אנליזה של מולקולה בודדת של מנועי משפחת קינסין-3 מטוהרים מסוג Sf9

סיכום

מחקר זה מפרט טיהור של KIF1A(1-393LZ), חבר במשפחת קינזין-3, באמצעות מערכת ביטוי Sf9-baculovirus. ניתוח החלקה חד-מולקולתית ורב-מנועית במבחנה של מנועים מטוהרים אלה הפגין תכונות תנועתיות חזקות הדומות למנועים של ליזאט תאי יונקים. לפיכך, מערכת Sf9-baculovirus היא מקובלת להביע ולטהר חלבון מוטורי של עניין.

תקציר

סביבה תאית מורכבת מציבה אתגרים לניתוח תנועתיות של מולקולה בודדת. עם זאת, ההתקדמות בטכניקות ההדמיה שיפרה את המחקרים על מולקולות בודדות וצברה פופולריות עצומה באיתור והבנה של ההתנהגות הדינמית של מולקולות המתויגות על-ידי פלואורסצנט. במאמר זה נתאר שיטה מפורטת למחקרי מולקולה בודדת במבחנה של מנועים ממשפחת קינסין-3 באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF). Kinesin-3 היא משפחה גדולה הממלאת תפקידים קריטיים בתפקודים תאיים ופיזיולוגיים, החל מהובלת מטענים תוך-תאיים, דרך חלוקת תאים ועד להתפתחות. הראינו בעבר שמנועי קינזין-3 דימריים פעילים באופן מכונן מפגינים תנועתיות מהירה וסופר-מעבדית עם זיקה מיקרוטובולית גבוהה ברמת המולקולה הבודדת באמצעות ליזטים תאיים שהוכנו על ידי ביטוי מוטורי בתאי יונקים. המעבדה שלנו חוקרת מנועי קינסין-3 ומנגנוני הוויסות שלהם תוך שימוש בגישות תאיות, ביוכימיות וביופיזיקליות, ומחקרים כאלה דורשים חלבונים מטוהרים בקנה מידה גדול. ביטוי וטיהור של מנועים אלה באמצעות תאי יונקים יהיה יקר וגוזל זמן, בעוד שביטוי במערכת ביטוי פרוקריוטית הביא לחלבון מצטבר ולא פעיל באופן משמעותי. כדי להתגבר על המגבלות שמציבות מערכות טיהור חיידקים וליזה של תאי יונקים, הקמנו מערכת ביטוי חזקה של Sf9-baculovirus כדי לבטא ולטהר את המנועים האלה. מנועי הקינזין-3 מתויגים באופן סופי ב-C עם חלבונים פלואורסצנטיים בעלי 3 טנדם (3xmCitirine או 3xmCit) המספקים אותות משופרים והפחתת הלבנה. ניתוח החלקה חד-מולקולתית ורב-מנועית במבחנה של חלבונים מטוהרים מדגם Sf9 מראה כי מנועי קינזין-3 הם מהירים וסופר-מעבדים בדומה למחקרים קודמים שלנו שהשתמשו בליסאטות של תאי יונקים. יישומים אחרים המשתמשים במבחנים אלה כוללים ידע מפורט על תנאי אוליגומרים של מנועים, שותפים מחייבים ספציפיים המקבילים למחקרים ביוכימיים, ומצבם הקיני.

מבוא

סביבת תאים צפופה מאוד מציבה אתגרים רבים במיון חלבונים ומולקולות מיועדים. עומס עבודה אינטנסיבי זה של ארגון והפצה מרחבית-טמפורלית של מולקולות בתוך הציטופלסמה מתאפשר על ידי מנועים מולקולריים ומסלולים ציטוסקטליים. מנועים מולקולריים הם האנזימים שמבצעים הידרוליזה של מטבעות האנרגיה כגון ATP ומנצלים אנרגיה זו במהלך תנועה ויצירת כוח¹. בהתבסס על הדמיון ברצף חומצות האמינו, קינסינים מקובצים ל-14 משפחות ולמרות הדמיון הזה, כל מנוע תורם באופן ייחודי לתפקוד התא. מנועי משפחת קינסין-3 מהווים את אחד הגדולים ביותר, הכולל חמש תת-משפחות (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 ו- KIF28)², הקשורות למגוון תפקודים תאיים ופיזיולוגיים, כולל הובלת שלפוחית, איתות, מיטוזה, הגירה גרעינית ופיתוח ^3,4,5. פגיעה בתפקוד ההובלה של קינזין-3 כרוכה בהפרעות נוירודגנרטיביות רבות, פגמים התפתחותיים ומחלות סרטן 6,7,8,9^.

עבודות אחרונות הראו כי מנועי קינזין-3 הם מונומרים אך עוברים דימריזציה הנגרמת על ידי מטען וגורמים לתנועתיות מהירה וסופר-תהליכית בהשוואה לקינסין^{קונבנציונלי 10,11,12,13}. האפיון הביוכימי והביופיזי שלהם זקוק לכמות גדולה של חלבונים מטוהרים ופעילים. עם זאת, הייצור שלהם במערכת הביטוי הפרוקריוטית הביא למנועים לא פעילים או מצטברים, ככל הנראה בשל סינתזת חלבונים, קיפול ושינוי מכונות 14,15,16,17,18 שאינן תואמות. כדי לעקוף מגבלות כאלה ולהגדיל את התשואה, כאן הקמנו מערכת ביטוי חזקה Sf9-baculovirus כדי לבטא ולטהר את המנועים האלה.

מערכת הביטוי של baculovirus משתמשת בקווי תאי חרקים Sf9 כמערכת מארחת לביטוי חלבון רקומביננטי אאוקריוטי בעל תפוקה גבוהה^19,20. ל-Baculovirus יש מקדם פוליהדרין חזק המסייע בביטוי גנים הטרולוגיים ובייצור חלבונים רקומביננטיים מסיסים¹⁷. בשל עלותו החסכונית, בטיחותו לטיפול וכמות גבוהה של ביטוי חלבון פעיל, הוא הפך לכלי רב עוצמה²¹. כדי לבטא חלבון בעל עניין, צעד מפתח הוא ליצור בסיס רקומביננטי. מכיוון שערכות ייצור הבקמיד הזמינות מסחרית הן יקרות ואנחנו נעבוד עם דגימות נוספות, פיתחנו פרוטוקול פנימי לתוספות גדולות וקטנות של מנועי קינזין-3 לתוך bacmids. מנועי קינזין-3 מטוהרים Sf9 שימשו לאפיון תכונות גלישה של מיקרוטובול מיקרו-מבחנה חד-מבנית ורב-מנועית באמצעות מיקרוסקופיית השתקפות פלואורסצנטית פנימית כוללת (TIRF). מנועים מתויגים באופן סופי C עם מולקולות פלואורסצנטיות 3-טנדם (3xmCit) כדי לספק אות משופר והפחתת הלבנת פוטו. בשל יחס אות לרעש מוגבר, פחות פוטוטוקסיות והדמיה סלקטיבית של אזור קטן מאוד קרוב לכיסוי, נעשה שימוש נרחב בהדמיית TIRF כדי לדמיין דינמיקה של חלבונים ברמת המולקולה הבודדת in vivo ו- in vitro.

מחקר זה דן בטיהור מנועי קינסין-3 על ידי שימוש במערכת ביטוי Sf9-baculovirus והדמיית מולקולה בודדת במבחנה וניתוח גלישה רב-מוטורית של מנועים באמצעות מיקרוסקופיית TIRF. בסך הכל, מחקר זה מראה כי תכונות התנועתיות של מנועים מטוהרים Sf9 זהות לאלה של מנועים שהוכנו מליסאטות של תאי יונקים. לפיכך, אנו מאמינים כי ניתן להתאים את מערכת Sf9-baculovirus כדי לבטא ולטהר כל חלבון מוטורי בעל עניין.

פרוטוקול

1. תרבית, טרנספקציה ויצירת וירוסים Sf9

הערה: שמור על תאי Sf9 ב-30 מ"ל של מדיום Sf-900/SFM בבקבוקון חרוטי סטרילי וחד-פעמי של 100 מ"ל ללא כל אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטית בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. שמור על תרבות המתלים בשייקר מסלולי ב-90 סל"ד. אין צורך באספקת CO₂ ותחזוקת לחות. תאים הם בדרך כלל תת תרבית כל יום רביעי על ידי חיסון 0.5 x 10 6 תאים / מ"ל כדי להגיע 2.0 x 10^{6 תאים} / מ"ל צפיפות ביום הרביעי.

