמי, כגון תגי SNAP ו- CLIP, ובכך להשיג יעילות תיוג גבוהה יותר. עבודה זו מציגה את הפרוצדורה ופתרון הבעיות עבור גישה מבוססת חיסון זו, כמו גם דיון בגישות תיוג עצמי של LR-ExM כחלופה.

מבוא

מיקרוסקופיית הרחבה (ExM) שימשה חוקרים מאז שהוצגה לראשונה כגישה נוחה להשגת הדמיה ברזולוציה גבוהה עם מיקרוסקופים קונבנציונליים, כגון אפיפלואורסצנציה ומיקרוסקופים קונפוקליים 1,2,3,4,5,6,7 . באמצעות ExM, ניתן להשיג רזולוציה רוחבית של ~ 70 ננומטר גם עם מיקרוסקופים קונפוקליים רגילים. כאשר ExM משולב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה, הרזולוציה משופרת עוד יותר. לדוגמה, ניתן להשיג רזולוציה של כ-30 ננומטר באמצעות מיקרוסקופיית תאורה מובנית (SIM), ורזולוציה של כ-4 ננומטר באמצעות מיקרוסקופיית שחזור אופטית סטוכסטית (STORM)1,5.

עם זאת, יעילות תיוג נמוכה היא בעיה קריטית בשיטות ExM סטנדרטיות. אובדן פלואורסצנטי יכול להשתנות בהתאם לסוג הקבוצות הפלואורסצנטיות וזמן העיכול. עם זאת, בממוצע, דווח כי יותר מ -50% מהפלואורופורים הולכים לאיבוד לאחר הפילמור ושלבי העיכול של החלבון של ExM, מה שפוגע באיכות ההדמיה 3,4.

לפיכך, פותחה מיקרוסקופיה להרחבת שמירת תוויות (LR-ExM), שיכולה לשמור ביעילות על תוויות ולהפחית את אובדן האות1. החידוש העיקרי של LR-ExM הוא השימוש בקבוצה של עוגנים תלת-תפקודיים במקום להשתמש רק בצבעים פלואורסצנטיים - כמו בנוהל ExM הסטנדרטי - להכתמת חלבונים מעניינים. המקשרים התלת-תכליתיים האלה מורכבים משלושה חלקים: (1) המחבר (למשל, N-הידרוקסיסוקינימיד (NHS)) כדי להתחבר לנוגדן, (2) העוגן (למשל, מתקרילאמיד (MA)) כדי לעגן חלבונים לפולימר, ו-(3) הכתב (למשל, ביוטין או דיגוקסיגנין (DIG)) כדי להצמיד לצבע אורגני. העוגנים התלת-תפקודיים שורדים את שלבי הפילמור ועיכול החלבונים, ולכן מונעים אובדן פלואורופור.

יתר על כן, שיטה זו טומנת בחובה פוטנציאל רב מכיוון שהיא תואמת לתיוג עצמי של תגים אנזימטיים כגון SNAP או CLIP. לגישות תג אנזימטיות יש כמה יתרונות על פני גישת החיסון לגבי ספציפיות גבוהה ויעילות תיוג 8,9,10.

בכתב יד זה מודגם הליך מפורט של LR-ExM. LR-ExM היא שיטה יעילה וגמישה ביותר להשגת רזולוציה מרחבית גבוהה עם יעילות תיוג משופרת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבית תאים

  1. השתמש בתאי U2OS בתרבית במדיום 5A של McCoy בתוספת 10% FBS ב-37 °C ב-5% CO2.
  2. תאי תרבית על גבי 16 כיסויים תאיים נשלפים היטב (שטח תרבית 0.4 ס"מ2) לטיפול קל.

2. קיבעון וחדירה

הערה: תנאי הקיבוע והחדירה תלויים בפרוטוקולים הממוטבים של מערכת החיסון. להלן פרוטוקול קיבוע וחדירה למיקרוטובול קו-אימונוסטין ולבורות מצופים קלתרין (CCPs).

  1. ברגע שספירת התאים מגיעה ל-~0.04 x 10 6, תקן תאים עם 100 μL של 3.2% פרפורמלדהיד (PFA) במאגר PEM (100 mM PIPES, 1 mM EGTA ו-1 mM MgCl2, pH6.9) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (טבלה 1).
    הערה: קיבוע באמצעות PFA מתבצע במכסה בטיחות מאושר.
  2. יש לשטוף תאים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 200 μL של מי מלח עם אגירת פוספט (PBS).
  3. חלחלו לתאים עם חיץ חלחול של 100 μL בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות (טבלה 1).
    הערה: המשך בהתוויה בהקדם האפשרי כדי למנוע פגיעה בחלבון המטרה, ברנ"א או בדנ"א, וכדי להשיג תוצאה מיטבית. עם זאת, אם יש צורך בכך, ניתן לאחסן דגימות קבועות לזמן ממושך (עד חודש) במאגר PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. החלף כל PBS שהתאדה והגן על הדגימה מפני הלבנת תמונות.

