טכניקות מולקולריות ואימונולוגיות במודל עכבר מהונדס גנטית של גידול סטרומלי במערכת העיכול

Summary

מטרת כתב יד זה היא לתאר את מודל העכבר ^{Kit V558Δ/+} ואת הטכניקות לניתוח ועיבוד מוצלחים של דגימות עכברים.

Abstract

גידול סטרומלי במערכת העיכול (GIST) הוא הסרקומה האנושית הנפוצה ביותר והוא מונע בדרך כלל על ידי מוטציה אחת בקולטן KIT. על פני סוגי גידולים, פותחו מודלים רבים של עכברים על מנת לחקור את הדור הבא של הטיפולים בסרטן. עם זאת, ב- GIST, רוב מחקרי in vivo משתמשים במודלים של עכברי קסנוגרפט שיש להם מגבלות מובנות. כאן, אנו מתארים מודל עכברי בעל יכולת חיסונית, מהונדס גנטית, של גידול סטרומלי במערכת העיכול עם מוטציה של Kit^V558Δ/+ . במודל זה, KIT המוטנטי, האונקוגן האחראי על רוב ה-GISTs, מונע על ידי המקדם האנדוגני שלו המוביל ל-GIST המחקה את המראה ההיסטולוגי ואת החדירה החיסונית שנראית ב-GISTs אנושיים. יתר על כן, מודל זה שימש בהצלחה כדי לחקור הן טיפולים מולקולריים ממוקדים והן טיפולים חיסוניים. כאן, אנו מתארים את הרבייה והתחזוקה של מושבת ^{עכברים Kit V558Δ/+} . בנוסף, מאמר זה מפרט את הטיפול והרכש של GIST, ניקוז בלוטות לימפה מזנטרית, וצקום צמוד בעכברי Kit^V558Δ/+ , כמו גם הכנה לדוגמה לניתוחים מולקולריים ואימונולוגיים.

Introduction

GIST היא הסרקומה הנפוצה ביותר בבני אדם עם שכיחות של כ -6,000 מקרים בארצות הברית של אמריקה¹. נראה כי מקורו של GIST בתאי קוצב הלב במערכת העיכול הנקראים תאי הביניים של קאג'אל, והוא מונע בדרך כלל על ידי מוטציה בודדת בטירוזין קינאז KIT או PDGFRA². ניתוח הוא עמוד התווך של הטיפול ב- GIST ויכול להיות מרפא, אך חולים עם מחלה מתקדמת עשויים להיות מטופלים עם מעכב טירוזין קינאז (TKI), imatinib. מאז הצגתו לפני למעלה מ-20 שנה, אימטיניב שינתה את פרדיגמת הטיפול ב-GIST, ושיפרה את ההישרדות במחלות מתקדמות מ-1 ליותר מ-5 שנים ^3,4,5

Protocol

כל העכברים שוכנו בתנאים נטולי פתוגנים באוניברסיטת פנסילבניה על פי הנחיות NIH ובאישור אוניברסיטת פנסילבניה IACUC. המתת חסד בוצעה בעקבות נהלי ההפעלה הסטנדרטיים של משאבי בעלי חיים במעבדה של אוניברסיטת פנסילבניה.

1. ערכה^V558Δ/+ גידול עכברים

1. החזירו את עכברי ה-Kit^V558Δ/+ יותר מ-10 פעמים לרקע C57BL/6J באמצעות עכברי C57BL/6J. לשם כך, מגדלים את זכר עכברי Kit^V558Δ/+ עם נקבת עכברי C57BL/6J ביחס של 1:2.
   הערה: הגנוטיפ של הערכה ההומוזיגוטית^{V558Δ/V558Δ} היא קטלנית ברחם. ניתן לגדל נקבות קיט^V558Δ/+

Results

מודל העכבר ^{Kit V558Δ/+} מאפשר לחקור טיפולים במודל עכברים אימונו-תחרותי. לערכה^V558Δ/+ לעכברים יש תוחלת חיים ממוצעת של 8 חודשים עקב חסימת מעיים מתקדמת (איור 4). גידולים מ-Kit^V558Δ/+ עכברים מבטאים סמנים קנוניים של GIST כולל הטירוזין קינאז KIT ותעלת הטרנס-ממברנה DOG1 (איור 5), כמו גם גורם השעתוק ETV1 (לא מוצג). ניתן לחקור גידולים לשינויים במ.......