1. יצירת מלאי וירוסים P0
   1. לצורך טרנספקציה, תאי זרעים לתוך צלחת 35 מ"מ עם 4.5 x 10^{5 תאים /} מ"ל מפגש ולשמור על 28 מעלות צלזיוס ללא רעידות.
   2. לאחר 24 שעות, ברגע שהתאים מחוברים ונראים בריאים, המשיכו להעברה כמתואר להלן.
      1. צינור A: ערבבו 1 מיקרוגרם של קידוד DNA בקמיד עבור מנוע KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG ספציפי kinesin-3 עם 100 μL של המדיה של גרייס שלא הוכרעה.
      2. צינור B: ערבבו 6 μL של מגיב טרנספקציה עם 100 μL של מדיה של גרייס שלא הוכרעה.
      3. העבירו בזהירות את התוכן של Tube A לתוך Tube B וערבבו היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה (כ-20 פעמים).
      4. לדגור את התערובת במשך ~ 45 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. לאחר השלמת הדגירה, יש להוסיף 0.8 מ"ל של מדיה של גרייס ללא תוספת לתערובת הנ"ל ולערבב באיטיות על ידי פיפטה.
   4. שאפו בעדינות את מדיית Sf-900/SFM מתאים (כדי להסיר עקבות של סרום שעלולים להשפיע על יעילות ההעברה).
   5. מוסיפים את תערובת הטרנספקציה משלב 1.1.3 טיפה על החלק העליון של התאים ומדגרים את הצלחת במשך 6 שעות ב-28 מעלות צלזיוס.
   6. לאחר הדגירה, הסר בזהירות את תערובת הטרנספקציה, הוסף 2 מ"ל של מדיה Sf-900/SFM ודגרה נוספת במשך 48 שעות ב 28 מעלות צלזיוס.
   7. בדוק את ביטוי החלבון המוטורי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. החלבון המוטורי מתויג עם חלבון פלואורסצנטי, mCitrine, גרסה של חלבון פלואורסצנטי צהוב.
      הערה: תאים שעברו טרנספקציה הודגמו תחת מיקרוסקופ הפוך המצויד בניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) ותאורת אפיפלואורסצנציה עם מטרה של פי 20 (הגדלה של פי 200), מנורת כספית ומצלמת EM-CCD. בדוק את היעילות של יצירת וירוסים וזיהום על ידי ניטור הביטוי של מנועים מתויגים mCitrine בתאים באמצעות עירור mCitrine וקוביית מסנן פליטה. בנוסף, בדקו אם קיימים שינויים מורפולוגיים של תאים נגועים, כגון תאים/גרעינים מוגדלים (איור 1A-C).
   8. שוב, בדוק את התאים 72 שעות לאחר ההדבקה. בדרך כלל, תאים מתחילים להתנתק מפני השטח (איור 2).
   9. אם >5% מהתאים מנותקים מפני השטח, קצרו את המדיה עם תאים נגועים בצינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים של 1.5 מ"ל והסתובבו במשך 5 דקות ב-500 x גרם.
   10. אסוף את ה-supernatant והקפיא את ה-aliquots של 1 מ"ל בחנקן נוזלי ואחסן כמלאי P0 בטמפרטורה של -80°C או השתמש בו כדי ליצור מלאי וירוסים P1.
2. יצירת מלאי וירוס P1
   1. כדי להגביר עוד יותר את מלאי ה-P0 baculovirus ולאשר את ביטוי החלבון, לגדל תאי Sf9 בתרבית תרחיף נוזלי.
   2. בבקבוק חרוטי סטרילי של 100 מ"ל, הוסף 10 מ"ל של מדיה Sf-900/SFM עם צפיפות תאים של 2 x 10^{6 תאים} למ"ל ו-1 מ"ל של מלאי וירוסים P0. דגירה ב-28°C עם רעידות קבועות ב-90 סל"ד.
   3. לאחר 72 שעות של זיהום, בדוק את ביטוי החלבון כפי שתואר קודם לכן (שלב 1.1.7). אם ביטוי החלבון טוב (>90% מהתאים מראים אות פלואורסצנטי בהיר של mCitrine) ומראה מוות תאי משמעותי (בערך 10%-15%), סובבו את התאים בצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל בגודל 500 x g למשך 5 דקות.
   4. אסוף את ה-supernatant, הקפאה מהירה של 1 מ"ל (מלאי P1) בחנקן נוזלי ואחסן בטמפרטורה של -80°C או המשך לזיהום בקנה מידה גדול ולטיהור חלבונים.
3. זיהום בקנה מידה גדול
   1. לביטוי חלבונים בקנה מידה גדול, יש להדביק 30 מ"ל של תרבית התרחיף בצפיפות של 2 x 10^{6 תאים} /מ"ל עם 1 מ"ל של מלאי נגיפי P1 ולדגור ב-28 מעלות צלזיוס עם רעידות קבועות ב-90 סל"ד.
   2. לאחר ~ 72 שעות לאחר ההדבקה, בדוק את ביטוי החלבון (באופן כללי, ביטוי חלבון מקסימלי מושג בין 65-75h לאחר ההדבקה).
   3. אם >90% מהתאים מראים אות פלואורסצנטי בהיר עם מוות תאי מינימלי (<5%), אספו את התאים בצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל והסתובבו כלפי מטה בטמפרטורה של 500 x g ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      הערה: צריך להיות מוות תאי מינימלי (<5%), מכיוון שתאים מתים משחררים את תוכן התאים למדיה, מה שמוביל לאובדן של חלבון מבוטא.
   4. השליכו את הסופרנטנט, אספו את גלולת התא והמשיכו בטיהור החלבון.

