הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד וירוסים הקשורים ליתושים מיתושים שנאספו בשטח

2.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63852

⸱

31 באוגוסט 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Special Pathogens and Biosafety, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

רצפים חדשים רבים דמויי וירוסים נמצאו ביתושים בשל השימוש הנרחב בטכנולוגיות ריצוף. אנו מספקים הליך יעיל לבידוד והגברה של וירוסים באמצעות קווי תאים של בעלי חוליות ויתושים, אשר עשוי לשמש בסיס למחקרים עתידיים על וירוסים הקשורים ליתושים, כולל וירוסים המועברים על ידי יתושים וספציפיים ליתושים.

תקציר

עם היישום הרחב של טכנולוגיות ריצוף, רצפים חדשים רבים דמויי וירוסים התגלו בפרוקי רגליים, כולל יתושים. שתי הקטגוריות העיקריות של וירוסים חדשים אלה הקשורים ליתושים הם "וירוסים המועברים על ידי יתושים (MBVs)" ו"וירוסים ספציפיים ליתושים (MSVs)". נגיפים חדשים אלה עשויים להיות פתוגניים הן לבעלי חוליות והן ליתושים, או שהם יכולים פשוט להיות סימביוטיים עם יתושים. וירוסי ישויות חיוניים כדי לאשר את המאפיינים הביולוגיים של וירוסים אלה. לפיכך, תואר כאן פרוטוקול מפורט לבידוד והגברה של וירוסים מיתושים שנאספו בשטח. ראשית, דגימות היתושים הוכנו כסופרנאטים של הומוגנאטים של יתושים. לאחר צנטריפוגה פעמיים, הסופרנאטנטים חוסנו לקו תאי יתוש C6/36 או לקו תאי חוליות BHK-21 להגברת הנגיף. לאחר 7 ימים, הסופרנאטנטים נאספו כסופרנאטנטים P1 ואוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, סופרנאטנטים P1 הועברו פעמיים נוספות בתאי C6/36 או BHK-21 בזמן שמצב התא נבדק מדי יום. כאשר התגלתה ההשפעה הציטופתוגנית (CPE) על התאים, סופרנאטנטים אלה נאספו ושימשו לזיהוי נגיפים. פרוטוקול זה משמש כבסיס למחקר עתידי על וירוסים הקשורים ליתושים, כולל MBV ו- MSVs.

מבוא

יתושים הם קבוצה של וקטורים פתוגניים חשובים של פרוקי רגליים. ישנם כ -3,500 מינים של יתושים במשפחה Culicidae 1,2. פיתוח טכנולוגיות ריצוף בתפוקה גבוהה הוביל לגילוי רצפים חדשים דמויי וירוסים רבים ביתושים ממקומות שונים בעולם3. באופן כללי, ניתן לסווג את הנגיפים הקשורים ליתושים אלה לשתי קבוצות עיקריות: MBVs ו- MSVs.

MBVs הם קבוצה של וירוסים מגוונים שהם גורמים סיבתיים למחלות רבות של בני אדם או בעלי חיים, כגון וירוס קדחת צהובה (YFV), נגיף דנגי (DENV), וירוס דלקת המוח היפנית (JEV), וירוס הנילוס המערבי (WNV) ונגיף קדחת עמק השבר הסורי אפריקאי (RVFV)4. הם איימו באופן חמור על בריאות הציבור בכך שגרמו לתחלואה ותמותה קשות הן בבני אדם והן בבעלי חיים ברחבי העולם. MBVs מקיימים באופן טבעי מחזור חיים בין פונדקאים מגוונים באמצעות העברה מיתוש נגוע לפונדקאי תמים, כמו גם מפונדקאי נגוע בנגיף ויתוש האכלה5. לכן, נגיפים אלה יכולים להדביק הן שורות תאי יתושים והן שורות תאים של בעלי חוליות במעבדה1.

MSVs, הכוללים וירוס Yichang (YCN), Culex flavivirus (CxFV) ווירוס Chaoyang (CHAOV), הם תת-קבוצה של וירוסים ספציפיים לחרקים 1,6,7. בשנים האחרונות, חלה עלייה בגילוי של MSV חדשים, וחלק MSV אלה נמצאו כבעלי השפעה על העברת MBVs. לדוגמה, CxFV, אשר יכול להיות זיהום מתמשך ב Culex pipiens, יכול לדכא שכפול WNV בשלב מוקדם8. נגיף פלבי ספציפי נוסף לחרקים, נגיף סוכן איחוי תאים (CFAV), נמצא כמעכב את התפשטות נגיף DENV וזיקה (ZIKV) ביתושים Aedes aegypti 9. לפיכך, פרוטוקול זה הוא גישה שימושית לבידוד וירוסים הקשורים ליתושים ויכול לסייע במחקר נוסף על התפלגות פתוגנים הקשורים ליתושים ושליטה במחלות המועברות על ידי יתושים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. דיגום ומיון יתושים

  1. לכדו את היתושים הבוגרים דרך מלכודות האור MXA-02 או מלכודות יתושים פחמן דו חמצני בשטח.
  2. הרגו את היתושים שנאספו על ידי טבילה בחנקן נוזלי10,11. העברתם למעבדה על ידי המערכת הלוגיסטית של שרשרת הקירור12.
    הערה: קרח יבש שימש בעיקר במערכת הלוגיסטית של שרשרת הקור.
  3. (אופציונלי) אם אתרי הדגימה היו בקרבת המעבדה, שלחו ישירות את היתושים החיים במלכודות הרשת למעבדה והרדימו אותם על ידי הקפאה בטמפרטורה של ≤-20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות4.
  4. בצע זיהוי מורפולוגי של היתושים שנאספו באמצעות ספר הכלים13 לסיווג וזיהוי יתושים.
    הערה: במידת הצורך, ניתן להשתמש ברקוד DNA כדי לסווג ולזהות יתושים14,15.
  5. בהתבסס על תאריכי הדגימה והאתרים, הקצו אותם לבריכות שונות, ולאחר מכן אחסנו אותם בצינורות של 2-5 מ"ל.
  6. ציירו טבלה כדי לתעד כל צינור עם מיני יתושים, מספר, קוד דגימה, תאריך ואתרים.
  7. הדפס את התוויות עם קודי דגימה והצמיד אותן לצינורות.
  8. שמור צינורות עם דגימות יתושים ב -80 ° C עד ניתוח נוסף.

2. טחינת יתושים

  1. הכניסו 20-50 יתושים לכל צינור סטרילי בנפח 2 מ"ל עם חרוזי קרמיקה בקוטר 3 מ"מ עם 1.5 מ"ל של תווך Roswell Park Memorial Institute (RPMI) המכיל 2% תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין B.
    הערה: יש לשמור את הצינורות על מגש קרח או ניס.
  2. הומוגניזציה של היתושים עם הומוגנייזר רקמות בטמפרטורה נמוכה על ידי טחינה במשך 30 שניות ב 70 הרץ ב 4 ° C במשך שלושה מחזורים16.
  3. צנטריפוגו את התערובות ב-15,000 × גרם למשך 30 דקות ב-4°C והעבירו את הסופרנאטנטים לצינורות חדשים.
  4. צנטריפוגה את supernatants שוב ב 15,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את פסולת יתושים12,17.
    הערה: במידת הצורך, ניתן לסנן את הסופרנאטנטים באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר.
  5. Aliquot את supernatants (P0) לתוך 2 מ"ל פקק בורג צינורות אחסון (200 μL לכל צינור) ולאחסן אותם ב -80 ° C.

3. הכנת תאים ואמצעי תחזוקת תרבית תאים

הערה: קו תאי יתוש C6/36 (חסר RNAi Aedes albopictus ) וקו תאי חוליות BHK-21 (כליה של אוגר תינוק) שימשו להגברה ולבידוד הנגיף.

  1. יש לחסן 1 × 106 תאי C6/36 לתוך בקבוק 2 בגודל 75 ס"מ עם 10 מ"ל של RPMI בינוני בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) ב-28°C באינקובטור לח 5% CO2.
  2. חסן 1 × 106 BHK-21 תאים לתוך בקבוק 2 75 ס"מ עם 10 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% FBS ו 1% P / S ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 לח.
    הערה: התאים עברו פעמיים או שלוש בשבוע17,18.
  3. זרעו את התאים בתרביתשל 75 ס"מ 2 בקבוקים (C6/36 או BHK-21 תאים) לתוך לוחות 24 בארות (C6/36 לכל באר: 1.4 × 105; BHK-21 לכל באר: 0.8 × 105).
  4. הניחו את הצלחות עם 24 הבארות ב-28°C או 37°C למשך הלילה.
  5. התבוננו בתאים מתחת למיקרוסקופ ואשרו אם מפגש התאים בכל באר הוא 80%-90%.
  6. הכינו את מדיום תחזוקת תרבית התאים (500 מ"ל).
    הערה: עבור C6/36, המדיום היה RPMI בינוני בתוספת 2% FBS ו 2% פניצילין-סטרפטומיצין-Amphotericin B פתרון. עבור BHK-21, המדיום היה DMEM בינוני בתוספת 2% FBS ו 2% פניצילין-סטרפטומיצין-Amphotericin B פתרון.

4. בידוד וירוסים

הערה: כל השלבים בוצעו במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2). דרישת רמת הבטיחות של מעבדת הבטיחות הביולוגית נקבעה על ידי הערכת סיכוני הבטיחות הביולוגית בהתבסס על תקנות של מדינות ואזורים שונים. התהליך חייב להתבצע בארון בטיחות ביולוגית.

  1. הסר את מדיום תרבית התאים מלוחות 24 הקידוחים והוסף 100 μL של מדיום תחזוקת תרבית התא ו 100 μL של supernatant של הומוגנאט יתוש (P0) לכל באר.
  2. יש לדגור על הצלחות בטמפרטורה של 28°C או 37°C למשך 60 דקות ולנער אותן בעדינות כל 15 דקות כדי למנוע התייבשות תאים.
  3. הסירו את הסופרנאטנט ושטפו כל אחד מהם היטב בעדינות עם 600 מיקרוליטר של מדיום תחזוקת תרבית תאים כדי להסיר את הלכלוך לחלוטין.
  4. הוסף 800 μL של אמצעי תחזוקה של תרבית תאים לכל באר ושמור את הצלחות באינקובטור 5% CO2 לח ב 28 ° C או 37 ° C במשך 7 ימים.
  5. עקוב אחר מצב התא של כל באר תחת המיקרוסקופ מדי יום15.
  6. אספו את הסופרנאטנטים של התאים (P1 supernatants) ביוםהשביעי ואחסנו את הסופרנאטנטים בטמפרטורה של -80°C.
  7. חזור על שלבים 4.1-4.6 2x כדי לקבל סופרנאטנטים P2 ו-P3.
    הערה: בשלב 4.3, שטיפה עדינה של כל באר עם 600 מיקרוליטר של אמצעי תחזוקה של תרבית תאים הייתה אופציונלית עבור P2 ו-P3.
  8. תלוי איזו באר מראה את ההשפעה הציטופתוגנית (CPE) - תאים מתים, פיקנוזיס, ומתנתקים מפני השטח; מיזוג עם תאים סמוכים ליצירת סינקטיה; או הופעתם של גופי הכללה גרעיניים או ציטופלזמיים – הוסיפו 300-400 מיקרוליטר של הסופרנאטנט של CPE זה היטב לכל באר של לוחות 6 בארות חדשים המכילים תאים (מפגש התאים היה 80%-90%) כדי להגביר מאוד את הנגיפים.
  9. אספו את הסופרנאטנטים והכניסו אותם לצינורות אחסון של 2 מ"ל פקק בורג (500 מיקרוליטר לצינור). אחסנו אותם בטמפרטורה של -80°C.
    הערה: לאחר שלושה דורות של מעבר רצוף בתאים, הדגימות שלא גרמו ל-CPE הושלכו. במידת הצורך, ניתן להגדיל את הדורות של מעברים רצופים בתאים.

5. איתור רצפים נגיפיים על ידי RT-PCR

  1. חלצו את סך כל הרנ"א מ-200 מיקרוליטר של הסופרנאטנט הנגיפי באמצעות ערכת מיני RNA נגיפי16.
    הערה: כאן, מערכת מיצוי חומצת גרעין אוטומטית שימשה לחילוץ RNA כולל בהתאם להוראות יצרן המכשיר.
  2. המר את הרנ"א ל-cDNA בהתאם להוראות ערכת RT-PCR באמצעות מכשיר PCR.
    1. הוסף 15 μL של RNA מעורבב עם 1 μL של פריימרים אקראיים לתוך צינור PCR. מניחים את הצינור בטמפרטורה של 70°C למשך 5 דקות ולאחר מכן מניחים אותו על קרח למשך 5 דקות.
    2. הוסף 5 μL של 5x buffer ו 25 μL של תערובת (10 mM dNTP, 40 U/μL RNase inhibitor, ו 200 U/μL M-MLV) לתוך הצינור ומניחים את הצינור על 42 ° C במשך 60 דקות ו 95 ° C במשך 10 דקות.
    3. יש לאחסן את הצינור בטמפרטורה של -20°C.
  3. השתמש בערכת PCR ובפריימרים אוניברסליים (טבלה 1) כדי לזהות וירוסים באמצעות PCR.
    1. עבור arboviruses, להגדיר את מערכת התגובה PCR (סה"כ 30 μL) עם הרכיבים הבאים: 3 μL של 10x Taq buffer, 3 μL של dNTP (1mM), 1 μL של פריימר קדמי (10 μm), 1 μL של פריימר הפוך (10 μm), 0.3 μL של Taq (10 U/μL), 19.7 μL של ddH 2 O, ו2μL של cDNA.
    2. לזיהוי flaviviruses, להגדיר את תהליך התגובה כמו: שלב 1: 35 מחזורים של 94 ° C עבור 30 שניות, 52 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 30 שניות; שלב 2: 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    3. לזיהוי אלפא-וירוסים, הגדר את תהליך התגובה כ: שלב 1: 35 מחזורים של 94 ° C עבור 30 שניות, 50 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 30 שניות; שלב 2: 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    4. לזיהוי של bunyaviruses, להגדיר את תהליך התגובה כמו: שלב 1: 35 מחזורים של 94 ° C עבור 30 שניות, 50 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 30 שניות; שלב 2: 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  4. זהה את מוצרי הגברה PCR על ידי 1% אלקטרופורזה ג'ל agarose ולשלוח אותם לניתוח ריצוף.
    הערה: אם התנאים מאפשרים זאת, הסופרנאטנטים יכולים לעבור ניתוח ריצוף של הדור הבא כדי לזהות וירוסים חדשים ולקבל את כל הגנום הנגיפי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר שחוסנו עם הסופרנאטנטים של ההומוגנטים של היתושים (P0), תאי C6/36 הציגו מרחב בין-תאי רחב, ותאי פילינג נצפו בשעה 120 שעות (איור 1A) בהשוואה לתאים הלא מחוסנים (קבוצת ביקורת) באותו זמן (איור 1B). לאחר הדגירה על תאי BHK-21 עם סופרנאטנטים P3, CPE נראה בתאי BHK-21 לאחר 48 שעות (איור 1C) בניגוד לתאי הבקרה (איור 1D). PCR בוצע כדי לקבוע מינים ויראליים. הפריימרים האוניברסליים לזיהוי פלאווי-וירוסים, אלפא-וירוסי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מטרת שיטה זו הייתה להציע דרך מעשית לבידוד נגיפים הקשורים ליתושים באמצעות קווי תאים שונים. חיוני להוסיף את האנטיביוטי-אנטי-מיקוטי (פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין) לסופרנאטנטים של ההומוגנטים של היתושים כדי למנוע זיהום על ידי חיידקים או פטריות. יתושים וסופרנאטנטים נגיפיים המתקבלים בשדה חייבים להיות בקירור בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים.