Discussion

מודל העכבר ^{Kit V558Δ/+} הוא כלי מחקר רב עוצמה בניתוח מולקולרי ואימונולוגי של GIST. למרות שאסטרטגיית הרבייה דורשת צלב יחיד, שימוש בקבוצת עכברים ^{Kit V558Δ/+} בניסויים המנתחים את תגובת הגידול דורש רבייה נרחבת. עכברים צריכים להיות מותאמי גיל ומין כדי להבטיח משקל גידול דומה, ו -10% מהעכברים מתים לפני גיל 8 שבועות כאשר הגידולים נוצרים. אסטרטגיות רבייה פחות נרחבות אפשריות אם משתמשים בטכניקות הדמיה מתקדמות כגון CT או MRI כדי לעקוב אחר נפח הגידול בתוך עכברים בודדים. אף על פי כן, עכברי Kit.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מסנן 100 מיקרון	EMSCO	1194-2360
1x מאגר ליזה RBC	Life Technologies	00-4333-57
מזרק 3 מ"ל	Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences	14823435
4– 15% ג'ל חלבון טרומי Mini-PROTEAN TGX, 10 בארות, 30 ומיקרו; l	Bio-Rad	4561083
4% תמיסת פרפורמלדהיד	תרמו פישר סיינטיפיק	AAJ19943K2
מסנן 40 מיקרון	EMSCO	1194-2340
5M NaCl	Sigma Aldrich	S6546
מסנן 70 מיקרון	EMSCO	1194-2350
נוגדן AKT (C67E7)	איתות תאים	4691
עכברי C57BL / 6J			ג'קסון
קולגנאז IV	סיגמא אולדריץ'	C5138
מעכב פרוטאז מיני EDTA ללא EDTA שלם	תומאס סיינטיפיק	C852A34
הרוזנת II מונה תאים אוטומטי	תרמו פישר
תרמו	פישר מדעי / אקסל אינטרנשיונל	14-840-00
Dnase I	תומאס סיינטיפיק	C756V81
Dog1 נוגדן	abcam	ab64085
EDTA	Sigma Aldrich	E9884
ERK נוגדן (p44/42)	איתות סלולרי	9102
FBS	תומאס סיינטיפיק	C788U23
תוכנת FIJI	פיג'י		https://imagej.net/software/fiji
פישרברנד 850 הומוגנייזר	תרמו פישר סיינטיפיק	15-340-169
HBSS			התאים של אוניברסיטת פנסילבניה
Imatinib mesylate	Selleck Chemicals	S1026
KIT נוגדן (D13A2)	איתות תאים	3074
KitV558Δ/+ גנוטיפ	טרנסנטיקס
צינורות מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
ערכת זיהוי חיסוני של עכבר על עכבר,	מעבדות וקטור	BMK-2202
קרום ניטרוצלולוזה, חתוך מראש, 0.45 ומיקרו; m	Rio-Rad	1620145
חלב יבש ללא שומן	תרמו פישר Scientific	NC9121673
Nonidet P 40 תחליף	סיגמא אולדריץ'	74385
p-AKT נוגדן (S473)	איתות תאים	4060
p-ERK נוגדן (p44/42)	איתות תאים	9101
p-KIT נוגדן (Y719)	איתות תאים	3391
מעכב פרוטאז PMSF	Thermo Fisher Scientific	36978
Proeinase K	Thermo Fisher Scientific	BP170050
צינורות בדיקת פוליסטירן תחתון עגול (FACS)	בז / תרמו פישר סיינטיפיק	14-959-2A
RPMI	מרכז
נתרן פלואוריד (NaF)	סיגמא אולדריץ'
נתרן אורתוונדאט (Na3VO4)	Sigma Aldrich	S6508
SuperSignal West Dura מצע משך מורחב	Thermo Fisher Scientific	34076
TBS buffer (10x)	של מרכז
(100 מ"מ)	Thermo Fisher Scientific/Falcon	08-772E
TrisHCL	Thermo Fisher Scientific	BP1757500
Tween 20	Rio-Rad	1706531
פלטפורמת vivaCT 80	Scanco Medical