2. טיהור Sf9 של מנועי קינזין-3

1. לכדור התא הנ"ל, הוסיפו 3 מ"ל של חיץ תזה קר כקרח (טבלה משלימה 1) בתוספת טרייה של 5 mM DTT, 5 מיקרוגרם/מ"ל של אפרוטינין, 5 מיקרוגרם/מ"ל של לאופטין, ו-5 מיקרוגרם/מ"ל של PMSF והניחו את התאים על ידי פיפטינג 20-25 פעמים מבלי ליצור בועות אוויר. עבור כל הרכבי החיץ והריאגנטים, עיין בטבלה משלימה 1.
2. סובב את התא ליזאט ב 150,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
3. אסוף את הסופרנטנט לתוך שפופרת טרייה וסטרילית וערבב עם ~ 40 μL של שרף זיקה נגד FLAG M2. דגירה של התערובת במשך 3 שעות ב-4 מעלות צלזיוס עם רעידות מקצה לקצה.
4. לאחר הדגירה, גלולה שרף FLAG על ידי סיבוב ב 500 x g במשך דקה אחת ב 4 מעלות צלזיוס. שאפו בעדינות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור עם מחט של 26 גרם והשליכו אותו.
5. יש לשטוף את גלולת השרף FLAG שלוש פעמים עם חיץ שטיפה קר כקרח (טבלה משלימה 1) בתוספת טרייה של 2 mM DTT, 5 מיקרוגרם/מ"ל של אפרוטינין, 5 מיקרוגרם/מ"ל של לאופטין ו-5 מיקרוגרם/מ"ל של PMSF. גלולה את החרוזים על ידי סיבוב ב 500 x גרם במשך דקה אחת ב 4 מעלות צלזיוס בכל כביסה.
6. לאחר הכביסה השלישית, מסננים בזהירות את חיץ הכביסה ככל האפשר מבלי להפריע לכדור. עבור elution חלבון, להוסיף ~ 70 μL של מאגר לשטוף המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל פפטיד FLAG גלולה שרף ו דגירה לילה ב 4 °C עם tumbling מקצה לקצה.
7. ביום שלאחר מכן, לסובב את השרף ב 500 x גרם במשך 1 דקה ב 4 מעלות צלזיוס. יש לאסוף את הסופרנטנט המכיל חלבון מטוהר לתוך שפופרת טרייה ולהשלים עם 10% גליצרול. יש להקפיא אליקוטים של 5 μL בחנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.
8. הפעל את ג'ל SDS-PAGE כדי לקבוע את ריכוז החלבון ותפוקתו. יחד עם חלבון מטוהר של עניין, בקרת חלבון סטנדרטית, BSA של ריכוזים ידועים הנעים בין 0.2 מיקרוגרם, 0.4 מיקרוגרם, 0.6 מיקרוגרם, 0.8 מיקרוגרם ו 1 מיקרוגרם נטענים כדי ליצור עקומה סטנדרטית. הכתימו את הג'ל בכחול מבריק של Coomassie (איור 3).
9. נתחו את הג'ל באמצעות כלי כימות ג'ל מובנה בתוכנת ImageJ. ראשית, מדדו את עוצמת הפסים של ריכוזים ידועים של BSA וצרו את העקומה הסטנדרטית. לאחר מכן, מדדו את עוצמת רצועת החלבון המטוהרת וקבעו את ריכוז החלבון. לשם כך פתח את תוכנת Image J, לחץ על נתח אפשרות בשורת התפריטים ובחר ג'לים בתפריט הנפתח.

3. בדיקת תנועתיות מולקולה בודדת במבחנה באמצעות מנועי קינזין-3 מטוהרים Sf9

הערה: ניתן להשתמש במנועי קינסין-3 המטוהרים Sf9 כדי לחקור תכונות ביוכימיות וביופיזיות כגון קצב תחלופת ATP, זיקת מיקרוטובולים, מהירות, אורך ריצה, גודל צעד ויצירת כוח. כאן מתואר פרוטוקול מפורט לניתוח תנועתיות מולקולה בודדת במבחנה של KIF1A(1-393LZ) באמצעות מיקרוסקופיית השתקפות פנימית כוללת פלואורסצנטית (TIRF). עבור כל הרכב המאגרים והריאגנטים, עיין בטבלה משלימה 1.

1. פילמור מיקרוטובול
   1. בצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש של 0.5 מ"ל, הכינו תערובת פילמור על ידי פיפטינג בסדר הבא: 12.0 מיקרוליטר של חיץ BRB80, pH 6.9; 0.45 מיקרון ליטר של 100 mM MgCl₂, 1 μL של 25 mM GTP.
   2. מוציאים 10 μL aliquot של 10 מ"ג/מ"ל טובולין המאוחסן בחנקן נוזלי, מפשירים מיד ומוסיפים לתערובת הפילמור הנ"ל. מערבבים בעדינות על ידי צנרת 2-3 פעמים מבלי ליצור בועות אוויר.
      הערה: בצע את השלבים לעיל במהירות ובקפדנות על קרח.
   3. תנו לתערובת הנ"ל לשבת על קרח למשך 5 דקות.
      הערה: זהו צעד קריטי כדי למנוע דנטורציה של טובולין או כדי למנוע היווצרות של זרעי microtubule קצרים.
   4. מעבירים את הצינור לבלוק חום/אמבט מים מחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ודוגרים במשך 30 דקות לפילמור מיקרוטובולים.
   5. בזמן שהמיקרוטובולים מתפלמרים, הפשירו מאגר של P12 והביאו אותו לטמפרטורת החדר.
   6. לפני השלמת 30 דקות של דגירה, התחל להכין חיץ ייצוב MT על ידי הזרמת 100 μL של חיץ P12 לתוך צינור microcentrifuge טרי. לשם כך, מוסיפים 1 μL של 1 mM טקסול ומיד מערבלת את התערובת.
      הערה: התחל להכין את מאגר ייצוב MT כ-5 דקות לפני השלמת הדגירה בשלב 3.1.4. טקסול מייצב את המיקרוטובולים הפולימריים על ידי קשירה ל-β-טובולין.
   7. מחממים את חיץ הייצוב של המיקרוטובול למשך 2-3 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ומוסיפים אותו בעדינות למיקרוטובולים הפולימריים מבלי להפריע לתערובת הפילמור בתחתית.
      הערה: חימום חיץ הייצוב יביא אותו לאותה טמפרטורה כמו תערובת הפילמור.
   8. אין להקיש או לפיפטה על התערובת ולדגור עוד יותר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   9. מקישים בעדינות על התערובת ומערבבים אותה עם קצה חתוך משופע (קיבולת של 200 μL) באיטיות באמצעות הפיפטה.
      הערה: מנקודה זו והלאה, טפל תמיד במיקרוטובולים עם קצה חתך משופע כדי למנוע גזירה של מיקרוטובול.
   10. קח 10-15 μL של מיקרוטובולים פולימריים בתא זרימה כדי לבדוק פילמור תקין של מיקרוטובולים.
       הערה: ניתן לדמיין את המיקרוטובולים ללא תווית באמצעות הגדרת מיקרוסקופיית DIC.
   11. אם מרוכזים מיקרוטובולים, דיללו אותם במאגר P12 בתוספת טקסול של 10 מיקרומטר.
2. הכנת תא תא זרימה תנועתיות
   1. הכינו תא תנועתיות באמצעות מגלשת זכוכית, סרט הדבקה דו-צדדי וכיסוי זכוכית (22 מ"מ x 30 מ"מ).
   2. קח מגלשת זכוכית, הנח טיפה (~ 70 μL) של מים מזוקקים שעברו דה-יוניזציה באמצע ונגב אותם עם נייר טישו ללא מוך.
   3. חותכים שתי רצועות של סרט דו-צדדי (~ 35 x 3 מ"מ) ומדביקים אותן בחוזקה לשקופית הזכוכית במקביל, משאירים רווח של ~ 4-5 מ"מ בין שתי רצועות כדי ליצור מעבר צר.
   4. לאחר מכן, קח כיסוי והוסף טיפה (~ 20 μL) של מים מזוקקים deionized באמצע. הניחו רצועה של נייר טישו לניקוי עדשות ללא מוך על טיפת המים עד שהיא סופגת את המים. לאחר מכן, החליקו אותו באיטיות לעבר קצה אחד של הכיסוי.
      הערה: הכיסוי צריך להיות יבש לחלוטין. אין לראות מים על הכיסוי.
   5. הניחו את הכיסוי על הרצועות הדו-צדדיות שנתקעו על המגלשה ולחצו על הכיסוי באופן שווה לאורך הרצועות כדי להידבק בחוזקה.
      הערה: ודא שהצד הנקי של הכיסוי פונה למגלשת הזכוכית.
   6. ודא שיחד זה יוצר תא צר של קיבולת של 10-15 μL לביצוע בדיקת תנועתיות (איור 4A).
3. מבחן תנועתיות של מולקולה בודדת במבחנה
   הערה: כדי לחקור את תכונות התנועתיות מבוססות המיקרוטובול של מולקולות בודדות של מנועים, יש לספוח מיקרוטובולים על משטח הכיסוי בתא התנועתיות.
   1. דילל את המיקרוטובולים המיוצבים בטקסול פולימרי במאגר P12 בתוספת טקסול של 10 μM ביחס של 1:5 וערבב על ידי פיפטינג איטי עם קצה משופע.
   2. שמור על תא הזרימה במצב נטוי (~15-20°). הזרם 30 μL של תמיסת מיקרוטובול מדולל דרך תא הזרימה מהקצה העליון תוך שמירה על נייר טישו ללא מוך בקצה התחתון לספיגת הנוזל. פעולה זו יוצרת כוח גזירה ליישור המיקרוטובול בכיוון הזרימה ומסייעת לספוח את המיקרוטובולים ישר וליישר במקביל.
   3. השאירו טיפה קטנה של נוזל בשני קצות התא ושמרו על תא הזרימה במצב הפוך (כיסוי הפונה לתחתית) בתא סגור ולח כדי למנוע ייבוש של תא התנועתיות.
   4. תן לו לשבת במשך ~ 30 דקות, כך microtubules ספיחה על פני השטח של כיסוי להחליק בתוך תא תנועתיות.
   5. בינתיים, הכן את מאגר החסימה על ידי ערבוב 500 μL P12-BSA מאגר עם 5 μL של 1 mM טקסול.
   6. זרימה 40-50 μL של מאגר חוסם ודגירה של המגלשה במצב הפוך במשך 10 דקות בתא לח.
   7. הכן את תערובת התנועתיות על ידי צינורית הרכיבים הבאים לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בקיבולת 500 μL בסדר הבא: 25 μL של חיץ P12 עם טקסול, 0.5 μL של 100 mM MgCl₂, 0.5 μL של 100 mM DTT, 0.5 μL של 20 מ"ג / מ"ל גלוקוז אוקסידאז, 0.5 μL של 8 מ"ג / מ"ל קטלאז, 0.5 μL של 2.25 M גלוקוז, ו 1.0 μL של 100 mM ATP.
      הערה: הדמיה פלואורסצנטית נמצאת בשימוש נרחב עבור יישומים ביולוגיים 22,23,24,25,26. פוטו-אקסצייטציה של חלבונים פלואורסצנטיים יוצרת מיני חמצן תגובתי (ROS), מה שעלול לגרום לפוטו-הלבנה של החלבונים הפלואורסצנטיים ולפגיעה בדגימות הביולוגיות^27,28. אוכלי נבלות חמצן כגון גלוקוז, גלוקוז אוקסידאז וקטלאז משמשים באופן שגרתי במבחני תנועתיות כדי להגביל את הפוטו-דאם ולהאריך את זמן ההלבנה של חלבונים פלואורסצנטיים.
   8. לבסוף, הוסיפו 1 μL של המנוע המטוהר לתערובת התנועתיות הנ"ל וערבבו היטב לפני שתזרמו לתא התנועתיות.
   9. אטמו את שני הקצוות של תא התנועתיות עם שעוות פרפין נוזלית ומיד צלמו תחת תאורת TIRF באמצעות יעד TIRF 100X של 1.49 NA עם הגדלה של פי 1.5.
   10. על מנת למקד את משטח הכיסוי, ראשית, התמקדו באחד הקצוות הפנימיים של סרט הדבקה דו-צדדי בתא התנועתיות תחת תאורת ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC).
       הערה: המשטח הבהיר והלא אחיד יהיה גלוי.
   11. לאחר מכן, העבר את המיקוד לתא התנועתיות. באמצעות כוונון עדין, מקד את משטח הכיסוי וחפש את המיקרוטובולים הנספגים על משטח הכיסוי.
   12. לאחר שהמיקרוטובולים ממוקדים, עברו לתאורת TIRF עם לייזר עירור של 488 ננומטר והתאימו את עומק ההארה על ידי שינוי זווית קרן העירור כדי לקבל את תאורת ה-TIRF הטובה והאחידה ביותר (איור 4B).
   13. מקד את המנועים הבודדים המתויגים על-ידי mCitrine הנעים באופן תהליכי לאורך משטח המיקרוטובול בחשיפה של 100 אלפיות השנייה והקלט את התנועה באמצעות מצלמת EM-CCD.
       הערה: למרות שמבחני התנועתיות בוצעו על מיקרוטובולים ללא תווית, ניתן להשתמש בפונקציית ההטלה z בעוצמה המרבית כדי לחשוף את קווי המתאר של מסלול המיקרוטובול. באופן מועדף, אירועים על מסלולי מיקרוטובול ארוכים נחשבו לניתוח מעקב.
   14. עקוב באופן ידני אחר מיקומם של מנועים בודדים המתויגים באופן פלואורסצנטי ההולכים על מסלולי מיקרוטובול ארוכים מסגרת אחר מסגרת באמצעות תוסף שנכתב בהתאמה אישית בתוכנת ImageJ (nih.gov) כפי שתואר קודם^{לכן 29}.
   15. צור את ההיסטוגרמות של מהירות ואורך ריצה עבור אוכלוסיית המנוע על ידי התוויית מספר האירועים בכל סל. התאימו את ההיסטוגרמות האלה לפונקציית שיא גאוס יחידה כדי לקבל מהירות ממוצעת ואורך ריצה¹² (איור 4C-E).

4. בדיקת גלישה במיקרוטובול במבחנה

הערה: כדי להבין את ההתנהגות הקולקטיבית של מנועי קינזין-3, בדיקת גלישה במיקרוטובול במבחנה בוצעה 18,30,31. כאשר מנועים משותקים על הכיסוי במצב הפוך, וכאשר מוסיפים מיקרוטובולים לתא, מיקרוטובולים נוחתים על מנועים וגולשים הלאה בזמן שהמנועים מנסים ללכת עליהם (איור 5A,B).

1. פולימריזציה של מיקרוטובולים פלואורסצנטיים: פילמר את המיקרוטובולים בהתאם לפרוטוקול שתואר קודם לכן, למעט ערבוב רובולין המסומן ברודמין (3 מ"ג/מ"ל) עם טובולין ללא תווית (10 מ"ג/מ"ל) ביחס של 1:10.
2. לאחר 30 דקות של פילמור, הוסיפו בעדינות 30 μL של חיץ ייצוב מיקרוטובול שחומם מראש ודגרו עוד יותר במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
3. לאחר מכן, גזירת המיקרוטובולים על ידי פיפטינג עם קצה העמסת הנימים (~25-30 פעמים).
4. הכינו את תא זרימת התנועתיות כפי שתואר קודם לכן, זרמו 50 μL של ננו-גופי GFP מטוהרים Sf9 (2.5 μL של 100 ננומטר מדולל ב-50 μL של חיץ P12) ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כאשר הכיסוי פונה כלפי מטה בתא לח.
   הערה: המנועים מתויגים באופן סופי C עם mCitrine. ננו-גופים GFP משמשים לשיתוק המנועים בשל קבוע הדיסוציאציה הנמוך^{שלהם 32}.
5. חסום את משטח הכיסוי על ידי הזרמת 50 μL של מאגר בלוקים לתוך תא הזרימה כדי למנוע ספיחת חלבונים לא ספציפיים ודגרה נוספת במשך 5 דקות.
6. הכן את תערובת המנוע על ידי צינורות 50 μL של חיץ בלוק, 1 μL של 100mM ATP, ו 5 μL של 100 nM Sf9 מטוהרים קינזין -3 מנועים. מערבבים בעדינות לפני הזרימה לתוך התא ודוגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח.
7. שטפו את התא פעמיים עם 50 מיקרו-ליטר של קזאין P12.
8. בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי, הכינו את תערובת בדיקת הגלישה בסדר הבא, 45 μL של P12-casein עם 10 μM טקסול, 1 μL של 100 mM ATP, 0.5 μL של 8 מ"ג / מ"ל קטלאז, 0.5 μL של 20 מ"ג / מ"ל גלוקוז אוקסידאז, 0.5 μL של 2.25 M גלוקוז ו 1 μL של מיקרוטובולים פלואורסצנטיים גזוזים. מערבבים בעדינות את התוכן לפני הזרימה לתוך תא התנועתיות ואוטמים את קצות התא עם שעוות פרפין נוזלית.
9. מיקרוטובול תמונה גולש תחת תאורת TIRF בחשיפה של 100 אלפיות השנייה וצלם את התמונות באמצעות מצלמת EM-CCD מחוברת.
   הערה: מהירות הגלישה הממוצעת של מיקרוטובול נקבעה על-ידי מעקב ידני אחר כ-100 מיקרוטובולים בודדים מסגרת אחר מסגרת באמצעות תוסף שנכתב בהתאמה אישית ב-ImageJ²⁹. קבעו את מהירות הגלישה הממוצעת של מיקרוטובולים על ידי יצירת היסטוגרמה והתאמה לפונקציית גאוס (איור 5C,D).

תוצאות

כדי לבטא ולטהר חלבונים מוטוריים רקומביננטיים פעילים ופונקציונליים בקנה מידה גדול באמצעות הביטוי Sf9-baculovirus, המערכת זקוקה ליצירת חלקיקים נגיפיים הנושאים ביציבות רצף קידוד כדי להדביק תאי Sf9. כדי להשיג זאת, תאי Sf9 הומרו עם קידוד רקומביננטי של הבקמיד KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG. לאחר 72 שעות, אוכלוסייה משמעותית של תאים הראתה ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (mCitrine) עם תאים וגרעינים מוגדלים (איור 1 ואיור 2), מה שמרמז על ייצור מוצלח של חלקיקים נגיפיים (P0). חל...

דיון

מערכת הביטוי Sf9-baculovirus היא אחת השיטות הרב-תכליתיות והמוצלחות ביותר לייצור חלבונים בתפוקה גבוהה 19,36,37. יכולת השינוי לאחר ההעברה של תאי Sf9 דומה מאוד למערכת היונקים¹⁵. חסרון ניכר בשימוש במערכת זו הוא שהיא איטית ורגישה לזיהום. אחד הצעדים הקריטיים ביותר הוא זיהום יעיל וביטוי מוצלח בתאי Sf9, הדורש טיפול ותחזוקה נאותים של תאי Sf9 ללא כל זיהום. המערכת דורשת מקום ייעודי ללא אבק ומכשירים כגון אינקובטור וש...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>Sf9 תרבית וחומרי טרנספקציה
אנטי-FLAG M2 זיקה	Biolegend	651502	לטיהור חלבונים
Aprotinin	Sigma	A6279	לטיהור חלבונים
Cellfectin	Invitrogen	10362100	לטרנספקציה Sf9
DTT	Sigma	D5545	לבדיקות תנועתיות וטיהור חלבון
פפטיד FLAG	Sigma	F3290	לטיהור חלבון
גליצרול	Sigma	G5516	להקפאת החלבון
HEPES	Sigma	H3375	עבור מאגר ליזה Sf9
IGEPAL CA 630	Sigma	I8896	עבור מאגר ליזה Sf9
KCl	Sigma	P9541	להכנת מאגרים
לופפטין	סיגמא	L2884	לטיהור חלבונים
MgCl2	Sigma	M2670	להכנת חוצצים
NaCl	Sigma	S7653	להכנת מאגר ליזה
PMSF	Sigma	P7626	לטיהור חלבונים
תאי Sf9	מתנה אדיבה מד"ר תומאס פוקדייל (המכון ההודי למדע חינוך ומחקר, פונה, הודו).		לביטוי בקולובירים וטיהור חלבון
בקבוקי תרבית Sf9	Thermo Scientific	4115-0125	לתרבית תרחיף
Sf-900/SFM בינוני (1X)	Thermo Scientific	10902-096 -500 מ"ל	לתרבית תאי Sf9
סוכרוז	סיגמא	S1888	הכנת מאגר לייזינג לתאי Sf9
ללא תוספת גרייס' s media	Thermo Scientific	11595030 -500 מ"ל	עבור Sf9 transfection
Mirotubule פילמור ובדיקת מולקולה בודדת materails
ATP	Sigma	A2647	לבדיקת תנועתיות וגלישה
BSA	Sigma	A2153	לחסימת תא תנועתיות
Catalase	Sigma	C9322	עבור בדיקת תנועתיות וגלישה
DMSO	Sigma	D5879	להמסת רודמין
EGTA	Sigma	3777	להכנת מאגרים
גלוקוז	Sigma	G7021	לבדיקת תנועתיות וגלישה
גלוקוז אוקסידאז	Sigma	G2133	לבדיקת תנועתיות וגלישה
GTP	Sigma	G8877	לפילמור מיקרו-צינורות
KOH	Sigma	P1767	הכנת צינורות מאגר pH 6.9
צינורות	Sigma	P6757	להכנת מאגרי בדיקה תנועתיות וגלישה
<חזק>חומרי בדיקת גלישה של מיקרו-צינורות
26G  מחט	Dispovan		לגזירת מיקרו-צינורות
קזאין	סיגמא	C3400	עבור בדיקת גלישה של מיקרו-צינורות
ננו-גופים GFP	מתנה מד"ר Sivaraj Sivaramakrishnan (אוניברסיטת מינסוטה, ארה"ב)		לחיבור מנועים לכיסוי
Rhodamine	Thermo Scientific	46406	להכנת תיוג טובולין
<חזק>מיקרוסקופ ומכשירים אחרים
0.5 מ"ל, 1.5 ו-2 מ"ל צינורות	מיקרו-צנטריפוגהEppendorf		לתרבית וטיהור Sf9
10ml  פיפטות סטריליות חד פעמיות	Eppendorf		לתרבית וטיהור Sf9
10ul, 200ul, 1 מ"ל קצות מיקרופיפטה	Eppendorf		לתרבית וטיהור Sf9
15 מ"ל צינורות concal	Eppendorf		לתרבית וטיהור Sf9
צלחת תרבית תאים 35 מ"מ	קול פאלמר	15179-39	לאיזון תרבות Sf9
	Sartorious		0.01g-300g
חממת טלטול אורביאלית	ספסל REMI		עבור Sf9 suspenculture במצלמה 28oC
EMCCD Andor iXon Ultra 897		להדמיה ורכישה של TIRF
סרט דו צדדי	סקוטש		להכנת תא תנועתיות
כיסוי זכוכית	Fisherfinest	12-548-5A	; שקופית זכוכית 22X30
	כוכב		להכנת תא תנועתיות
בלוק חימום	חירוש		המסת שעוות פרפין
מיקרוסקופ הפוך	ניקון ליקוי חמה Ti- U		לבדיקת ביטוי חלבון
לייזרים	488 ננומטר (100mW)		להדמיית TIRF
חנקן			נוזלילהקפאה ואחסון לדוגמא
קצה טעינה מיקרו-נימי	Eppendorf	EP022491920	לגזירת מיקרו-צינורות
מיקרוסקופ	Nikon Eclipse Ti2-E עם הגדרת DIC	להדמיית
מיני ספין	Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd		לסיבוב מהיר
אובייקט	100X TIRF מטרת עם טבילת		להדמיית
TIRFאופטימה אולטרה צנטריפוגה XE	בקמן קולטר		לטיהור חלבונים
Parafilm	Eppendorf
pH-meter	Corning	Coring 430	להתאמת pH
Pipette-boy	VWR		לתרבית וטיהור Sf9
Sorvall Legend Micro 21	Thermo Scientific		לטיהור חלבונים
Sorvall ST8R צנטריפוגה	תרמו מדעי		טיהור חלבון
ThermoMixer	Eppendorf		לפילמור מיקרו-צינורות
רוטור אולטרה-צנטריפוגה	בקמן קולטר רוטור		SW60Ti צינורות
אולטרה-צנטריפוגה	בקמן		5 מ"ל, צינור פתוח דק דופן אולטרה ברור, 13 x 51 מ"מ
מערבל מערבולת	ערבוב מדגם חידוש
שעווה	סיגמא	V001228	לאיטום תא התנועתיות