צעד קריטי נוסף בפרוטוקול היה השחיקה. דגימות יתושים צריך להיות אבקה ביסודיות ומאוחסן על קרח. רקמות יתושים טחונות מספיק י...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט תוכנית המדע והטכנולוגיה של ווהאן (2018201261638501).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.22 ומיקרו; מסנן ממברנה mMilliporeSLGP033RBסרטי פולימר עם דירוגי נקבוביות ספציפיים. להסרת פסולת תאים וחיידקים.
צלחות 24 בארותCORNING3524מיכלים לתא
75 ס"מ2 צלוחיותCORNING430641מיכלים לתא
צינור סטרילי 2 מ"ל עם חרוזי
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיתGibco15240-062אנטיביוטיקה במדיום למניעת זיהום מחיידקים ופטריות
חומצת גרעין אוטומטית מערכת מיצויNanoMagBioS-48
BHK-21 תאיםמרכז משאבי הנגיפים הלאומי, המכון לווירולוגיה
C6/36 תאיםמרכז משאבי הנגיפים הלאומי, מכון ווהאן לווירולוגיה
מכונה צנטריפוגליתHimacCF16RNמכשיר לצנטריפוגה של דגימות יתושים
CO2
דולבקו מדיום חיוני מינימלי (DMEM)מדיום GibcoC11995500BTלקווי תאים של בעלי חוליות
וירוסבידוד Cu20-XJ
סרום בקר פטה (FBS)Gibco10099141C

לספק תזונה לתאים
הומוגנייזר רקמות בטמפרטורה נמוכה במהירותגבוההbioKZ-III-Fמכשיר לטחינה
אינקובטור (28 מעלות; ג)PanasonicMCO-18ACלחממת תרביות תאים
(37 מעלות; ג)מכשיר PanasonicMCO-18ACלתרבית תאים
צינור PCR
Gibco15410-122אנטיביוטיקה במדיום למניעת זיהום מחיידקים
פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין B תמיסת15240096מקרר Gibco
(-80 & deg; C)sanyoMDF-U54V
מכון הזיכרון רוזוול פארק  בינוני (RPMI)GibcoC11875500BTבינוני לקווי תאים mosiquto
צינורות אחסון מכסה בורג (2 מ"ל)biofil 
FCT010005 עליים סטרילייםTiangenOSE-Y004חומרים מתכלים  לטחינת
TGrinder OSE-Y30 מטחנת רקמות חשמליתTiangenOSE-Y30מכשיר לטחינה
מיקרוסקופ החיתוךZEISSstemi508
מלכודות האור MXA-02Maxttrac
מכונתספיגת היתושיםNingbo Bangning
קצות הפיפטהAxygenTF
ערכת מיני RNA ויראלית QIAampQIAGEN52906
פינצטהDumont0203-5-PO
קרמיקה 3 מ"משל ווהאן אגם אבינור שירות מכשיר פניצילין-סטרפטומיצין

מקורות

  1. Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
  2. Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. Scientific Data. 7 (1), 342(2020).
  3. Atoni, E., et al. The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017). Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079(2019).
  4. Xia, H., et al. Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China. Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).
  5. Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review. Viruses. 13 (2), 265(2021).
  6. Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. Mosquito-specific viruses-transmission and interaction. Viruses. 11 (9), 873(2019).
  7. Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense. Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).
  8. Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus. Virology. 427 (2), 90-97 (2012).
  9. Baidaliuk, A., et al. Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo. Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).
  10. Atoni, E., et al. Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China. Viruses. 10 (1), 30(2018).
  11. Xia, H., et al. First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China. Viruses. 10 (10), 555(2018).
  12. Shi, C., et al. Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes. mSystems. 5 (5), 00640(2020).
  13. Zhou, M., Chu, H. Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , Suzhou University Press. (2019).
  14. Wang, G., et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. Plos One. 7 (10), (2012).
  15. Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
  16. Huang, Y., et al. In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides. Viruses. 14 (6), 1298(2022).
  17. Zhao, L., et al. Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China. Frontiers in Microbiology. 10, 1963(1963).
  18. Ren, N., et al. Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China. Journal of General Virology. 102 (9), 001645(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

BHK 21C6 36
בידוד וירוסים הקשורים ליתושים מיתושים שנאספו בשטח
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.