הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד של פרדיפוציטים מעוברי אפרוחי ברוילר

2.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63861

⸱

4 באוגוסט 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Animal Science, University of Tennessee

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה לבידוד פראדיפוציטים מרקמת שומן בעוברי ברוילר. שיטה זו מאפשרת בידוד עם תפוקה גבוהה, תרבית ראשונית והתמיינות אדיפוגנית של פראדיפוציטים. צביעת O אדום שמן וכתם שומנים/דנ"א מדדו את היכולת האדיפוגנית של תאים מבודדים המושרים עם אמצעי התמיינות.

תקציר

פרדיפוציטים ראשוניים הם מערכת ניסויים רבת ערך להבנת המסלולים המולקולריים השולטים בהתמיינות אדיפוציטים ובחילוף החומרים. עוברי עוף מספקים את ההזדמנות לבודד פראדיפוציטים מהשלב המוקדם ביותר של התפתחות השומן. תא ראשוני זה יכול לשמש לזיהוי גורמים המשפיעים על התפשטות פראדיפוציטים והתמיינות אדיפוגנית, מה שהופך אותם למודל רב ערך למחקרים הקשורים להשמנת יתר בילדות ושליטה בתצהיר שומן עודף בעופות. הצמיחה המהירה של רקמת השומן לאחר הלידה מבזבזת למעשה את ההזנה על ידי הקצאתה הרחק מצמיחת השרירים בתרנגולות ברוילר. לכן, שיטות להבנת השלבים המוקדמים ביותר של התפתחות רקמת השומן עשויות לספק רמזים לווסת נטייה זו ולזהות דרכים להגביל את התפשטות השומן בשלב מוקדם בחיים. המחקר הנוכחי נועד לפתח שיטה יעילה לבידוד, לתרבית ראשונית ולהבחנה אדיפוגנית של פראדיפוציטים שבודדו מרקמת שומן מתפתחת של עוברי אפרוחים מסחריים מסוג ברוילר (סוג בשר). ההליך עבר אופטימיזציה כדי להניב תאים עם כדאיות גבוהה (~ 98%) ויכולת מוגברת להתמיין לאדיפוציטים בוגרים. שיטה פשוטה זו של בידוד, תרבית והתמיינות של פראדיפוציטים עובריים תומכת בניתוחים פונקציונליים של גדילת השומן והתפתחותו בתחילת החיים.

מבוא

השמנת יתר היא איום בריאותי עולמי על מבוגרים וילדים כאחד. ילדים הסובלים מעודף משקל או מהשמנת יתר נמצאים בסיכון גבוה פי חמישה בערך להיות שמנים כמבוגרים, מה שמציב אותם בסיכון מוגבר באופן משמעותי למחלות לב וכלי דם, סוכרת ותחלואה נלווית רבים אחרים. כ -13.4% מהילדים בארה"ב בגילאי 2-5 סובלים מהשמנת יתר1, מה שממחיש כי הנטייה לצבור עודפי שומן בגוף יכולה להיות מופעלת בשלב מוקדם מאוד בחיים. מסיבות שונות מאוד, הצטברות של עודף רקמת שומן היא דאגה עבור תרנגולות broiler (סוג בשר). ברוילרים מודרניים יעילים להפליא אך עדיין צוברים יותר שומנים ממה שנחוץ מבחינה פיזיולוגית 2,3. נטייה זו מתחילה זמן קצר לאחר הבקיעה ולמעשה מבזבזת מזון, מרכיב הייצור היקר ביותר, על ידי הקצאתו הרחק מצמיחת השרירים. לכן, הן עבור ילדים והן עבור תרנגולות broiler, אם כי מסיבות שונות מאוד, יש צורך להבין גורמים המשפיעים על התפתחות רקמת השומן ולזהות דרכים להגביל את התפשטות השומן בשלב מוקדם בחיים.

אדיפוציטים נוצרים מפראדיפוציטים, תאי גזע שמקורם ברקמת השומן שעוברים התמיינות כדי לפתח תאי שומן בוגרים המאחסנים שומנים. לפיכך, פראדיפוציטים במבחנה הם מודל ניסיוני רב ערך למחקרי השמנת יתר. תאים אלה, המבודדים מחלק כלי הדם הסטרומיים של מחסני השומן, יכולים לספק הבנה בסיסית של מסלולים מולקולריים השולטים בהתמיינות האדיפוציטים ובחילוף החומרים 4,5. עוברי אפרוחים הם מודל ניסיוני נוח במחקרים התפתחותיים מכיוון שצבירת ביציות בלוח הזמנים הרצוי מקלה על מניפולציה ניסיונית, שכן היא מאפשרת להשיג עוברים ללא הקרבה של האם כדי לצפות בסדרה של שלבים התפתחותיים של עוברים. יתר על כן, הליכים כירורגיים מסובכים ותקופות זמן ממושכות אינם נדרשים כדי להשיג עוברים ביחס למודלים גדולים יותר של בעלי חיים. לכן, עובר האפרוח מציג הזדמנות להשיג פרדיפוציטים מהשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות רקמת השומן. רקמת שומן תת עורית נראית באפרוח סביב היום העוברי 12 (E12) כמחסן מוגדר בבירור הממוקם סביב הירך. מחסן זה מועשר בפראדיפוציטים מתרבים מאוד שעוברים באופן פעיל התמיינות תחת רמזים התפתחותיים ליצירת אדיפוציטים בוגרים 6,7. תהליך ההבחנה האדיפוגנית דומה בין תרנגולות לבני אדם. לכן, פראדיפוציטים המבודדים מעוברי אפרוחים יכולים לשמש כמודל דו-תכליתי למחקרים הרלוונטיים לבני אדם ועופות. עם זאת, התשואה של preadipocytes יורד עם ההזדקנות ככל שהתאים גדלים לתוך אדיפוציטים בוגרים5.

הפרוטוקול הנוכחי מייעל את הבידוד של פראדיפוציטים מרקמת השומן במהלך השלב (E16-E18) שבו התמיינות אדיפוגנית והיפרטרופיה של אדיפוציטים נמצאים בשיאם בעוברי אפרוחי ברוילר8. הליך זה יכול להעריך את ההשפעות של גורמים שאליהם העובר המתפתח נחשף באובו, כגון תזונת התרנגולת, על התפתחות אדיפוציטים ופוטנציאל אדיפוגני ex vivo. הוא יכול גם לבחון את ההשפעה של מניפולציות שונות (למשל, היפוקסיה, תוספות מזינות, אגוניסטים פרמקולוגיים ואנטגוניסטים) על אדיפוגנזה או על ה'אומות' השונות (למשל, תעתיק, מטבוליום, מתילום) של אבות אדיפוציטים. כייצוג של השלב המוקדם ביותר של היווצרות השומן, תאים המתקבלים באמצעות פרוטוקול זה הם מודלים חשובים למחקרים הרלוונטיים לעופות ולבני אדם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת טנסי. ביצי ברוילר מסחריות מופרות טריות (קוב 500) התקבלו ממדגרה מקומית. ביצים דוגרו בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס עם 60% לחות יחסית עד לניתוחים בימים העובריים 16-18 (E16-E18). רקמת השומן נאספה מהמחסן התת עורי (עצם הירך).

1. הכנה לבידוד ולתרבות

  1. הכינו את מכסה המנוע התרבותי ואת הכלים.
    1. לפני תחילת דיסקציות, הקימו פינת עבודה במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. יש לחטא את אזור העבודה ואת כל המכשירים על ידי התעסקות עם 70% אתנול. לבצע את כל ההליכים באמצעות חומרים סטריליים.
      הערה: תמיד לטבול את המיכלים והמכשירים עם 70% אתנול לפני שמניחים אותם בחזרה למכסה המנוע של תרבית התאים. מומלץ למקם מעקר כלי ספסל במכסה המנוע, כך שניתן יהיה לעקר בקלות מכשירים בין עוברים.
      אזהרה: בעת שימוש במעקר מכשירים, יש לקרר את המכשיר החם כראוי כדי למנוע פגיעה בכוויות ופגיעה ברקמות. מומלץ זמן קירור מינימלי של 3 דקות. ספוגית עם 70% אתנול לפני השימוש.
    2. הרכיבו את המכשירים והכלים הבאים במכסה המנוע: מלקחיים ישרים (120 מ"מ), פינצטה (110 מ"מ), שני זוגות של מלקחיים מעוקלים (100 מ"מ), שני זוגות של מספריים ישרים (140 מ"מ), מספריים כירורגיים מעוקלים (115 מ"מ), מסננת רקמות (רשת ניילון 250 מיקרומטר), מסננת תאים (רשת ניילון 40 מיקרומטר), צינורות צנטריפוגה חרוטיים (15 מ"ל ו-50 מ"ל), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות קטנה (100 מ"ל), תרסיס אתנול 70% וגאזה סטרילית, מגבת נייר ומגב ספסל (ראו טבלת חומרים).
  2. הכן פתרון אנזימטי, מדיית איסוף ומדיה תרבותית בהתאם לשלבים הבאים.
    הערה: הכינו פתרונות מראש ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. יש להניח את המדיה על קרח לפני איסוף הרקמות. כל הריאגנטים המשמשים בשלב זה מפורטים בטבלת החומרים.
    1. הכן מדיה המשמשת הן לאיסוף רקמת שומן והן להכנת תמיסה אנזימטית על ידי תוספת DMEM/F12 (מדיום הנשר המהונדס של דולבקו עם 2.50 מ"מ של L-גלוטמין ו-15 mM של חיץ HEPES) עם 2.5 מיקרוגרם/מ"ל של אמפוטריצין B ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), 100 U/mL. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      הערה: מדיה זו נשארת יציבה במשך שנה אחת כאשר היא מאוחסנת בטמפרטורה של 4 °C (64 °F).
    2. הכינו תמיסת עיקור על ידי דילול בטאדין ל-20% (v/v) ב-1x PBS (תמיסת מלח מועשרת בפוספט בעלת pH 7.4, ללא סידן, מגנזיום או פנול אדום) עם 2.5 מיקרוגרם/מ"ל של אמפוטריצין B. יש לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      הערה: הפתרון יציב במשך שנתיים כאשר הוא מאוחסן ב-4 °C (4 °F).
    3. הכינו תמיסה אנזימטית על ידי המסת קולגן מסוג 1 (1 מ"ג/מ"ל) ב-DMEM/F12 עם 2.5 מיקרוגרם/מ"ל של אמפוטריצין B ו-1x P/S (שלב 1.2.1). הכינו תמיסת קולגן טרייה ושמרו אותה על קרח במהלך ניתוחים. כ-10 דקות לפני השימוש, חימום מוקדם על ידי דגירה של תמיסה זו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים כדי להתחיל בפעילות האנזימטית שלה.
      הערה: יש צורך בכ-1 מ"ל של תמיסת קולגן (1 מ"ג/מ"ל) לכל 100 מ"ג של רקמת שומן.
    4. הכן מדיית צמיחה המשמשת לציפוי ולהפצה על-ידי הוספת מדיית DMEM/F12 עם 1x P/S ו-10% FBS. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      הערה: הפתרון יציב במשך שנה אחת כאשר הוא מאוחסן בטמפרטורה של 4 °C (64 °F).
    5. הכינו תמיסת כביסה על ידי הוספת 1x PBS עם 2.5 מיקרוגרם/מ"ל של אמפוטריצין B. התאימו את התמיסה ל-pH 7.4 הרצוי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      הערה: הפתרון יציב במשך שנתיים כאשר הוא מאוחסן ב-4 °C (4 °F).

2. איסוף רקמות שומן ועיכול

  1. להרדים את העובר.
    1. ביום העוברי 16, להסיר את הביצים מן האינקובטור. המקור הפוטנציאלי העיקרי לזיהום מיקרוביאלי הוא פני השטח של הביצית; לכן, יש לטבול את הביצים בגאזה סטרילית ספוגה ב-70% אתנול לפני פיצוחן. לאחר ההסתערות, הניחו את הביצה בצורה אנכית עם הקצה המחודד כלפי מטה על קטנה (100 מ"ל) מרופדת במגבות נייר כדי לרפד את הביצה מהזכוכית.
    2. באמצעות ידית המלקחיים, שוברים ביצה על ידי הקשה על הקצה הקהה של הביצה. הסר בזהירות את קליפת הביצית כדי ליצור פתח גדול מספיק כדי להסיר את העובר (שלב 2.1.3). קרעו בעדינות את קרום הקליפה הלבנה כדי לחשוף את העובר (איור 1A). פירס את האניון בזהירות באמצעות פינצטה סטרילית (איור 1B).
      הערה: שק מי השפיר הוא קרום שקוף מלא בנוזל מי שפיר התוחם את העובר.
    3. מוציאים את העובר מהביצית על ידי אחיזה קלה בצוואר העובר באמצעות מלקחיים ישרים. נתקו את שק החלמון כדי לנתק אותו מהעובר, ולהעביר את העובר לצלחת פטרי 100 מ"מ.
    4. עריפת ראשים מיד באמצעות מספריים ומלקחיים כירורגיים.
  2. בצע את איסוף רקמות השומן.
    1. מבשלים את גוף העובר עם 70% אתנול ומשפשפים את פני העור בעדינות עם גזה סטרילית כדי להסיר נוצות, מכיוון שהן יכולות להפריע לסינון בשלבים מאוחרים יותר לאחר העיכול. השתמשו במגבי ספסלים כדי למנוע מהעור והנוצות לגעת ברקמות שנאספו.
    2. חתכו את העור בין הרגליים לאזור הבטן כדי לחשוף את זוג מחסני שומן הירך.
    3. החזיקו את העור סביב הרגל באמצעות מלקחיים מעוקלים ביד אחת. הסר בעדינות את השומן התת עורי הירך ביד השנייה, תוך שימוש במלקחיים מעוקלים כדי למשוך בעדינות את המחסן הרחק מהרגל.
      הערה: יש רקמת חיבור קטנה יחסית שנצמדת למשטח השומן לרגל, וכל כרית השומן צריכה להיות ניתנת להסרה בחתיכה אחת באמצעות מלקחיים בלבד. ניתן להקל על כך על ידי החזקת המלקחיים לאחור, כך שהחלקים המעוקלים (ולא הקצוות) מהדקים את כרית השומן להסרה.
      1. במידת הצורך, חתכו את כרית השומן עם מספריים מעוקלים. חזרו על הפעולה עם כרית השומן השנייה ועוברים נוספים לפי הצורך.
        הערה: ניתן להשיג בסך הכל 80 מ"ג של שומן תת-עורי מרוב העוברים ב-E16 (איור 1C). זה בדרך כלל מניב ~ 1 x 106 תאים, מספיק כדי לצלוח בקבוק T-25 אחד. זה עשוי להיות שימושי בשלב זה לשקול רפידות שומן מכמה עוברים כדי להעריך את כמות החומר ההתחלתי, שכן משקלי כרית השומן יכולים להשתנות על פני קווי ברוילר ספציפיים, ובשל גורמים בלתי נשלטים, כגון גיל תרנגולות מגדלות ותזונה. שומן תת עורי נאסף באופן שגרתי מחמש ביצים כדי להבטיח תפוקה מספקת של תאים לציפוי בצלוחיות מרובות.
    4. מעבירים את הרקמות לכ-5 מ"ל של מדיית איסוף בצינור של 15 מ"ל וחוזרים על דיסקציה של שאר הביצים.
    5. יש לשטוף בקצרה את רפידות השומן שנאספו על ידי העברתן לצלחת פטרי 60 מ"מ המכילה תמיסת עיקור ומערבולת את התבשיל מספר פעמים.
    6. יש לשטוף את תמיסת העיקור על ידי העברת רפידות השומן לצלחת פטרי 60 מ"מ המכילה 1x PBS. מערבלים בעדינות. חזור על שלב זה על ידי מעבר לצלחת פטרי 60 מ"מ שנייה המכילה 1x PBS.
  3. בצע עיכול אנזימטי ובידוד פראדיפוציטים בעקבות השלבים הבאים.
    1. מעבירים את רקמות השומן לצינור של 15 מ"ל המכיל כ-1 מ"ל של תמיסה אנזימטית שחוממה מראש לכל 100 מ"ג רקמה. טבלו זוג מספריים ארוכים וישרים בצינור וטחנו בעדינות את רקמות השומן בתמיסה לחתיכות קטנות ככל האפשר (כ-1 מ"מ3) (איור 2A).
      הערה: תפוקת התאים תפחת אם הרקמות אינן טחונות היטב.
    2. מעבירים את הרקמה הטחונה והתמיסה האנזימטית לבקבוקון אוטוקלאב 25 מ"ל. עוטפים את הבקבוקון בסרט פרפין. מניחים על שייקר מסלולי בתוך אינקובטור ורועדים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך שלב העיכול.
      הערה: לחלופין, השתמשו באמבט מים רועד. עם כל אחת מהגישות, המהירות אמורה להספיק כדי למנוע מפיסות רקמה להתיישב בתחתית הבקבוקון, אך אסור שתהיה מהירה כל כך עד שחלקים נדחפים לחלק העליון של הבקבוקון ונדבקים לזכוכית, או שהנוזל מצטבר על כיסוי סרט הפרפין.
    3. לאחר כ-30 דקות, חתכו את קצהו של קצה פיפטה בגודל 1 מ"ל לקוטר של כ-3 מ"מ. פיפטה את תערובת הרקמה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לעזור לשחרר את התאים מרקמת השומן. מחזירים את הבקבוקון לאינקובטור/אמבט המים ומחדשים את הרעידות.
    4. לאחר 15 דקות נוספות, בדוק את הבקבוקון לשלמות העיכול. לאחר הסרת הבקבוקון מהשייקר, תיווצר שכבה של תאים לבנבנים בחלק העליון של שכבת הנוזל. אם עדיין נותרו שברי רקמות, חותכים את הקצה מקצה פיפטה אחר ומקטרים בעדינות את התערובת למעלה ולמטה, ואז ממשיכים לרעוד במשך 15 דקות נוספות.
      הערה: תערובת רקמה/קולגן מעושלת לחלוטין נראית כמו צ'ים חלביים. בדרך כלל, הרקמה מתעכלת מספיק לאחר שעה אחת של רעידות עדינות. אם נותרו שברים רבים בשלב זה, הדבר עשוי להצביע על בעיה באנזים הקולגנאז שבו נעשה שימוש. טלטול מתמיד יכול להגדיל את התשואה; עם זאת, חשיפה ממושכת לאנזים ולעקה הפיזית עלולים גם הם לפגוע בתאים.
    5. לאחר העיכול, פיפט בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. סנן דרך מסננת רקמה של 250 מיקרומטר לתוך צינור של 15 מ"ל על ידי צנרת כדי להסיר פיסות של רקמה לא מעוכלת ופסולת.
      1. שטפו את הבקבוקון עם 4 מ"ל של מדיית גדילה על ידי צנרת כדי להסיר תאים שעשויים להיות מודבקים לזכוכית, ולסנן לתוך אותו צינור 15 מ"ל. יש לשטוף את המסננת עם מדיית גדילה נוספת על ידי צנרת כדי לשחרר את כל התאים הכלואים, עד לנפח כולל של 14 מ"ל.
    6. גלול את שבר התא על ידי צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ב- RT (7 דקות עבור צינור 50 מ"ל).
      הערה: תמיד לטבול את הצינורות עם 70% אתנול לפני שתחזור למכסה המנוע של תרבית התאים.
    7. לשאוף את הסופרנאטנט. היזהרו לא להיפטר מכדור התא. יש לבצע החייאה עדינה של הכדור ב-1 מ"ל של חיץ ליזיס של תאי דם אדומים (ראו טבלת חומרים) על ידי צנרת למעלה ולמטה, ולדגום במשך 5 דקות ב-RT. התמיסה תהפוך לאדדמה כאשר תאי הדם האדומים יתכרכמו (איור 2B).
      הערה: מקם את מאגר ה-RBC lysis ב-RT לפני השימוש. לתרנגולות יש תאי דם אדומיםגרעיניים 9, והם נצמדים לכלי תרבית רקמה יחד עם פרדיפוציטים. מאגר lysis RBC משמש כדי לשקר תאים אלה כדי למנוע את ההפרעה שלהם לספירות תאים מדויקות.
    8. הוסיפו 5 מ"ל של מדיית גדילה לצינור המכיל את התאים כדי לדלל את מאגר הליזיס ולערבב בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה. באמצעות פיפטה, מסננים דרך מסננת של 40 מיקרומטר לתוך צינור חדש של 50 מ"ל ושוטפים את המסננת עם תוספת של 5 מ"ל של מדיית גדילה.
    9. תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 300 x g במשך 7 דקות ב RT. בזהירות לשאוף את supernatant ולהחיות את כדור התא הנותר ב 1 מ"ל של מדיית גדילה על ידי pipetting למעלה ולמטה.
      1. השתמש בהמוציטומטר, מונה תאים וכתם כחול טריפאן כדי לספור תאים ולקבוע את כדאיות התאים. קח 10 μL של דגימה וערבב עם 10 μL של טריפאן כחול על ידי pipetting. טען 10 μL של התערובת על ההמטוציטומטר ומדוד10.
        הערה: ניתן להגדיל את מהירויות הצנטריפוגה ל- 600 x g אם כדורי תאים מספיקים אינם נראים בקלות לאחר הספין הראשוני.

3. זריעה ותרבית של פראדיפוציטים

  1. זרע ~ 1 x 106 תאים ב 4 מ"ל של מדיית גדילה מחוממת מראש בבקבוק T-25. עקוב אחר אותה צפיפות ציפוי אם אתה משתמש בסוגים אחרים של כלי תרבית. מניחים באינקובטור תרבית רקמה ומניחים להתחבר למשך הלילה.
    הערה: התאים עוברים תרבית באינקובטור של 38 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה לחה של 5% CO2. הטמפרטורה האופטימלית לצמיחת תאי העופות11 היא 38 מעלות צלזיוס, והם גדלים לאט ב-37 מעלות צלזיוס.
  2. למחרת, שאפו לתקשורת ושטפו בעדינות את התאים עם 1x PBS על ידי צנרת כדי להסיר תאים לא מחוברים או מתים. החלף ב-4 מ"ל של מדיית צמיחה טרייה. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ. תאים צריכים להיות בעלי צורה מסתובבת, כמו פיברובלסטים (איור 2A).
    הערה: בדרך כלל, פראדיפוציטים מתחברים די מהר (תוך מספר שעות). ניתן לאשר את ההצלחה או הכישלון של בידוד התא בשלב זה (לאחר 24 שעות).
  3. החלף ב-4 מ"ל של מדיית גדילה טרייה כל יומיים ותאי תת-תרבות או קריופרציה כשהם מגיעים למפגש של 70%-80% (איור 3C).

4. תת-תרבות ושימור בהקפאה

  1. שאפו לתקשורת ישנה ושטפו בעדינות תאים עם 4 מ"ל של 1x PBS על ידי צנרת. שאפו ל-PBS, הוסיפו 2 מ"ל של 0.1% טריפסין כדי לכסות את פני התא בבקבוק T-25 (התאימו את הנפח בהתאם לכלי תרבית אחרים), ואז דגרו במשך 3-4 דקות בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס.
    הערה: שימו לב אם התאים מנותקים מלוח התרבית. הקישו בעדינות על צלחת התרבית כדי לסייע בניתוק התאים. דגירה של תאים עם טריפסין במשך זמן רב מדי תפגע בתאים.
  2. הוסיפו נפח שווה ערך של מדיית גדילה שחוממה מראש כדי לעכב את תגובת הטריפסין. פיפטה על פני התא מספר פעמים, הטיית הצלחת כדי לשחרר את התאים הנותרים.
  3. מעבירים את מתלי התא לצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-RT (7 דקות לצינור 50 מ"ל). לשאוף את הסופרנאטנט.
  4. אם תת-תרבות, גלולת החייאה ב-1 מ"ל של מדיית גדילה על ידי צנרת למעלה ולמטה. ספרו את התאים כמתואר בשלב 2.3.9.1 ולאחר מכן חזרו בתשובה באמצעות אותה צפיפות ציפוי ששימשה בתחילה בשלב 3.1.
  5. אם אתה שומר בהקפאה, הכן 4 מ"ל של מדיה הקפאה עבור בקבוק T-25 עם 90% מפגש.
    הערה: הקפאת מדיה מורכבת מ-10% DMSO, 30% FBS ו-60% DMEM/F12.
  6. כדורית תא Resuspend במדיה קפואה ולהעביר 1 מ"ל של מדיה הקפאה לתוך cryovial. הקפיאו את ה-cryovials באיטיות ל-1°C/min-באמצעות מיכל הקפאה. הניחו את המיכל במקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולאחר מכן העבירו אותו לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
    הערה: פראדיפוציטים שהוצבו כהלכה בהקפאה שומרים על יכולת הקיום שלהם במשך 3 שנים לפחות ובדרך כלל פועלים כמו תאים מבודדים טריים כאשר הם מופשרים ומצופים.

5. הבחנה אדיפוגנית

הערה: ניתן להשתמש ב-2% צלחות מצופות ג'לטין כדי לשפר את הידבקות התאים.

  1. הכינו תמיסת ג'לטין של 2% (w/v) (ראו טבלת חומרים) במים מזוקקים. Autoclave ב 121 °C (64 °F), 15 psi במשך 30 דקות כדי לעקר. ציפוי משטח תרבית עם 5-10 מיקרול של תמיסת ג'לטין / ס"מ2 (כלומר, 100-200 מיקרוגרם / ס"מ2). מערבלים בעדינות כדי לצפות באופן שווה את פני השטח.
  2. בדוק צלחות עבור אפילו התפשטות של תמיסת הג'לטין מאז אזורים מסוימים עשויים להישאר לא מצופה בתחילה. אפשרו לצלחת המצופה בג'לטין להישאר ב-RT למשך שעה אחת לפחות. הסר את כל נפח תמיסת הג'לטין מהבארות.
    הערה: זה ישאיר מעיל ג'לטין דק בתחתית הבארות / הכלים. ניתן לעשות שימוש חוזר בתמיסת ג'לטין מספר פעמים (לפחות 10 פעמים) מבלי לשנות את הידבקות התאים וצמיחתם. אפשרו לכלים המצופים בג'לטין להישאר במכסה התרבית למשך 30 דקות לפחות לפני ציפוי התאים.
  3. לגרום לפרדיפוציטים של העוף לעבור התמיינות אדיפוגנית על ידי השלמת מדיית גדילה עם חומצות שומן. כדי להכין מדיית התמיינות אדיפוגנית (ADM), תוסף DMEM/F12 עם 10% סרום עוף, 1x חומצה לינולאית-חומצה אולאית-אלבומין (9.4 מיקרוגרם/מ"ל) ו-1x P/S (ראו טבלת חומרים). הפוך את ADM לרענן וחם לפני השימוש.
    הערה: פראדיפוציטים של עוף מושרים בדרך כלל לעבור התמיינות אדיפוגנית על ידי תוספת מדיה עם חומצות שומן במקום קוקטיילים הורמונליים המשמשים בדרך כלל לאדיפוציטים ממינים אחרים12.
  4. לגרום להתמיינות על ידי החלפת מדיית גדילה במדיית התמיינות אדיפוגנית כאשר התאים מגיעים למפגש של כ-90%. שמור על תאים במדיה זו, והחלף אותם כל יומיים. להעריך את ההבחנה באופן חזותי תחת מיקרוסקופ (20x) בהתבסס על היווצרות של טיפות שומנים, אשר הופכים גלויים בקלות בתוך 48 שעות של גרימת התמיינות.

6. הערכת אדיפוגנזה

  1. בצע צביעת O אדום שמן בהתאם לשלבים הבאים.
    1. צלחת את התאים בצלחת בעלת שש בארות וגורמת להתמיינות אדיפוגנית במפגש של כ-90%.
    2. הכן פתרון עבודה של שמן אדום O על ידי שילוב שישה חלקים של תמיסת מלאי שמן אדום O עם ארבעה חלקים של מים מזוקקים בצינור 50 מ"ל. ערבבו בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה ותנו לעמוד במשך 10 דקות ב-RT, ולאחר מכן סוננו דרך נייר סינון מדרגה 1 (ראו טבלת חומרים) בתוך המשפך על ידי שפיכה איטית של התמיסה לתוך צינור של 50 מ"ל.
      הערה: תמיסת מלאי שמן אדום O מיוצרת על ידי המסת 0.7 גרם של O אדום שמן (ראה טבלת חומרים) ב-200 מ"ל של 100% איזופרופנול בבקבוק אוטוקלאב. מערבבים היטב ומניחים לו לשבת 20 דקות. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולשמור על התרחקות מאור עד לשימוש. זה יציב במשך שנה. פתרון העבודה יכול לשמש במשך 3 שעות; עם זאת, מומלץ להשתמש בו תוך 2 שעות.
    3. הסירו את המדיה ושטפו בעדינות את הבארות פעמיים עם 2 מ"ל של PBS 1x מחומם מראש באמצעות פיפטה. הסר את PBS לחלוטין על ידי צנרת. לתקן תאים עם 2 מ"ל של 10% פורמלין buffered ולעטוף את הצלחת עם סרט פרפין. השאירו ב-RT לפחות שעה אחת ועד יומיים לפני הכתמה.
      הערה: כדי ליצור 1 ליטר של תמיסת פורמלין מגושמת של 10%, יש לערבב 100 מ"ל של 37% פורמלדהיד, 4.09 גרם של NaH2PO4, 6.5 גרם של Na2HPO4 (ראה טבלת חומרים) ו-900 מ"ל של מים מזוקקים. אין לטפטף פורמלין ישירות על התאים. מחלקים בעדינות על הדופן ליד תחתית הבאר.
    4. מסירים פורמלין ושוטפים בעדינות את הבארות עם 2 מ"ל של מים מזוקקים. החלף עם 2 מ"ל של 60% איזופרופנול. לאחר 5 דקות, הסר איזופרופנול ותן לבארות להתייבש לחלוטין במשך כ -10 דקות. בצעו את כל שלבי ההכתמה ב-RT.
    5. הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת עבודה של Oil Red O לתאים ודגירו למשך 10-20 דקות ב-RT. הסירו את הכתם על ידי צנרת ושטיפו חמש פעמים על ידי טבילה במי ברז עד שלא נראה עודף כתם. לאחר השטיפה הסופית, הוסיפו 1 מ"ל מים לתאים לפני שאתם מדמיינים את הכתמים ואוספים תמונות תחת מיקרוסקופ.
    6. כדי לכמת את הצטברות השומנים בכל מנה, הסר מים ושאב שמן אדום O צבע מהתאים על ידי הוספת 1-2 מ"ל של 100% איזופרופנול שמספיק כדי לכסות תאים בבאר של צלחת של שש בארות לחלוטין. דגירה עם טלטול עדין על שייקר צלחת במשך 10 דקות ב- RT.
    7. מעבירים 200 μL של המיצוי לתוך באר של צלחת הבדיקה של 96 בארות. לכמת את כמות הכתם היחסית באמצעות קורא לוחות ספקטרופוטומטר כדי למדוד ספיגה ב-495 ננומטר.
  2. בצע את בדיקת ההכתמה של טיפות השומנים התוך תאיים והגרעין.
    1. תאי צלחת בלוחות תחתית שחורה של 96 בארות ומעוררים התמיינות אדיפוגנית כמתואר בשלב 5.3.
    2. כדי להכתים את התאים, הוסיפו 200 μL של תמיסת הכתם המכילה כתם שומנים פלואורסצנטי וכתם DNA פלואורסצנטי (ראו טבלת חומרים) ב-1x PBS לכל באר. לאחר חישוב הנפח הכולל של הכתם הנדרש, הוסיפו שתי טיפות של כתם הדנ"א ו-25 μL של כתם השומנים למ"ל של PBS 1x שחומם מראש באמצעות צינור עטוף בנייר כסף כדי להגן על התמיסה מפני אור. דגירה ב-RT למשך 20 דקות והגנה מפני אור.
    3. קרא את הפלואורסצנציה באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטיים (ראה טבלת חומרים). זהה את כתם השומנים (עירור: 485 ננומטר/פליטה: 572 ננומטר) באמצעות מסנן אדום וכתם DNA (עירור: 359 ננומטר/פליטה: 450 ננומטר) באמצעות מסנן כחול/ציאן.
      הערה: ניתן גם לדמיין את הכתמים ולתפוס תמונות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    4. לנרמל את עוצמות כתמי השומנים לעוצמות כתמי הדנ"א כדי לכמת את הצטברות השומנים ביחס לתא מספר13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פראדיפוציטים ראשוניים דומים מבחינה מורפולוגית לפיברובלסטים, עם צורות לא סדירות דמויות כוכבים וגרעין מרכזי (איור 2A-C). התאים נצמדים בקלות לפלסטיק תרבית רקמה ומתחילים להתרבות זמן קצר לאחר ההתקשרות. הם מתמיינים במהירות וצוברים טיפות שומנים (איור 3D) כאשר הן מסופקות עם חומצות שומן במדיה. הכדאיות (98%, בהתבסס על אי הכללת צבע) המדווחת בבידודים המיוצגים כאן היא אופיינית. בעוד שהתאים חזקים למדי, טיפול אגרסיבי במהלך הבידוד מוביל לנזק לת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אף על פי שכמה פרוטוקולים שתוארו היטב דיווחו על בידוד של פרדיפוציטים 14,15,16,17, בידוד עבור פראדיפוציטים עובריים עבר אופטימיזציה, אשר יכול לשמש לניתוחים פונקציונליים של צמיחת שומן מוקדם בחיים והתפתחות אצל אפרוחי ברוילר. פרוטוקול זה מניב כדאיות גבוהה של אבות אדיפוציטים עובריים עם פוטנציאל התמיינות גבוה. יתר על כן, ההליך המוצג לבידוד פרדיפוציטים אינו מוגבל לעוברים אלא יכול לשמש אפרוחים לאחר הבקיע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים ל- UT AgResearch ולמחלקה למדעי בעלי החיים על התמיכה והאופטימיזציה של פרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי מענק USDA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 מ"ל פיפטהאפנדורףZ683825פיפטה חד ערוצית, 100 - 1000 ומיקרו; L
1 מ"ל קצה פיפטהפישר סיינטיפיק02-707-402
100% איזופרופנולפישר סיינטיפיקA426P4
1x PBSGibco10010023
25 מ"ל בקבוקפיירקס4980-25
37% פורמלדהידפישר סיינטיפיקF75P-1GAL
6 בארותפלקון פלקון353046
צלחת בדיקה 96 בארותרקמות Costar3632
צלחת 96 בארות, תחתית שחורהCostar3603טיפול בתרבית רקמות
AdipoRedLonzaPT-7009
אמפוטריצין BGibco15290026
מגב ספסל עליון (Kimtechwiper)קימברלי-קלארק34155
בטדיןלמעלה & למעלהNDC 116730033420% פתרון עבודה
מונה תאיםקורנינג6749
מסננת תאים, 40 ומיקרו; mSPL93040
צנטריפוגטוןאפנדורף5702
סרום עוףGibco16110082
צינורות צנטריפוגה חרוטיים, 15 מ"לVWR10025-690
צינורות צנטריפוגה חרוטיים, 50 מ"לפלקון352098
CryovialNunc343958
מלקחיים מעוקלים, 100 מ"מRoboz כירורגיRS-5137
מספריים כירורגיים מעוקלים, 115 מ"מRoboz כירורגיRS-6839
מים מזוקקיםMilliporeSYNSV0000מחולק לפי הצורך
DMEM/F12HyCloneSH30023.01
DMSOSigmaD2650
אתנולDecon Labs270170% פתרון עבודה
סרום בקר עוברי (FBS)Gibco10437028
מיקרוסקופ פלואורסצנטיEVOSM7000
קורא צלחות פלורסנטBiotekSynergy H1
רדידריינולדס ריינולדסלעטוף רדיד אלומיניום כבד, 125 רגל רבוע.
מיכל הקפאהThermo Scientific5100-0001
ג'לטיןMillipore40552% פתרון עבודה
המטוציטומטר (תא ספירה)קורנינג4802000.1 מ"מ עמוק
אינקובטורפישר סיינטיפיק6845
מעקר מכשיריםVWRB1205
חומצה לינולאית-אולאית חומצה-אלבומיןSigmaL96551x פתרון עבודה
מיקרוסקופEvosAMEX1000
רב ערוצי פיפטהתרמו מדעי4661070פיפטרים 12 ערוצים, 30 - 300 ומיקרו; L
Na2HPO4SigmaS-7907
NaH2PO4SigmaS-3139
NucBlueInvitrogenR37605
שמן אדום OSigmaO-0625
שייקר אורביטליIKAמגבת נייר KS130BS1
TorkRK8002
ParafilmParafilm MPM996
פניצילין/סטפטומיצין (P/S)Gibco151401221x Working Solution
צלחות פטרי, 100 מ"מפלקון351029
צלחות פטרי, 60 מ"מFalcon351007
Plate ShakerVWR200
RBC Lysis BufferRoche11814389001
Reagent ReserviorVWR89094-680
קטנה, 100 מ"לPyrex1000-100
קורא צלחות ספקטרופוטומטרBiotekSynergy H1
גזה סטריליתMcKesson762703
מלקחיים ישרים, 120 מ"מRoboz כירורגיRS-4960
מספריים ישרים, 140 מ"מRoboz כירורגיRS-6762
T-25בקבוק קורנינג430639רקמות שטופלה בתרבית רקמות
Thermo Scientific50144906
מסננת רקמות, 250 ומיקרו; mפירס87791
טריפן כתם כחולג'יבקו15250061
טריפסיןגיבקו154000540.1% פינצטה תמיסת עבודה
, 110 מ"מרובוז כירורגיRS-5035
סוג 1 קולגנאזגיבקו17100017
אמבט מיםפישר סיינטיפיק15-462-10
נייר סינון Whatman כיתה 1Whatman1001-110
שטופלה בתרבית חממת תרבית

מקורות

  1. Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
  2. Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
  3. Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
  4. Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
  5. Vilaboa, S. D. -A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
  6. Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
  7. Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
  8. Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
  9. Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
  10. Corning Cell Counter Demo Video. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022).
  11. Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
  12. Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
  13. Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
  14. Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Adipose Tissue Protocols. , Springer. 201-219 (2008).
  15. Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
  16. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
  17. Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).
  18. Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
  19. Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
  20. Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906(2018).
  21. Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , John Wiley & Sons. 163-186 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Oil Red O
בידוד של פרדיפוציטים מעוברי אפרוחי ברוילר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.