3. סטרפטאבידין אנדוגני וחסימת ביוטין

  1. דגירה של תאים עם תמיסת סטרפטאבידין מדוללת במאגר חוסם תאים (100 μL) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (טבלה 1).
  2. יש לשטוף לזמן קצר עם 200 μL של מאגר חוסם תאים.
  3. דגירה של תאים עם 100 μL של תמיסת ביוטין מדוללת במאגר חוסם תאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: בעת שימוש בגישת תיוג עצמי, כגון שימוש בתגיות SNAP או CLIP, דלג על שלב 4 והמשך לשלב 5.1: גישת תיוג עצמי.

4. מכתים נוגדנים ראשוניים

  1. דגירה של תאים עם נוגדן נגד α-טובולין של חולדות (דילול של 1:500) ונוגדן נגד קלתרין של שרשרת כבדה (דילול של 1:100) ב-100 μL של חיץ חסימת תאים למשך 16 שעות ב-4 מעלות צלזיוס או שעה אחת בטמפרטורת החדר. הכפילו את זמן הדגירה של דגימות הרקמה.
  2. יש לשטוף דגימות ארבע פעמים עם 200 μL של PBS למשך 5 דקות כל אחת.

5. מכתים נוגדנים משניים ספציפיים ל-LR-ExM

  1. הצמידו נוגדני IgG עם המקשרים התלת-תפקודיים כגון N-הידרוקסיסוקינימיד (NHS) - מתקרילאמיד (MA) -ביוטין או NHS-MA-דיגוקסיגנין (Dig) (איור 1B). סינתזה של עוגנים תלת-תפקודיים והצמדה של הנוגדנים המשניים הוצגו בעבר ב- Shi et al.1. גישת תיוג עצמי: הצמדת נוגדני IgG עם המקשרים התלת-תפקודיים, כגון MA- בנזילגואנין (BG)-ביוטין או MA- בנזילציטוזין (BC)-Dig (איור 1B). סינתזה של עוגנים תלת-תפקודיים והצמדה של הנוגדנים המשניים הוצגו בעבר ב- Shi et al.1.
  2. דגירה של תאים עם החמור נגד ארנב-Dig-MA (דילול 1:100) ונוגדנים משניים נגד חולדה-ביוטין-MA (1:100 דילול) ב-100 μL של חיץ חסימת תאים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הכפילו את זמן הדגירה הזה עבור דגימות הרקמה.
  3. יש לשטוף דגימות ארבע פעמים ב-200 μL של PBS למשך 5 דקות כל אחת.

6. עיגון נוסף

  1. דגירה של תאים עם 0.25% גלוטראלדהיד (GA) ב-PBS (100 μL) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר על מנת לעגן את החלבונים על ההידרוג'ל. לחלופין, יש להשתמש בחומצה מתקרילית N-הידרוקסיסוקיצינימיד אסטר (MA-NHS) של 25 מ"מ לעיגון. מומלץ לדגור של שעה בטמפרטורת החדר.
  2. לשטוף דגימות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות כל אחד.

7. ג'לציה

הערה: מהירות ההתפשטות נקבעת על ידי זמן הדיפוזיה של מלח ומים החוצה או לתוך הג'ל; לפיכך, יציקת ג'לים דקים מאיצה את זמן ההתפשטות.

  1. הסר את המבנה העליון של צלחת ג'ל 16 באר. הוסף 40 μL של תמיסת מונומר לכל באר כדי לרכך תאים על קרח. דגירה על קרח במשך 5 דקות.
    1. כדי להכין פתרון מונומר, ראה טבלה 2.
  2. הכינו את תמיסת הג'לציה על קרח. הוסף מים מזוקקים כפולים ומאיץ N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) לתמיסת המונומר (10% TEMED: תמיסת מונומר = 1:47); אל תוסיף עדיין את היוזם (טבלה 3).
  3. עבור תא תרבית תאים עם שטח של 0.4 ס"מ2, השתמש בנפח תמיסת ג'לציה של כ- 40 μL. הכן 45 μL של תמיסת ג'לציה עבור כל באר.
  4. הוסיפו 10% אמוניום פרסולפט (APS) לתמיסת הג'לציה, דגירה על קרח, ומיד פיפטה 40 μL של תמיסת ג'לציה לתוך כל אטם סיליקון על קרח. דגירה על קרח במשך 3 דקות (10% APS:10% TEMED:פתרון מונומר = 1:1:47).
  5. הגנו על הדגימה מפני אור והזיזו את הכיסוי בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי לג'לציה. כדי לשמור על הלחות של הג'ל במהלך הדגירה 37 מעלות צלזיוס, לכסות את צלחת פטרי עם המכסה, ולשים כמה טיפות מים בצלחת פטרי.

8. עיכול

  1. לאחר הג'לציה, הסר את הזכוכית כדי להפריד את הג'ל והעבר את הג'ל לצלחת 6 באר. לעכל תאים משובצים עם 2 מ"ל של חיץ עיכול (טבלה 1) בלילה בטמפרטורת החדר או 4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. יש להשתמש בנפח עודף של לפחות פי 10 ממאגר העיכול.
  2. יש לשטוף ג'לים עם נפח מים עודף של פי 10 לפחות מנפח הג'ל הסופי. חזרו על שלב הכביסה ארבע פעמים למשך 20 עד 30 דקות בכל פעם. הג'ל מתרחב בערך פי שניים בכל ממד.
    הערה: ניתן לאחסן דגימות ג'ל למשך עד חודש אחד במאגר PBS בטמפרטורה של 4 °C. החלף את כל המים שהתאדו כדי למנוע ייבוש, והגן על הדגימה מפני אור במהלך האחסון. כדי למנוע השפלה של עוגנים תלת-תפקודיים, יש להכתים דגימות בהקדם האפשרי לאחר העיכול והשטיפה.

9. צביעה פלואורסצנטית לאחר העיכול

  1. דגירה של ג'לים בנפח של 2 מ"ל של סטרפטווידין (STV)/דיגוקסיגנין (DIG) עם 2 עד 5 מיקרומטר STV-צבע ו/או צבע נגד DIG למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. שמור את הדוגמאות בחושך.

10. הרחבה

  1. יש לשטוף ולהרחיב את הג'ל ארבע פעמים עם עודף מים (2-3 מ"ל) למשך 30 דקות עד שעה בכל פעם.
  2. להדמיה קלה יותר של תאים תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הכתימו תאים עם DAPI במהלך השטיפה השלישית מתוך חמש. דילול ריכוז מלאי DAPI (5 מ"ג/מ"ל, מאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס) ב-1:5,000 דילולים במי שטיפה. דגירה של הג'ל עם תמיסת מים DAPI (2 מ"ל) למשך 30 דקות עד שעה.
  3. לשטוף פעמיים נוספות עם 3 מ"ל של מים.
  4. הרחיבו את הג'לים בכל מנה שטוחה שגדולה מספיק כדי להכיל את הדגימות. הג'לים המורחבים אשר מוכנים על 0.4ס" מ 2 שטח כיסוי זכוכית משתלבים יפה בתחתית זכוכית 6 - צלחת היטב.
    הערה: ניתן לאחסן דגימות מוכתמות לאחר הרחבה למשך עד 4 חודשים במאגר PBS בטמפרטורה של 4° C. יש להוסיף כמות מספקת של מים כדי למנוע התייבשות ולהגן על הדגימה מפני הלבנת תמונות. חזור על שלב ההרחבה וצביעת DAPI לפני ההדמיה. כדי למנוע כל סיכון של השפלה פלואורופור, דגימות צריך להיות בתמונה בהקדם האפשרי.

11. הדמיה

  1. מצפים את תא ההדמיה התחתון מזכוכית 6 בארות עם 0.01% פולי-L-ליזין (3 מ"ל כל אחד) כדי לשתק את דגימות הג'ל.
  2. מעבירים דגימות ג'ל לתא ההדמיה המצופה.
  3. צלמו את הדגימות עם טווחי הפלואורסצנציה הרצויים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בורות מצופים קלתרין (CCPs) עוברים תהליך חיסוני באמצעות עוגנים תלת-תפקודיים (איור 1B) ו-LR-ExM מבוצע כמתואר באיור 1A. LR-ExM (איור 2C,E) מראה עוצמה פלואורסצנטית גבוהה בהרבה בהשוואה למיקרוסקופיית הרחבת שימור חלבונים (proExM, איור 2A) או ביוטין-ExM (איור 2B); האות עבור LR-ExM היה גבוה בערך פי שישה מ-proExM (איור 2D). LR-ExM יכול ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

החידוש העיקרי של LR-ExM הוא להשתמש בעוגנים תלת-תכליתיים כדי לתייג ביעילות את חלבוני המטרה ולשפר את איכות התמונה. שיטה זו מוגבלת על ידי עוגנים תלת-תפקודיים, שאינם זמינים כל כך לחוקרים. עם זאת, ניתן לשתף עוגנים תלת-שימושיים עם חוקרים אחרים על פי בקשה, ומוצרים דומים כגון בדיקות ExM של Chrometa זמינים כעת גם באופן מסחרי.

בפרוטוקול זה בוצעה דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר עבור שלבי צביעת הנוגדנים הראשוניים והמשניים. עם זאת, צעדים אלה יכולים להיעשות לחלופין לילה ב 4 מעלות צלזיוס, והוא ציין כי מכתים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות של ארה"ב (R00 GM126136 עד X.S.), הקרן הלאומית למדע של ארה"ב (DMS1763272 ל- S.P.) וקרן סימונס (594598 ל- S.P.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אקרילאמיד סיגמא A9099 ג'ל ExM
AffiniPure Donkey אנטי-ארנב IgGJackson ImmunoResearchH+L, 711– 005-152נוגדן
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgGJackson ImmunoResearchH+L, 712– 005-153נוגדן
Alexa Fluor 488-StreptavidinJackson ImmunoResearch016-540-084בדיקות פלואורסצנטיות 
Alexa Fluor 594 StreptavidinJackson ImmunoResearch016-580-084בדיקות פלואורסצנטיות 
Alexa Fluor 647 StreptavidinJackson ImmunoResearch016-600-084בדיקות פלואורסצנטיות 
אמוניום פרסולפט סיגמא A3678 ג'ל ExM
אנטי-H3K4me3Abcamab8580נוגדן
נגד H3K9me3Abcamab176916נוגדן
DAPI dilacetateThermofisher ScientificD3571בדיקות פלואורסצנטיות 
DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)Vector LaboratoriesDI-7488בדיקות פלואורסצנטיות 
DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)Vector LaboratoriesDI-7594בדיקות פלואורסצנטיות 
EGTAEMD Millipore Corp.324626-25GMמאגר קיבוע
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית סיגמא מאגרעיכול
גלוטרלדהיד 10% EMכיתה מיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי 50-262-13עיגון
גרייס ביו-מעבדות תרבית היטב כיסוי תא נשלףגרייס ביו-מעבדות GBL112358-8EAתא תרבית תאים
Grace Bio-Labs CultureWell כלי להסרתGrace Bio-Labs כלילהסרת
GBL103259 גואנידין הידרוכלוריד סיגמא G3272 מאגר עיכול
מגנזיום כלורידSigmaM8266-1KGמאגר קיבוע
McCoy's 5aATCC30– 2007תרבית סל מדיום
חומצה מתאקרילית N-hydroxysuccinimide ester,98%  (MA-NHS)סיגמא 730300-1Gעיגון
עכבר חד שבטי אנטי-Nup153 נוגדןAbcamab24700נוגדן
N,N ′ מתילן-ביסקרילאמיד סיגמא M7279 ג'ל ExM
N,N,N′,N′ טטרמתילאתילאנדיאמין  (טמד)סיגמא T7024 ג'ל ExM
16% פרפורמלדהיד תמיסות מימיותמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית50-980-487מאגר קיבוע
צינורותSigmaP6757-25Gמאגר קיבוע
פולי-L-ליזיןסיגמאP8920-100MLציפוי תא
פרוטאינאז K Sigma-AldrichP4850-5MLמאגר עיכול
ארנב נגד קלתרין נוגדן שרשרת כבדהAbcamab21679נוגדן
נגד חולדות– &נוגדן אלפא;-טובולין, טירוזין, שיבוט YL1/2Millipore SigmaMAB1864-Iנוגדן
נתרן אקרילט Sigma408220ExM ג'ל
סטרפטווידין / ערכת חסימת ביוטיןVector LaboratoriesSP-2002מאגר חסימה
Tris-HCl טכנולוגיות חיים AM9855 מאגר עיכול
U2OSATCCHTB-96קו תאים
6 באר לוחות תחתונים מזכוכיתCellvisP06-1.5H-Nצלחת הדמיה
EDTA

מקורות

  1. Shi, X., et al. Label-retention expansion microscopy. The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067(2021).
  2. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  3. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  4. Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
  5. Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
  6. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  7. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  8. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  9. Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
  10. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  11. Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (19), 45836(2018).
  12. Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775(2021).
  13. M'Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים