מאמר שיטה

הדמיה של התפתחות צלקות באמצעות בדיקת SCAD - בדיקה של צלקות עור לשעבר-situ

DOI:

10.3791/63808

⸱

28 באפריל 2022

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Regenerative Biology and Medicine, Helmholtz Zentrum München, 2School of Medicine, Klinikum Rechts der Isar, Department of Plastic and Hand Surgery, Technical University of Munich

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את הדור של אקספלנט עור-פאשיה המכונה "SCar כמו רקמה בצלחת" או SCAD. מודל זה מאפשר הדמיה חסרת תקדים של פיברובלסטים בודדים במהלך היווצרות צלקות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התגובה הגלובלית של היונקים לאיטום פצעי רקמות עמוקים היא באמצעות היווצרות צלקות והתכווצות רקמות, המתווכת על ידי פיברובלסטים מיוחדים של החיתולית. למרות המשמעות הקלינית של היווצרות צלקות וריפוי פצעים לקוי, הבנתנו את הדינמיקה הפיברובלסטית של החיתולית בריפוי פצעים היא מעורפלת בשל היעדר מבחנים רלוונטיים המאפשרים הדמיה ישירה של כוריאוגרפיה פיברובלסטית ודינמיקה בסביבות מורכבות כגון פצעים בעור. מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת צלקות עור לשעבר באמצעות SCAD או "רקמה דמוית SCar בצלחת A Dish" המחקה את הסביבה המורכבת של פצעי עור. במבחן זה, עור 2 מ"מ בעובי מלא נכרת ומתורבת הפוך במדיה במשך 5 ימים, שבמהלכם צלקות והתכווצויות עור מתפתחות באופן אחיד. מתודולוגיה זו, יחד עם מודלים של עכברים מהונדסים ספציפיים לשושלת פיברובלסטים, מאפשרת הדמיה של שושלות פיברובלסט בודדות לאורך כל תהליך תיקון הפצע. באופן כללי, פרוטוקול זה מסייע לחוקרים להבין תהליכים ומנגנונים בסיסיים של תיקון פצעים, תוך בחינה ישירה של ההשפעות של מודולטורים על תוצאות ריפוי פצעים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ריפוי פצעים הוא תהליך של שחזור פצעים שנפרצו. פגיעות ברקמות אצל חסרי חוליות גורמות להתחדשות חלקית או מלאה. לעומת זאת, יונקים מגיבים לפציעה עמוקה על ידי הצטלקות, תהליך המותאם לאטום פצעים במהירות עם תקעים צפופים של סיבי מטריצה הממזערים את האזור הפרוע ובמקביל מעוותים לצמיתות את האתר הפגוע 1,2,3. כוויות עור גדולות או פצעים פתוחים עמוקים ביונקים גורמים לפנוטיפים פתולוגיים כגון צלקות היפרטרופיות או קלואידיות 4,5. צלקות נשגבות אלה גורמות לעומס עצום על מערכות הבריאות הקליניות והעולמיות. בארה"ב לבדה, ניהול צלקות עולה כ-10 מיליארד דולר בשנה 6,7. לכן, פיתוח מתודולוגיות רלוונטיות נדרש כדי להבין טוב יותר את התהליכים והמנגנונים המממנים המעורבים ביצירת צלקות.

בשנים האחרונות, מגוון רחב של מחקרים בעכברים גילו אוכלוסיות פיברובלסטים הטרוגניות עם עוצמות תפקודיות מובהקות בהתבסס על מקורותיהם במקומות מסוימים בעור 8,9,10. בעור האחורי, Rinkevich et al., 2015, זיהו כי אוכלוסייה פיברובלסטית ספציפית עם ביטוי עוברי מוקדם של Engrailed-1 (En1), המכונה EPF (פיברובלסט חיובי חרוט) תורמת להצטלקות עורית עם פציעה. לעומת זאת, שושלת פיברובלסטית אחרת ללא היסטוריה של ביטוי חרוט, פיברובלסט שלילי חרוט (ENF), אינה תורמת להיווצרותצלקת 8. מיפוי גורל של שושלות En1 אלה באמצעות קווי עכברים מהונדסים מונעי Cre שנחצה לקווי עכברים פלואורסצנטיים כגון R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) מאפשר הדמיה של אוכלוסיות EPF ו- ENF.

חקר נדידת פיברובלסטים in vivo במשך מספר ימים מוגבל על ידי אילוצים אתיים וטכניים. יתר על כן, מסכי ספריית נוגדנים מורכבים, נגיפיים ומנטרלים כדי לווסת מסלולים המעורבים בהצטלקות הם מאתגרים מבחינה טכנית. בעבר נעשה שימוש במודלים של in vitro או ex vivo חסרים את היכולת לדמיין נדידת פיברובלסטים ויצירת צלקות במיקרו-סביבה אמיתית של העור, אחידות בהתפתחות צלקות, כמו גם מורכבות רקמות המחקה סביבות עור in vivo 11,12. כדי להתגבר על המגבלות הנ"ל, פיתחנו מבחן צלקות ex vivo המכונה SCAD (רקמה דמוית SCar בצלחת A)13,14. בדיקה פשוטה זו יכולה להתבצע על ידי כריתת עור בעובי מלא של 2 מ"מ המכיל את האפידרמיס, הדרמיס ואזורי החיתולית התת עוריים ושילובם במדיית DMSO בתוספת סרום למשך עד 5 ימים. צלקות המופקות מ-SCAD משכפלות באופן מהימן סימני היכר תעתיקיים ופרוטאומיים של צלקות in vivo. בנוסף, SCADs שנוצרו מקווי עכברים מהונדסים רלוונטיים (למשל, עכברי En1) שהוצלבו עם קווי עכברים פלואורסצנטיים מאפשרים הדמיה של דינמיקת נדידת פיברובלסטים והתפתחות צלקות ברזולוציה חסרת תקדים. יתר על כן, מודל זה יכול להיות מותאם בקלות לכל יישומי תפוקה גבוהה (למשל, ספריית תרכובות, ספריית נוגדנים או סינון ויראלי)13,14. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול ממוטב ליצירת SCADs ויישומי עיבוד במורד הזרם הבאים כדי לחקור את הדינמיקה התאית והמטריקסית בפיתוח צלקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המודל המוצג להלן מספק תיאור מפורט שלב אחר שלב של יצירת מבחן SCAD כמתואר בקצרה ב- Jiang et al., 202013. תכשירי דגימת SCAD בוצעו לאחר הקרבת בעלי החיים בהתאם להנחיות הבינלאומיות וממשלת בוואריה עילית. בעלי חיים שוכנו במתקן החיות של מרכז הלמהולץ במינכן. החדרים נשמרו עם לחות אופטימלית וטמפרטורה קבועה עם מחזור אור של 12 שעות. בעלי החיים סופקו עם מזון ומים ad libitum.

1. הכנת רקמת SCAD

  1. להקריב גורים שזה עתה נולדו ביום 0 או ביום 1 (P0 או P1).
  2. יש לבלום בזהירות לפחות 1.5 ס"מ על 1.5 ס"מ של עור גב גב בעובי מלא עד לשכבת שריר השלד באמצעות אזמל כירורגי סטרילי.
  3. מקלפים את העור באמצעות מלקחיים מעוקלים סטריליים, ומבטיחים כי החיתולית השטחית שלמה עם שריר panniculus carnosus הבסיסי.
  4. שטפו את הרקמה שנכרתה ב-50-100 מ"ל של מדיית DMEM/F-12 קרה כדי להסיר דם מזהם.
  5. יש לשטוף פעם אחת עם תמיסת המלח המאוזנת (HBSS) של הנקס כדי לשמור על כדאיות הרקמות והתאים.
  6. מניחים את העור הפוך (חיתולית שטחית למעלה) בצלחת פטרי 10 ס"מ המכילה מדיית DMEM/F12.
  7. באמצעות אגרוף ביופסיה חד פעמי של 2 מ"מ, הוציאו את הבלו על פיסות עור עגולות בעובי מלא, מה שמבטיח כי החיתולית השטחית תהיה שלמה עם שרירי panniculus carnosus הבסיסיים עד האפידרמיס ליצירת רקמות SCAD.
  8. הכן ומלא 200 μL של DMEM / F12 (ללא פנול אדום) מדיה מלאה - DMEM / F12 מדיה בתוספת 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM חומצות אמינו לא חיוניות, ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין לתוך בארות בודדות של צלחת 96 בארות.
  9. באמצעות מלקחיים סטריליים, מעבירים בזהירות ומטביעים באופן מלא רקמת SCAD בודדת במהופך (החיתולית פונה כלפי מעלה) לבארות של צלחת בת 96 בארות.
  10. העבר את הצלחת לחממה של תרבית תאים המתוחזקת בתנאים סטנדרטיים (37 °C , 21%(v/v) חמצן, 5% (v/v) C02 ו-95% לחות).

2. SCAD - תרבית רקמה

  1. תרבות SCADs בחממה עד 5 ימים.
  2. ביום 2 וביום 4 של התרבית, החליפו את המדיה ב-200 מיקרול של מדיה מלאה טרייה של DMEM/F12 שחוממה מראש כדי להבטיח את המשך הכדאיות של התאים והרקמות. החלף תרכובות טיפול במהלך כל שינוי במדיה.
    הערה: הקפד להשאיר 10 μL של מדיה בבאר כדי למנוע רקמות להידבק לבארות.
  3. הכינו SCADs לניסויים הבאים: הדמיה חיה (סעיף 3), וקצירת רקמות וצביעת אימונופלואורסצנציה דו-ממדית/תלת-ממדית (סעיף 4).

3. הדמיה חיה של SCADs

  1. הכינו מינימום של 30 מ"ל של 2%-3% (w/v) תמיסת אגרוז נמסה נמוכה ב-PBS בבקבוק זכוכית על ידי חימום במיקרוגל עד להרתחה.
  2. מעבירים מיד את הבקבוק ומקררים את תמיסת האגרוס הנוזלי באמבט מים של 40 מעלות צלזיוס.
  3. העבירו את רקמת ה-SCAD עם החיתולית/צלקת הפונה כלפי מעלה אל מרכז המנה בקוטר 35 מ"מ.
  4. הטמיעו את ה-SCAD בטמפרטורת החדר (RT) על ידי העברה איטית של אגרוז נוזלי בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס על המנה בקוטר 35 מ"מ באמצעות פיפטה של פסטר. אגרוז מתפלמר תוך 2 דקות.
  5. הוסף 2 מ"ל של מדיה מלאה של DMEM/F12 שחוממה מראש (ללא מחוון אדום פנול).
  6. רכוש תמונות בהילוך מהיר של יום 0 SCADs עד 48 שעות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או רב-פוטון המצויד במערכת דגירה מתאימה המוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס, 21% (v/v) חמצן, 5% (v/v) C02 ו-95% לחות.

4. קצירת רקמות וצביעת אימונופלואורסצנציה דו-ממדית/תלת-ממדית

  1. לשטוף את הרקמות בנקודות זמן רלוונטיות על ידי החלפת המדיה עם PBS סטרילי.
  2. באמצעות מלקחיים סטריליים, מעבירים בזהירות SCADs בודדים לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכילים 500 μL של 2% paraformaldehyde כדי לתקן את הרקמות במהלך הלילה ב 4 °C (74 °F).
  3. שטפו את הרקמות שלוש פעמים עם PBS והמשיכו עם צביעה אימונופלואורסצנטית דו-ממדית/תלת-ממדית.
  4. צביעה אימונופלואורסצנטית תלת-ממדית
    1. חלחלו לרקמות על ידי דגירה בצינור מיקרוצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל המכיל 500 μL של PBS בתוספת 0.2% ג'לטין, 0.5% Triton-X100 ו-0.01% תימרוסל (PBSGT) ב-RT למשך 24 שעות.
    2. להכין כמות נאותה של נוגדנים ראשוניים בהתאם להוראות היצרן ולדגום רקמות SCAD ב 150 μL של תמיסת PBSGT במשך 24 שעות ב RT.
      הערה: אם ריכוז הנוגדנים האופטימלי לפלואורסצנציה חיסונית אינו מדווח על ידי היצרן, יש לבצע טיטרציה קודמת של נוגדנים על רקמות בקרה באמצעות ריכוזים משתנים (למשל, 1:50, 1:200, 1:500, 1:500, 1:1000).
    3. שטפו בעדינות את ה-SCADs שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את הנוגדן הראשוני הלא מאוגד.
    4. דגירה רקמה עם 1:1000 נוגדנים משניים רלוונטיים של Alexa Fluor ב- PBS לילה ב- RT.
    5. לשטוף בעדינות את הרקמה במשך 30 דקות ב- PBS שלוש פעמים כדי להסיר עודף נוגדנים משניים לא מאוגדים.
    6. מעבירים את הרקמה לצלחת תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ להדמיה קונפוקלית או מולטי-פוטון.
      הערה: בעת שימוש במטרות טבילה במים, הטמיעו את ה-SCADs באגרוז של נקודת התכה נמוכה ב-2% כדי לשתק את הרקמה כדי למנוע היסחפות במהלך רכישת התמונה
  5. צביעה דו-ממדית של אימונופלואורסצנציה
    1. מעבירים את הרקמה לתבנית קריו וממלאים בעדינות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) כדי לטבול לחלוטין את הרקמה.
    2. כוונון בעדינות את כיוון הרקמה, מה שמבטיח היעדר בועות אוויר כדי להשיג חתך רוחב או חתך אנכי.
    3. הניחו את התבנית על קרח יבש למשך 20-30 דקות ודגרו את הבלוק בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    4. הגדר את טמפרטורת הלהב ל -25 °C (75 °F) ואת טמפרטורת בלוק הדגימה ל -17 °C (74 °F). הכינו מקטע קריו של 6 מיקרומטר באמצעות cryostat, העבירו את החלקים לשקופית הידבקות ואחסנו את השקופיות במקפיא של -20 מעלות צלזיוס.
    5. יש לשטוף את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS ולדגום את השקופיות ב-5% אלבומין בסרום בקר (BSA) w/v ב-PBST (PBS בתוספת 0.05% Tween) למשך שעה אחת.
    6. מוסיפים כמות מתאימה של נוגדן ראשוני ל-150μl PGST, ודוגרים למשך הלילה ב-4 °C (4 °F)
      הערה: אם היצרן לא מדווח על כך שהיצרן מדווח על ריכוז הנוגדנים האופטימלי לפלואורסצנציה חיסונית, יש לבצע טיטרציה קודמת של נוגדנים במקטעי בקרה באמצעות ריכוזים משתנים (למשל, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).
    7. שטפו בעדינות את החלקים שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את הנוגדן הראשוני הלא מאוגד.
    8. דגירה של רקמות עם 1:1000 נוגדנים משניים רלוונטיים של Alexa Fluor ב- PBS לילה ב- RT למשך שעתיים.
    9. לשטוף בעדינות את הרקמה במשך 5 דקות ב- PBS שלוש פעמים כדי להסיר עודף נוגדנים משניים לא מאוגדים.
    10. הרכיבו את המגלשות עם מדיום הרכבה המכיל DAPI ויבשו את המגלשות בחושך ב-RT.
    11. דמיינו את הקטעים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן להפריד את הדור של SCADs לשלושה שלבים חיוניים: קצירת עור בחזרה מעכברי P0-P1, יצירת אגרופי ביופסיה בעובי מלא, והתרבות שלאחר מכן של סקאדים בודדים עד 5 ימים בלוחות של 96 בארות. כקריאה, ניתן ליישם עוד יותר את הבדיקה הזו כדי לנתח את ההיבטים המרחביים והזמניים של הצטלקות. הניתוח המרחבי משתמש בתיוג חיסוני דו-ממדי ותלת-ממדי של רקמות כדי לחקור לוקליזציה מרחבית של רכיבי תאים ומטריצות בתוך רקמת צלקת מתפתחת. מחקרים Spatiotemporal מאפשרים הדמיה של צלקות ex-situ אלה באמצעות חלבונים פלואורסצנטיים פנימיים או חיצוניים של רקמו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מספר דגמים כבר פותחו כדי להבין היווצרות צלקות לאחר פציעה. אמנם נעשו הרבה התקדמויות בעניין זה, אך המנגנונים בפועל עדיין אינם ברורים. בניגוד לטכניקה הקודמת, מודל SCAD משלב את כל סוגי התאים והשכבות העוריות, ובכך שומר על המורכבות של עור מקומי18,19. מתודולוגיה זו מסוגלת לייצר מערכי נתונים בסיסיים החשובים להבנת מנגנונים מולקולריים המניעים היווצרות צלקות. הבדיקה מתוכננת באופן פשוט, מינימליסטי, אך מסוגל לייצר קריאות בסיסיות ותפקודיות החיוניות להבנת נדידת פיברובלסטים, תצה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הכותבים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לכל המחברים השותפים של Jiang et al. 2020 על תרומתם לפיתוח מתודולוגיית SCAD13. אנו מודים לד"ר סטפן דיצל ולמתקן הליבה של הדמיה ביולוגית באוניברסיטת לודוויג-מקסימילנס על הגישה למערכת המולטי-פוטון. י.ר. נתמך על ידי קרן אלזה-קרנר-פרסניוס-ספניוס (2016_A21), מענק איחוד המועצה האירופית למחקר (ERC-CoG 819933) וקרן LEO (LF-OC-21-000835).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% Tween 20, חומר ניקוי לא יוניBiorad Laboratories1610781
אלבומין בסרום בקר, פרקט אתנול קרSigmaA4503-50G
DMEM/F-12, HEPES, ללא פנול אדום-500 מ"לLIFE Technologies11039021
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםGibco14190169
Epredia Cryostar NX70 CryostatThermo Scientific
Epredia SuperFrost Plus הידבקות שקופיותפישר מדעיJ1800AMNZהידבקות סרום
בקר עוברי, מוסמך, מושבת בחום, מאושר על ידי האיחוד האירופי, דרום אמריקה מקור-500 מ"לLIFE Technologies 
Fluoromount-G עם DAPILife Technologies00 4959 52מדיום הרכבה עם מלקחיים DAPI
מעוקלים עם נקודות עדינות עם נירוסטה מנחה (פינצטה) באורך 125 מ"מFisher Scientific12381369
ג'לטין מעור חזירSigmaG2500-100G
GlutaMAX תוסף-100 מ"לLIFE Technologies35050038
HBSS, סידן, מגנזיום, ללא פנול אדום-500 מ"לLIFE Technologies14025092
מערכת דגירה של גז איבידי ל-CO2 ו-O2Ibidi11922
Ibidi10915
מיקרוסקופ זקוף Leica SP8 - עירור מולטיפוטון 680– 1300 ננומטרLeicaמצויד במטרת טבילה במים פי 25 (HC IRAPO L 25x/1.00  W) בשילוב עם לייזר מתכוונן (Spectra-Physics, InSight DS +  יחיד)
חומצות אמינו לא חיוניותLIFE Technologies11140035
NuSieve GTG אגרוז, 25 גרםביוזים/לונזה859081
OCT מטריצת הטמעהקרלרוט6478.1
פרפורמלדהיד, 16% W/V AQ. 10 x10 מ"לVWR International43368.9M
עט-סטרפטוקוקג'יבקו15140122
Stiefel Biopsy-Punch 2 מ"מStiefel270130
מספריים ישרים חדים/חדים 11.4 ס"מFisher Scientific15654444
Thimerosal Bioxtra, 97%– 101%Sigma-AldrichT8784-1G
Zeiss Axioimager M2 מיקרוסקופ זקוףZeiss
10500064

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Longaker, M. T., et al. Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation. Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).
  2. desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. Fibroblasts and wound healing: an update. Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).
  3. Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).
  4. Tripathi, S., et al. Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities. Biomedical Dermatology. 4, 11(2020).
  5. Martin, P. Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
  6. Correa-Gallegos, D., et al. Patch repair of deep wounds by mobilized fascia. Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).
  7. Sen, C. K. Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates. Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).
  8. Rinkevich, Y., et al. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), 2151(2015).
  9. Leavitt, T., et al. Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis. Cell Reports. 33 (6), 108356(2020).
  10. Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
  11. Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
  12. Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).
  13. Jiang, D., et al. Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin. Nature Communications. 11 (1), 5653(2020).
  14. Wan, L., et al. Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).
  15. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -L., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807(2021).
  16. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
  17. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  18. Wilhelm, K. -P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studies. Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
  19. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing). The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים