כימות דינמיקת שלד ציטוסקלטון באמצעות מיקרוסקופיה דינמית דיפרנציאלית

Summary

מיקרוסקופיה דינמית דיפרנציאלית (DDM) משלבת תכונות של פיזור אור דינמי ומיקרוסקופיה. כאן מוצג התהליך של שימוש ב- DDM כדי לאפיין רשתות שלד ציטוסקטון משוחזרות על ידי כימות הדינמיקה התת-מפוזרת והכלוב של חלקיקים ברשתות וימנטין והתנועה הבליסטית של מרוכבים פעילים המונעים על ידי מיוזין אקטין-מיקרוטובול.

Abstract

תאים יכולים לזחול, לרפא את עצמם ולכוון את קשיחותם בשל השלד הדינמי להפליא שלהם. ככזה, שחזור רשתות של ביופולימרים שלדיים ציטוסקטליים עשוי להוביל לשורה של חומרים פעילים וניתנים להתאמה. עם זאת, הנדסת חומרים כאלה עם תכונות מכווננות במדויק דורשת מדידה כיצד הדינמיקה תלויה בהרכב הרשת ובשיטות הסינתזה. כימות דינמיקה כזו מאותגר על ידי וריאציות על פני מרחב הזמן, המרחב והניסוח של רשתות מרוכבות. הפרוטוקול כאן מתאר כיצד טכניקת ניתוח פורייה, מיקרוסקופיה דינמית דיפרנציאלית (DDM), יכולה לכמת את הדינמיקה של רשתות ביופולימרים ומתאימה במיוחד למחקרים של רשתות ציטוסקלטון. DDM עובד על רצפי זמן של תמונות שנרכשו באמצעות מגוון של שיטות מיקרוסקופיה, כולל קונפוקליות לסריקת לייזר, פלואורסצנציה בשדה רחב והדמיית שדה בהיר. מתוך רצפי תמונה כאלה, ניתן לחלץ זמני דה-קארלציה אופייניים של תנודות צפיפות על פני טווח של וקטורים של גלים. כמו כן, פותחה חבילת Python ידידותית למשתמש בקוד פתוח לביצוע ניתוח DDM. באמצעות חבילה זו, ניתן למדוד את הדינמיקה של רכיבי שלד ציטוסקלטון מסומנים או של חלקיקי עוקבים מוטבעים, כפי שהודגם כאן עם נתונים של רשתות נימה מתווכת (vimentin) ורשתות אקטין-מיקרוטובול פעילות. משתמשים ללא ניסיון קודם בתכנות או בעיבוד תמונה יוכלו לבצע DDM באמצעות חבילת תוכנה זו ותיעוד משויך.

Introduction

השלד הציטוסקלטון הוא רשת של חוטי חלבון המשתרעת על פני הציטופלסמה של תאים אאוקריוטים, ומחברת את פני התא לגרעין. יש לו תכונות חומר ייחודיות, המספקות הגנה מכנית מפני עומסים מכניים גדולים וחוזרים על עצמם, אך גם מניעות שינויים דינמיים בצורת התא¹. רשתות שלד ציטו-שלד משוחזרות יכולות להוליד מגוון של התנהגויות דינמיות מעניינות, החל מכליאה של חלקיקים משובצים וכלה בתנועה בליסטית המונעת על ידי מנועים מולקולריים 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . שיטות לניתוח הדינמיקה של רשתות כאלה כוללות מעקב אחר התנועה של מיקרו-ספירות עוקבות מוטבעות ^{6,7,12,12,13,14}, ניתוח תמונה למעקב אחר גודלם של צבירים צפופי חלבונים לאורך זמן⁸, פיזור אור דינמי¹⁵, וולוצימטריה של תמונת חלקיקים 4,16,17,18,19 חישוב הצפיפות הספקטרלית של תמונות לאורך זמן¹⁹, וניתוח קימוגרף²⁰., ככל שמתבצעים מחקרים נוספים על רשתות שלד ציטו-שלד משוחזרות, בין אם כדי להבין את המכניקה התאית או את החומר הפעיל, יש צורך יותר ויותר בשיטות חזקות, בלתי משוחדות וניתנות לשחזור לאפיון הדינמיקה. מיקרוסקופיה דינמית דיפרנציאלית (DDM)^21,22, טכניקה חדשה יחסית ששימשה לחקר דינמיקת שלד ציטוסקלטון, היא טכניקה כזו המכמתת ביעילות את הדינמיקה עם מעט פרמטרים המוגדרים על ידי המשתמש. עם חבילת התוכנה המתוארת כאן, חוקרים עם ניסיון מועט בתכנות או ניתוח תמונות יוכלו למנף את DDM לעבודתם שלהם.

DDM היא טכניקת ניתוח תמונה לחילוץ הדינמיקה של הדגימה. בדומה למעקב אחר חלקיקים או לוולוצימטריה של תמונות חלקיקים, DDM דורש סדרת זמן של תמונות (לעתים קרובות אלפי תמונות), המתועדות בדרך כלל באמצעות מיקרוסקופ. שלא כמו מעקב אחר חלקיקים, תכונות בודדות או חרוזי מעקב אינם צריכים להיות מקומיים (או אפילו להיות ניתנים למיקום) בתמונה. בניגוד הן למעקב אחר חלקיקים והן לולוסיומטריה של תמונת חלקיקים, משחזרים את דינמיקת ההרכב עם DDM עם מעט יחסית פרמטרים שצוינו על ידי המשתמש. עם DDM, תמונות מנותחות במרחב פורייה כדי לקבוע את זמן הדעיכה של תנודות צפיפות על פני טווח של מספרי גלים, q, כאשר q = 2πu, ו- u הוא גודל התדרים המרחביים, . אחד מהם מקבל מידע דמוי פיזור אך עם תמונות בחלל האמיתי שנרכשו על מיקרוסקופ 21,22,23. לכן, ניתן לנצל את השיטות השונות ליצירת ניגודיות של מיקרוסקופיה, כגון פלואורסצנציה בשדה רחב^22,24, פלואורסצנציה קונפוקלית²⁵,^{מקוטבת 26}, שדה כהה²⁷, או פלואורסצנציה של יריעות בהירות²⁸ מיקרוסקופיות. יתר על כן, תמונות המשמשות לניתוח DDM עשויות לשמש למעקב אחר חלקיקים או לוולוצימטריה של תמונות חלקיקים כדי לספק מידע משלים.

שילוב זה של תכונות החל מפיזור אור דינמי ומיקרוסקופיה אופטית הופך את DDM לטכניקה רבת עוצמה ורב-תכליתית. מאז התיאור הראשון שלה על ידי Cerbino ו- Trappe בשנת 2008²¹, שם הודגם DDM כדי למדוד את הדיפוזיה של חלקיקים קולואידיים של 73 ננומטר, DDM שימש למדידת קולואידים זורמים²⁹, צבירה קולואידית^30,31, צמיגות של גבישים נוזליים נמטיים²⁶, הדינמיקה של ג'לים קולואידיים³², קצף גס³³, ננו-חלקיקים בסביבות סגורות^34, 35,36,37, תנועתיות חיידקית 38,39,40,41, דיפוזיה של צבירי חלבונים בעלי פיזור חלש ⁴², גלים נימיים בממשקי נוזלים⁴³ ומערכות אחרות. מי שמחפש רשימה מלאה יותר של פרסומים המשתמשים ב- DDM יכול לעיין במאמרי סקירה יסודיים בנושא 22,23,44,45.

DDM שימש גם כדי לחקור את הדינמיקה של רשתות ביולוגיות. Drechsler et al. השתמשו ב- DDM כדי למדוד את הדינמיקה של אקטין בביציות דרוזופילה חיות⁴⁶. Burla et al. כימתו את הדינמיקה של חלקיקי עוקבים ברשתות של חומרים מרוכבים היאלורונן והיאלורונן-קולגן⁴⁷. מספר שימושים ב-DDM כדי לחקור את הדינמיקה של חלקיקי עוקבים ברשתות שלד ציטו-שלד משוחזרות ^9,10, הובלת מולקולות דנ"א ברשתות כאלה^48,49, והדינמיקה של רשתות משוחזרות פעילות תועדו גם^הם 11,50,51. יתרון של DDM במדידת הדינמיקה במערכות כאלה הוא שחלקיקים או מולקולות בודדים אינם צריכים להיות מקומיים ומעקב. כך, למשל, ניתן למדוד את הדינמיקה של מולקולות דנ"א בסביבות צפופות באמצעות DDM למרות הקושי לעקוב אחר מולקולות קטנות ולא כדוריות כאלה. יתר על כן, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ניתן להשתמש בתיוג רב-צבעים כדי למדוד באופן סלקטיבי את הדינמיקה של מרכיבים בודדים בתרכובת מורכבת.

כדי לבצע DDM, רצף של תמונות נלקח לאורך זמן, I(x,y,t). עבור זמן השהיה נתון, Δt, נמצאים כל (או תת-קבוצה) של זוגות תמונות המופרדים על-ידי זמן השהיה זה. התמרת פורייה בריבוע של ההפרש של כל זוג,

מחושבים וממוצעים יחד. כמות זו, , היא ממוצעת רדיאלית, בתנאי שהדינמיקה היא איזוטרופית. זה מניב את מטריצת DDM (המכונה גם פונקציית מבנה התמונה), . תהליך זה מוצג באופן גרפי באיור 1. כדי לקבוע את הדינמיקה של המדגם ממטריצת DDM זו, ההנחה היא שמטריצת DDM תקבל את הצורה

כאשר A היא המשרעת, התלויה בפרטי המיקרוסקופ ובמבנה הדגימה, B הוא הרקע, התלוי ברעש בתמונות, ו- f (q, Δt) היא פונקציית פיזור הביניים (ISF), המכילה מידע על הדינמיקה^21,22. במקרים פשוטים,

כאשר τ הוא זמן דעיכה או דה-קורלציה אופייני. ISF כזה שימש במספר מחקרים המשתמשים ב- DDM על מערכות ארגודיות כמו מתלים קולואידיים מדוללים 21,24,27,37,40,52. עם זאת, צורות אחרות של ISF ניתן להשתמש כדי מודל סוגים שונים של דינמיקה. לדוגמה, ניתן להשתמש בהרחבת קומולנט כדי למדל את ה- ISF עבור דגימות פולידיספרזה כ-

כאשר μ הוא מדד של הפולידיספציה^42,53; אם תנודות הצפיפות דועכות בשני מצבים נפרדים ניתן להשתמש ב- ISF כמו

^{26, 54, 55, 56, 57};

ISFs אחרים יכולים לשמש לשחייה מיקרו-אורגניזמים או חלקיקים פעילים אחרים 38,39,40,41,58,59.

איור 1: סקירה כללית של ניתוח DDM. מזמן סדרת התמונות, מחושבת התמרת פורייה של הפרשי תמונה כדי לחשב את מטריצת ה- DDM. ניתן להתאים את מטריצת ה- DDM למודל כדי לקבוע את סולם הזמן של תנודות צפיפות על פני טווח של ערכי q . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

כאן מתואר השימוש בחבילת תוכנת ניתוח DDM שפותחה ב- Python, PyDDM. חבילת תוכנה זו מתבססת על העבודה שנעשתה על ידי מעבדות המחקר שלנו ומחקרים אחרים שפורסמו במהלך השנים האחרונות. המניעים העיקריים ליצירת חבילת תוכנה זו כוללים את הצורך ב- (1) מעקב ואחסון מטא-נתונים ופרמטרים המשמשים בניתוח; (2) תיעוד יסודי עם דוגמאות מפורטות של ניתוח מתחילתו ועד סופו; ו-(3) דרך קלה להשתמש במודלים מתמטיים שונים (או ליצור חדשים) להתאמת הנתונים (לדוגמה, הוספת מודלים של ISF, כגון אלה שפותחו לאחרונה עבור חוטים פעילים⁶⁰, תהיה פשוטה). קיימות גם חבילות תוכנה אחרות לניתוח DDM, אם כי לא כולן מתועדות היטב וכתובות בשפת תכנות בקוד פתוח. לדוגמה, יש קוד C++ עם מחשוב על מעבדים גרפיים (https://github.com/peterlu/ConDDM)²⁵, קוד C++ המשתמש בהמרות פורייה בזמן כדי להאיץ חישובים (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)⁶¹, גרסאות MATLAB ו- Python (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)⁴⁰, קוד MATLAB (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)²⁷, וקוד MATLAB עם כימות אי-ודאות ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)⁶². מכיוון שחבילת PyDDM זו מתועדת היטב ומספקת גמישות רבה באופן החישוב והניתוח של מטריצת ה-DDM, היא יכולה בתקווה להיות שימושית לחוקרים המעוניינים ליישם DDM ללא קשר לרקע שלהם בתכנות או בניתוח תמונות.

הפרוטוקול מראה כיצד ניתן להשתמש בחבילת תוכנה זו כדי לכמת את הדינמיקה של רשתות ציטוסקלטון משוחזרות במבחנה . זה נעשה על ידי שימוש בשתי קבוצות שונות של נתוני הדמיה: (1) תמונות של חלקיקי עוקבים תת-מיקרוניים המשובצים ברשת וימנטין שצולמה במיקרוסקופיה של שדה בהיר ו-(2) תמונות של חוטי אקטין ומיקרוטובול מסומנים פלואורסצנטיים ברשת מרוכבת מסתבכת עם פעילות מונעת מיוזין שצולמה במיקרוסקופיה קונפוקלית בסריקת לייזר. הניתוחים של שני מערכי נתונים אלה מדגישים עוצמות בולטות של DDM, כולל יכולתו לנתח תמונות שצולמו במגוון אופנות הדמיה (למשל, שדה בהיר או פלואורסצנציה קונפוקלית), כדי לחלץ דינמיקה ממעקבים מוטבעים או מחוטים מסומנים, ולכמת מגוון של דינמיקות (למשל, תת-מפוזרות ומוגבלות או בליסטיות).

Protocol

הערה: ניתן למצוא קובץ מחברת Jupyter המכיל את הקוד שיתלווה לכל שלב בפרוטוקול הבא במאגר GitHub הבא, https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples. קובץ PDF של קובץ זה כלול בקובץ משלים 1. בנוסף, הדרכה של הקוד והתיעוד של כל פונקציה ומחלקה ניתן למצוא באתר, https://rmcgorty.github.io/PyDDM/.

1. התקנת תוכנה

1. כדי לעקוב אחר קבצי ניתוח DDM לדוגמה, התקן את מחברת Jupyter להפעלת הקוד. התקן גם חבילות Python נפוצות נדרשות אחרות, כולל NumPy ו- Matplotlib. כל החבילות הללו מגיעות יחד עם הפצת אנקונדה (ראו https://www.anaconda.com/products/individual).
2. התקן את חבילת Python xarray⁶³. חבילה זו נחוצה לארגון ואחסון של מטא-נתונים ופרמטרים של ניתוח. אם אתה משתמש בהתפלגות אנקונדה, התקן xarray (יחד עם יחסי התלות המומלצים שלו) באמצעות הפקודה:
   conda install -c conda-forge xarray dask netCDF4 bottleneck
3. התקן את חבילת PyYAML באמצעות הפקודה:
   conda install -c anaconda yaml
   חבילה זו נחוצה לקריאת מטא נתונים על התמונות שיש לנתח ועל הפרמטרים שנקבעו על ידי המשתמש לניתוח והתאמה.
4. התקן את חבילת PyDDM, על ידי הורדה ממאגר GitHub או באמצעות הפקודה git:
   https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git שיבוט git

2. תכנון מפגשי ההדמיה

1. בחר את שיטות ההדמיה וההגדרות האופטיות הזמינות האופטימליות. כאמור, ניתן להשתמש ב- DDM במספר שיטות מיקרוסקופיה.
2. כדי לסייע בתכנון העדשה האובייקטיבית המתאימה וגודל התמונה לשימוש, קבע את טווח מספרי הגלים, q, שייבדקו על סמך גודל הפיקסלים וגודל התמונה הכולל. אשרו כי בחירת ההגדלה ושדה הראייה הם אופטימליים לניסוי, בהתבסס על חישובים אלה. עבור התמונות שנותחו כאן, מטרה של 60x 1.4 NA וגודל תמונה של 256 x 256 פיקסלים עם גודל פיקסלים של 0.83 מיקרומטר שימשו עבור הרשת המורכבת הפעילה של אקטין-מיקרוטובול. עבור תמונות של חרוזים המוטמעים ברשת vimentin, נעשה שימוש במטרה של 100x 1.4 NA ובגודל תמונה של 512 x 512 פיקסלים בגודל פיקסלים של 0.13 מיקרומטר.
   הערה: q המינימלי מוגדר על ידי 2π/NΔx, כאשר גודל התמונה (ההנחה היא שהוא ריבועי) הוא N × N פיקסלים עם גודל פיקסלים של Δx. ה-q המקסימלי הוא המינימום של π/Δx ו-2π NA/λ, כאשר NA הוא מפתח הצמצם המספרי של מטרת ההדמיה, ו-λ הוא אורך הגל של האור (להדמיית שדה בהיר, ניתן להחליף את NA ב-(NA_objective + NA_condenser)/2).
3. לאחר מכן, שקול את טווח לוחות הזמנים שיש לחקור. בדרך כלל, ניתוח DDM נעשה על רצפים של לפחות 1000 מסגרות.
   1. כדי לקבוע את קצב הפריימים המתאים, שקול את הזמן הצפוי שייקח לתכונות במדגם להזיז מרחק בסדר גודל האורך המינימלי הניתן לפתרון (המתאים ל- q המרבי).
   2. בהתחשב בגבול העליון של טווח לוחות הזמנים שנבדקו, הכירו בכך שבדרך כלל, ספקטרום ההספק של מאות הפרשי תמונה של זמן השהיה נתון Δt ממוצעים יחד כדי לספק נתונים סטטיסטיים מספיקים כדי להפחית את הרעש. לפיכך, לרכוש רצפי תמונה ארוכים יותר מאשר ציר הזמן המרבי נבדק.
      הערה: אם ידוע מקדם דיפוזיה צפוי, D, או מהירות, v, אז ניתן להעריך את זמני הדעיכה האופייניים הצפויים באמצעות τ = 1/Dq² או τ = 1/vq יחד עם הטווח של q, שנקבע על סמך שדה הראייה וגודל הפיקסלים. טווח ערכי ה- τ הצפויים על פני טווח ה- q הנגיש יכול לעזור להנחות את בחירת קצב הפריימים ואת מספר המסגרות שיש לרכוש.

3. הכנת דוגמאות ורכישת תמונה

הערה: לפרטים על הגדרות ההכנה וההדמיה של המדגם המשמשות לנתונים המוצגים בסעיף התוצאות הייצוגיות, ראו פרסומים קודמים של המחברים 11,51,64 וקובץ משלים 2.

1. בהתבסס על השיקול של סולמות הזמן והאורך לבדיקה, לרכוש רצפי תמונה של, באופן אידיאלי, מעל 1000 פריימים.
   הערה: הקוד ינתח תמונות מרובעות או אזורים מרובעים בעלי עניין בתוך התמונה, לכן התאם את גודל המסגרת בהתאם.
2. שמור רצפי תמונות כמחסנית TIFF תלת-ממדית בגווני אפור. לחלופין, ניתן לקרוא את הפורמט המשמש את מערכות Nikon Instruments, פורמט ND2, על ידי החבילה המותקנת. אם התמונות נשמרות בתבנית שונה כלשהי, השתמש ב- ImageJ או בתוכנית עיבוד הדמיה אחרת כדי להמיר את התמונות למחסנית TIFF.
   הערה: אם אתה משתמש בקבצי ND2, יש להתקין את החבילה nd2reader מ- https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader.

4. הגדרת פרמטרים

1. צור עותק של קובץ הפרמטרים example_parameter_file.yml המסופק במאגר הקוד PyDDM תחת תיקיית הדוגמאות. פתח קובץ YAML זה עם עורך טקסט כמו NotePad++ או עורך הטקסט ב- JupyterLab. ראה קובץ משלים 2 עבור קובץ פרמטרים YAML לדוגמה המשמש בניתוח הנתונים המוצגים בסעיף התוצאות הייצוגיות.
2. בקובץ YAML שהועתק, ספק את ספריית הנתונים ואת שם הקובץ המתאימים לרצף התמונה שיש לנתח. תחת המקטע מטה-נתונים, ספק את גודל הפיקסל ואת קצב הפריימים.
3. תחת הסעיף Analysis_parameters, ספק פרטים על האופן שבו יש לחשב את מטריצת ה- DDM. חלק מהפרמטרים כאן הם אופציונליים.
   1. לכל הפחות, ספק ערכים עבור הפרמטרים number_lag_times ו- last_lag_time. אלה תואמים את מספר זמני ההשהיה השונים שעבורם ניתן לחשב את מטריצת ה- DDM ואת זמן ההשהיה הארוך ביותר (במסגרות) לשימוש, בהתאמה. עבור הנתונים של חרוזי tracer ברשתות vimentin המשמשים כאן, הפרמטרים number_lag_times ו- last_lag_time היו 60 ו- 1000, בהתאמה. הקוד יחשב את מטריצת ה- DDM עבור זמני השהיה ממסגרת אחת (או זמן השהיה מינימלי אחר אם הפרמטר האופציונלי first_lag_time מצוין) last_lag_time עם ריווח לוגריתמי.
      הערה: אם נרכשו מסגרות M, ניתן היה לחשב את מטריצת ה- DDM עבור זמן השהיה גדול כמו M-1. עם זאת, עם נתונים סטטיסטיים גרועים בזמן השהיה כה גדול, הנתונים צפויים להיות רועשים. זמן ההשהיה הארוך ביותר שעבורו ניתן לחשב את מטריצת ה- DDM יהיה תלוי בפרטי הנתונים, אך אנו מציעים לנסות כשליש ממשך סדרת התמונות הכולל.
4. ספק פרטים על האופן שבו מטריצת ה- DDM או פונקציית פיזור הביניים (ISF) צריכות להיות מותאמות למקטע Fitting_parameters. תן את שם המודל תחת פרמטר המודל. ספק את הניחוש הראשוני, הגבול התחתון והגבול העליון עבור כל אחד מהפרמטרים המתאימים במודל שנבחר.
   הערה: כדי להציג רשימה של דגמי ההתאמה האפשריים, הפעל את הפונקציה print_fitting_models. את הדגמים ניתן למצוא גם בתיעוד המקוון באתר PyDDM.

5. חישוב מטריצת ה-DDM

1. אתחל מופע של מחלקת DDM_Analysis. לשם כך, ספק את הפרמטרים של מטה-נתונים וניתוח שנדונו לעיל על-ידי העברת שם הקובץ, עם נתיב הקובץ המלא הכלול, של קובץ YAML DDM_Analysis. לחלופין, העבר את המטא-נתונים והפרמטרים כמבנה נתונים של מילון Python.
2. הפעל את הפונקציה calculate_DDM_matrix כדי לחשב את מטריצת DDM. חישוב זה עשוי להימשך מספר דקות או יותר בהתאם לגודל המסגרת ולמספר זמני ההשהיה. ראו איור 2 עבור זמני ריצה טיפוסיים.
3. בדוק את הנתונים שהוחזרו, שיהיו במבנה נתונים מחבילת xarray המכונה ערכת נתונים. מבנה נתונים זה מאוחסן תחת התכונה ddm_dataset.
   הערה: לא רק מטריצת DDM אלא גם משתנים ומטא-נתונים משויכים יאוחסנו במבנה נתונים זה. הוא יישמר גם בדיסק בתבנית טופס נתונים משותף ברשת (netCDF).
4. בדוק את החלקות והדמויות, אשר ייווצרו ויוצגו. נתונים אלה נשמרים גם כקובץ PDF בספריית הנתונים.
   1. ראה שאחת העלילות שנוצרו מציגה את המודולוס הריבועי הממוצע של התמונות המומרות לפורייה, כפונקציה של q. כברירת מחדל, הקוד משתמש בכך כדי להעריך את פרמטר הרקע B. הערך את הרקע מתוך הנחה שבגבול של q גדול, הוא יתקרב ל - B/2, כאשר B הוא הרקע.
   2. אם אינו מגיע למישור ב-q בכללותו, השתמש בשיטה אחרת להערכת B. לשם כך, הגדר את הפרמטר background_method בקובץ YAML או כארגומנט מילת מפתח אופציונלי לפונקציה calculate_DDM_matrix. פרטים נוספים על שיטות ההערכה של B מוצגים בסעיף התוצאות הייצוגיות.

איור 2: זמן חישוב לחישוב מטריצת ה-DDM. ב- (A) ו- (B) מוצג הזמן לחישוב מטריצת ה- DDM, , . הנתונים המשמשים בכל המקרים הם סרט של 5000 פריימים עם גודל תמונה של 512 x 512 פיקסלים. מטריצת ה-DDM חושבה עבור 30 פעמים השהיה, במרווחים לוגריתמיים בין מסגרת אחת (0.01 שניות) ל-1000 מסגרות (10 שניות). הקוד הופעל על מחשב שולחני Intel i7-10700 במהירות 2.90 GHz עם זיכרון RAM של 32 GB. ב- (A), מוצגת ההשפעה של שינוי מספר הבדלי התמונה המשמשים בחישוב מטריצת ה- DDM עבור כל זמן השהיה. לשם כך, התמונות נקשרות כדי ליצור גודל תמונה של 256 x 256. עבור כל זמן השהיה Δt, תמונות המופרדות על ידי Δt מופחתות והמטריצה המתקבלת היא פורייה מומרת. עבור Δt נתון, ניתן להשתמש בכל זוגות התמונות המופרדות על-ידי אותו Δt (מוצגות בכחול), ניתן להשתמש רק בזוגות תמונה שאינם חופפים (לדוגמה, מסגרות 1 ו-10, 10 ו-19 וכו'; מוצגות בצבע חום), או 300 זוגות תמונות או פחות עבור כל Δt. ב- (B), מוצגת ההשפעה של שינוי גודל התמונה על זמן החישוב. התמונות חוברו על ידי קיבוץ של 2 x 2, 4 x 4 או 8 x 8 פיקסלים, וכתוצאה מכך גדלי תמונה של 256 x 256, 128 x 128 או 64 x 64, בהתאמה. עבור כל אחד מהם, כ-300 זוגות תמונות משמשים לחישוב מטריצת DDM עבור כל Δt. (C) ממטריצת DDM ניתן לחלץ את פונקציית פיזור הביניים (ISF). זה מוצג עבור שלושת המקרים ב-(A). נקודות הנתונים הכחולות (ללא היסט) מתאימות ל- ISF כאשר נעשה שימוש במספר המרבי של זוגות תמונות עבור כל Δt; נקודות הנתונים החומות (עם היסט של 0.1) מתאימות ל- ISF כאשר זוגות תמונות שאינם חופפים משמשים עבור כל Δt; ונקודות הנתונים הוורודות (עם היסט של 0.2) מתאימות ל- ISF כאשר לכל היותר נעשה שימוש ב- 300 זוגות תמונות עבור כל Δt. ה-ISF שנמצא באמצעות זוגות תמונות שאינם חופפים מראה רעשים ב-Δt ארוך. במקרה זה, זוגות תמונות מעטים משמשים ב- Δt ארוך (לדוגמה, עבור Δt של 1000 מסגרות, נעשה שימוש רק ב- 4 זוגות תמונות). (D) על ידי התאמת ה- ISF לפונקציה מעריכית, נקבע זמן הדעיכה האופייני, τ, עבור כל מספר גל, q. בוורוד, התוצאות מוצגות לאחר חיבור התמונות המקוריות ב- 2 x 2, וכתוצאה מכך גודל התמונה הוא 256 x 256. באפור, התוצאות מוצגות לאחר חיבור ב- 8 x 8, וכתוצאה מכך גודל תמונה של 64 x 64. על-ידי חיבור הנתונים, מידע על הדינמיקה במספרי גל גבוהים יותר הולך לאיבוד, אך חישוב מטריצת ה- DDM עבור התמונות בגודל 64 x 64 הוא מהיר פי 16 בערך מאשר עבור תמונות 256 x 256. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

6. התאמת מטריצת ה-DDM או ה-ISF

1. אתחל מופע של מחלקת DDM_Fit. לשם כך, העבר אל DDM_Fit את שם הקובץ של קובץ YAML המכיל את המטה-נתונים של התמונה ואת הפרמטרים להתאמה.
2. החלט באיזה מודל עבור מטריצת DDM או ה- ISF להשתמש להתאמת הנתונים. רשום את המודלים הזמינים על-ידי ביצוע הפונקציה print_fitting_models. ציין את המודל שישמש בקובץ הפרמטר YAML או באמצעות הפונקציה reload_fit_model_by_name.
3. הגדר את הניחושים והגבולות הראשוניים עבור כל פרמטר במודל שנבחר בקובץ הפרמטר YAML שסופק. כדי לשנות את הניחוש הראשוני עבור פרמטר כלשהו, השתמש בפונקציה set_parameter_initial_guess. הגדר גבולות עבור הפרמטרים עם הפונקציה set_parameter_bounds. לדוגמה, כפי שניתן לראות בקובץ משלים 2, עבור הנתונים של חרוזי עוקבים ברשת vimentin, הניחוש הראשוני לזמן הדעיכה היה 1 s והגבולות בפרמטר זה היו 0.01 s ו- 2000 s.
4. בצע את ההתאמה עם התאמת הפונקציה. הקצה משתנה לפלט של פונקציה זו כדי לגשת בקלות לתוצאות.
   הערה: פונקציה זו יכולה לכלול ארגומנטים אופציונליים רבים. עיין בתיעוד הקוד ובדוגמאות שסופקו לקבלת רשימה של ארגומנטים כאלה ומתי לשקול להגדיר אותם לערכים שאינם ברירת מחדל.

7. פירוש תוצאות ההתאמה

1. צור עלילות לבדיקת ההתאמות והתלות ב- q של פרמטרי ההתאמה עם הפונקציה fit_report.
   הערה: פונקציה זו תיצור סדרה של עלילות, אשר יישמרו גם כקובץ PDF. ניתן להשתמש בארגומנטים אופציונליים לפונקציה זו כדי לשנות את העלילות שהופקו.
2. בין החלקות שייווצרו תהיה דמות עם 2 x 2 תתי-סעיפים המציגים את מטריצת ה-DDM או ה-ISF (בהתאם למודל ההתאמה שנבחר) בארבעה ערכי q (שצוינו כארגומנט אופציונלי fit_report), יחד עם מטריצת ה-DDM המחושבת או ה-ISF באמצעות המודל ופרמטרים המתאימים ביותר. כדי להתוות את מטריצת ה- DDM או ה- ISF יחד עם ההתאמה הטובה ביותר באופן אינטראקטיבי, השתמש במחלקה Browse_DDM_Fits כפי שמוצג בדוגמאות שסופקו כאשר נעשה שימוש בסביבת מחברת Jupyter.
3. מתוך העלילה של זמן הדעיכה האופייני τ לעומת מספר הגל q, קבעו אם הדינמיקה עוקבת אחר תנועה מפוזרת, תת-מפוזרת, בליסטית או סוג אחר של תנועה. ניתן לעשות זאת על ידי חיפוש יחסי חוק הכוח בין τ ל-q.
   הערה: בחלוקת יומן הלוגים של τ לעומת q שנוצרה על ידי הפונקציה fit_report, יוצגו שלוש שורות, המתאימות לחוק ההספק המתאים לטווח מוגדר של ערכי q . הקו השחור המוצק מתאים להתאמת τ לעומת q לחוק כוח, τ = 1 / Kq^β, כאשר K ו- β הם פרמטרים חופשיים. הקו המקווקו בכתום מתאים להתאמה לדיפוזיה פשוטה, τ = 1 / Dq², כאשר D הוא מקדם דיפוזיה. הקו המקווקו בנקודה בכחול מתאים להתאמה ל- τ = 1 / vq, כאשר v היא מהירות.

8. שמירת התוצאות

1. תוצאות ההתאמה יישמרו במערך נתונים xarray. השתמש בפונקציית xarray to_netcdf או במודול החמוצים המובנה של Python כדי לשמור את מבנה הנתונים הזה בדיסק. השתמש בפונקציית xarray open_dataset כדי לטעון קבצי netCDF אלה.
2. השתמש בפונקציה save_fit_results_to_excel כדי לשמור את תוצאות ההתאמה, יחד עם הנתונים, בקובץ גליון עבודה.

Results

כאן אנו מראים דוגמאות לניתוח שנעשה עם PyDDM משתי קבוצות שונות של ניסויים. בסדרה אחת של ניסויים, חרוזי מעקב תת-מיקרון הוטמעו ברשתות המורכבות מחלבון החוט הבינוני וימנטין וצולמו באמצעות עדשה אובייקטיבית של פי 100 במצב שדה בהיר ב-100 פריימים לשנייה (איור 3A). וימנטין מתבטא בתאים מזנכימליים והוא גורם מכריע בתכונות המכניות של הציטופלסמה⁶⁵ וביציבות המכנית של הגרעין בתאים המבצעים נדידה מוגבלת^66,67. עד כה, רשתות וימנטין משוחזרות נחקרו בעיקר על ידי ריאולוגיה מקרוסקופית^64,68,69, בעוד שהדינמיקה זכתה לתשומת לב מועטה יחסית 13,70,71. פרטים נוספים על ניסויים אלה ניתן למצוא בקובץ משלים 2. בסדרת הניסויים האחרת הוכנו רשתות שלד ציטוסקלטון פעילות עם אקטין, מיקרוטובולים ומיוזין. תוויות פלואורסצנטיות נבדלות מבחינה ספקטרלית אפשרו לצלם את חוטי האקטין והמיקרוטובול באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של סריקת לייזר בשני צבעים באמצעות עדשת מטרה של פי 60 ב-2.78 פריימים לשנייה (איור 3B,C). אקטין וחוטים מיקרוטובולים הם שני מניעים חשובים לשינויים דינמיים בצורת התא, כאשר פעולותיהם מתואמות על ידי אינטראקציות מכניות וביוכימיות⁷². פרטים נוספים על ניסויים אלה ניתן למצוא^ב-11. מסגרות בודדות מרצפי תמונות שצולמו בניסויים אלה מוצגות באיור 3.

איור 3: תמונות מסדרת הזמן שנותחה. (A) תמונת ברייטפילד של חרוזי 0.6 מיקרומטר ברשת וימנטין. (ב,ג) תמונה של המיקרוטובולים (B) ו-(C) אקטין בקומפלקס אקטין-מיקרוטובול פעיל שצולמה במטרה של פי 60 על מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר, תוך שימוש באור עירור של 561 ננומטר להדמיית המיקרוטובולים ואור עירור של 488 ננומטר לצורך הדמיית האקטין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

עבור תמונות של חרוזי מעקב ברשתות vimentin, נרשמו סרטים של 5000 פריימים בגודל של 512 x 512 פיקסלים ב-100 פריימים לשנייה. מתוך אלה, מטריצת ה-DDM חושבה ב-60 זמני השהיה במרווחים לוגריתמיים בין 1 ל-1000 פריימים, או 0.01 שניות ו-10 שניות. כדי להעריך את הרקע, B, הממוצע של התמונות המרובעות בריבוע של פורייה, , חושב והוגדר ^{כשווה ל-55,73}. הונחה כי מעל 10% הגדולים ביותר של ערכי q, כמות זו שווה ל-B/2 וכי B אינה תלויה ב-q. זוהי שיטת ברירת המחדל של החבילה להערכת B, אך שיטות אחרות אפשריות על-ידי הגדרת הפרמטר background_method לערך אחר.

כאשר הפרמטרים A(q) ו- B נקבעים מ- , ניתן לחלץ את פונקציית פיזור הביניים (ISF) ממטריצת DDM. ISFs לדוגמה מוצגים באיור 4. באיור 4A מוצג ה-ISF מתמונות של חרוזים בקוטר 0.6 מיקרומטר המוטבעים ברשת עם ריכוז וימנטין של 19 מיקרומטר. באיור 4B מוצג ה-ISF עבור אותו סוג של חרוזים ברשת עם ריכוז וימנטין של 34 μM. באופן מעניין, באף אחד מהמקרים ה-ISF לא התפורר לאפס. בזמני השהיה גדולים, ה- ISF צריך להתקרב לאפס עבור מערכות ארגודיות. כלומר, במערכות כאלה, תנודות צפיפות צריכות להתפרק לחלוטין על פני זמני השהיה גדולים. העובדה שה-ISF כאן לא דועך לאפס הייתה יכולה לנבוע מהערכות לא מדויקות של A(q) ו-B, ששימשו למציאת ה-ISF ממטריצת ה-DDM המחושבת. יש לציין כי השיטה הנהוגה כאן יכולה להעריך יתר על המידה את ב' בתרחישים מסוימים⁶². עם זאת, סביר יותר שהדינמיקה של חרוזי העקיבה היא באמת לא-ארגודית מכיוון שהחרוזים הם בעלי גודל דומה לגודל רשת הרשת ולכן הם עלולים, להפוך לכלובים. נתונים אחרים אימתו את הממצא של אי-סדר. כלומר, גודל החרוז, 0.6 מיקרומטר, היה גדול מהערך הממוצע המחושב עבור גדלי הרשת של 0.4 מיקרומטר עבור ריכוז 19 μM ו-0.3 μm עבור ריכוז 34 μM. בנוסף, התוצאות של מעקב אחר חלקיקים בודדים של חרוזי העקיבה האלה, שמוצגים מאוחר יותר, הראו גם הן תנועה מוגבלת.

איור 4: פונקציות פיזור ביניים במספרי גלים עבור רשתות וימנטין. ה- ISF משורטט כפונקציה של זמן השהיה עבור ערכי q מ- 1 עד 9 ^μm-1 בקירוב. (A) ה-ISF מתמונות של חרוזי 0.6 מיקרומטר ברשת וימנטין עם ריכוז וימנטין של 19 μM. (B) ה-ISF מתמונות של חרוזים של 0.6 מיקרומטר ברשת וימנטין עם ריכוז וימנטין של 34 μM. רמת זמן ההשהיה הארוכה של ה- ISF בערך הרבה מעל האפס מצביעה על אי-אחידות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

בהינתן שהדינמיקה היא ככל הנראה לא-ארגודית, ה-ISFs מתאימים לצורה , כאשר C הוא הגורם הלא-ארגודי ³². צורה זו של ה- ISF שימשה במחקרים קודמים של דינמיקה לא ארגודית, כגון זו של ג'לים קולואידיים^32,74 או חלקיקי עקב ברשתות אקטין-מיקרוטובול ¹⁰. הקווים השחורים המנוקדים באיור 4 מראים את ההתאמות יחד עם הנתונים. מתוך התאמות אלה, ניתן כעת להסתכל על התלות ב-q של זמן הדעיכה, τ, ושל הפרמטר nonergodicity, C.

איור 5: זמן דעיכה לעומת מספר גלים עבור רשתות וימנטין. מהתאמות ל- ISF, זמן הדעיכה τ נקבע עבור טווח של ערכי q . למען הבהירות, איננו מציגים את הערך של τ עבור כל q, אלא רק קבוצה במרווחים לוגריתמיים. בכחול (tan) נמצאים הנתונים מתמונות של חרוזי 0.6 מיקרומטר בתוך רשתות וימנטין עם ריכוז וימנטין של 19 מיקרומטר (34 μM). פסי השגיאה מייצגים את סטיות התקן ב- τ על פני סרטים מרובים (ארבעה סרטים עבור הנתונים עם רשת 19 μM [כחול] וחמישה סרטים עבור הנתונים עם רשת 34 μM [tan]). קווים מנוקדים אדומים מסמנים גבולות משוערים עבור הרזולוציה הטמפורלית והמרחבית שלנו, כמתואר בתוצאות. הקו השחור המוצק מראה שינוי קנה מידה, שיצביע על תנועה מפוזרת. אף אחד ממערך הנתונים אינו עוקב אחר שינוי קנה מידה זה. במקום זאת, חרוזים ברשת 19 μM מראים תנועה תת-מפוזרת (עם β > 2), וחרוזים ברשת 34 μM מראים תנועה מוגבלת או כלואה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

זמני הדעיכה הראו כמות גדולה של אי-ודאות, הן בקצוות q הנמוכים והן בקצוות q הגבוהים, כפי שניתן לראות באיור 5. פסי השגיאה בעלילה זו מראים את סטיית התקן בין ארבעה סרטונים שנותחו עבור מקרה ריכוז הווימנטין הנמוך יותר או חמישה סרטונים שנותחו עבור הריכוז הגבוה יותר. כדי להבין את מקור אי הוודאות הגדולה בקיצוניות זו, שקול הן את הרזולוציה הזמנית והן את הרזולוציה המרחבית. גבולות משוערים של הרזולוציה מוצגים עם שלושה קווים מנוקדים אדומים. שני הקווים האופקיים תואמים את זמני ההשהיה המינימליים והמקסימליים שנבדקו. בהינתן קצב הפריימים של 100 פריימים לשנייה וזמן ההשהיה המרבי המתאים ל- 1000 פריימים (20% ממשך הווידאו הכולל), הדיוק אבד בעת מדידת דינמיקה המתרחשת מהר יותר מ- 0.01 שניות או איטית מ- 10 שניות. בערכי ה-q הנמוכים יותר, הערכים המותאמים עבור τ היו גדולים מ-10 שניות. לכן, יש לצפות לאי-ודאות גדולה בזמני דעיכה הגדולים מזמן ההשהיה המרבי. בקצה הגבוה יותר של טווח ה-q, זמן הדעיכה התקרב לזמן ההשהיה המינימלי של 0.01 שניות אך נשאר מעליו. במקום להיות מוגבלת על ידי הרזולוציה הזמנית, בערכי q גבוהים אלה, הרזולוציה המרחבית עשויה להיות הגורם המגביל. בהתחשב בגודל הפיקסל של 0.13 מיקרומטר, הערך הגדול ביותר עבור q היה בערך 24 ^μm-1. עם זאת, הרזולוציה המוגבלת עקיפה אינה מאפשרת בהכרח מדידות מדויקות של הדינמיקה בתדרים מרחביים גבוהים אלה. קירוב הרזולוציה האופטית כמוביל לגבול מספר גל עליון של ^{כ-16 מיקרומטר-1}, בהינתן הצמצם המספרי של העדשה האובייקטיבית, NA, של 1.4 ואורך הגל של האור, . זה מסומן על-ידי הקו המנוקד אנכי אדום-מקף באיור 5. ואכן, הנתונים היו רועשים בערכים גדולים של q. עוד לפני הגבול העליון המשוער הזה של q, נצפתה אי-ודאות מוגברת ב-τ, וניתן היה להפריז בהערכת q_max. רזולוציה אופטית ירודה יותר מהתחזיות עשויה להיות משום שעדשת טבילת שמן שימשה לצילום מעבר לכיסוי לתוך דגימה מימית או משום שעדשת המעבה הייתה מיושרת באופן לא מושלם.

עבור חרוזי 0.6 μm המוטבעים ברשת הפחות מרוכזת (19 μM vimentin), ניתן לראות מתוך תרשים יומן הלוגים של זמן הדעיכה לעומת מספר הגלים שזמן הדעיכה פחת עם מספר הגלים באופן התואם את חוק העוצמה (איור 5). עם זאת, לא נראה שהוא עוקב אחר מה שצפוי לתנועה מפוזרת רגילה, כאשר . במקום זאת, τ ירד בצורה תלולה יותר עם עליית q. זה מעיד על תנועה תת-מפוזרת, המתרחשת לעתים קרובות עבור חרוזים בסביבות צפופות כגון אלה. התאמת τ(q) על פני הטווח של 1.4 ^μm-1 עד 12.3 ^μm-1 לחוק ההספק של הצורה τ = 1/Kq^β מניבה את פרמטרי ההובלה K = 0.0953 μm^β / s ו - β = 2.2. עבור אלה שרגילים יותר לחשוב על דיפוזיה נורמלית לעומת תת-דיפוזיה במונחים של התזוזה הריבועית הממוצעת (MSD) של חלקיקי עוקבים כפונקציה של זמן השהיה (כלומר, MSD = K' Δt^α), כדאי לזהות שמעריך קנה המידה התת-דיפוזי במשוואת MSD, α, שווה ערך α = 2 / β. במילים אחרות, הערך של β = 2.2 עולה בקנה אחד עם מעריך קנה מידה תת-מתפזר במשוואת MSD של α = 0.9. ניתן להגדיר את PyDDM כך שיתאים ל- τ(q) מעל טווח זה של ערכי q על-ידי ציון המדדים של מערך ה- q עם הפרמטר Good_q_range בקובץ YAML או על-ידי העברת הארגומנט האופציונלי forced_qs לפונקציה generate_fit_report. הטווח של q בין 1.4 ^{μm-1 ל-} 12.3 ^μm-1 יתאים, עבור הנתונים כאן, למדדים של המערך של q מ- 15 עד 130.

עבור חרוזי 0.6 מיקרומטר ברשת המרוכזת יותר (34 μM), זמן הדעיכה הראה תלות מועטה ב-q. זה כנראה בגלל אי-ההתאמה של חרוזים ברשת עם גודל רשת קטן יותר. כדי לחקור את אי-ה-ergodicity במערכת זו, הפרמטר nonergodicity, C, צריך להיות משורטט כפונקציה של q, כמו באיור 6. עבור חרוזי 0.6 מיקרומטר ברשת 19 μM vimentin, C ≈ 0.2 עם תלות מועטה ב-q (לא מוצג). עם זאת, עבור הרשת עם 34 μM vimentin ועבור רשת עם ריכוז גבוה עוד יותר של 49 μM vimentin, היומן של C היה פרופורציונלי ל-q² כפי שמוצג באיור 6. קשר זה בין C ל-q צפוי לתנועה מוגבלת. עבור חרוזים הלכודים בכיסים של הרשת, ה-MSD צפוי להימתח בזמני השהיה ארוכים מספיק (כלומר, כאשר ה-MSD הוא ה-MSD ו-δ² הוא ה-MSD המרבי). מכיוון שניתן לבטא את ה- ISF במונחים של MSD כ- , ומכיוון שה- ISF הלא-ארגודי עובר ל- C בזמני השהיה ארוכים (כלומר, ), הקשר מתקבל^32,75. לכן, ניתן להשתמש ב- C(q) כדי למצוא δ², וזה הניב δ² = 0.017 μm² ו- 0.0032 μm² עבור רשתות 34 ו- 49 μM vimentin, בהתאמה (המקביל δ = 0.13 μm ו- 0.057 μm).

איור 6: פרמטר Nonergodicity לעומת מספר גל עבור רשתות וימנטין. מהתאמות ל- ISF, הפרמטר nonergodicity C נקבע עבור טווח של ערכי q . ב-tan (אדום) נמצאים הנתונים מתמונות של חרוזי 0.6 מיקרומטר בתוך רשתות וימנטין עם ריכוז וימנטין של 34 מיקרומטר (49 μM). פסי השגיאה מייצגים את סטיות התקן ב- τ על פני סרטים מרובים (חמישה סרטים עבור הנתונים עם רשת 34 μM [tan] וארבעה סרטים עבור הנתונים עם רשת 49 μM [אדום]). לציר y יש קנה מידה לוגריתמי. אחד מתבונן בתלות q של C הבאה , המאפשרת חילוץ התזוזה הריבועית הממוצעת המרבית, δ². התאמות כדי מוצגות עם הקווים המוצקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

ניתן להשתמש בשיטות אחרות כדי לחלץ את גודל הכליאה δ מהנתונים, כמו גם את המעריך התת-מתפזר שנמצא מבדיקת τ(q) עבור חרוזים בתוך רשת 19 μM vimentin. ראשית, ניתן להשתמש בשיטה שתוארה על ידי Bayles et ^al.76 ו- Edera et ^al.77 כדי לחלץ את ה- MSD ממטריצת DDM. יש לציין כי שיטה זו אינה דורשת התאמה של מטריצת ה- DDM. צריך רק לחשב את מטריצת ה-DDM, D(q, Δt), ו -( שממנה ניתן לקבוע את A(q) ו-B ). לאחר מכן, כדי למצוא את MSD, אחד משתמש ביחסי הגומלין . שים לב ששיטה זו למציאת ה-MSD מניחה שהתפלגות תזוזות החלקיקים היא גאוסיאנית, אם כי עבודה קודמת הראתה שבמקרים מסוימים, MSDs שמקורם ב-DDM אכן מסכימים עם MSDs ממעקב אחר חלקיקים, גם כאשר התזוזות אינן^{גאוסיות 73}. עבור מערכת זו, כצפוי⁷⁸, קיימת אי-גאוסיות בהתפלגות של תזוזות גדולות, כפי שניתן לראות באיור S1. בחבילת PyDDM, יש לבצע את הפונקציה extract_MSD, אשר מחזירה . שנית, ניתן להשתמש במעקב אחר חלקיקים בודדים כדי למצוא את ה-MSD. למרות שניתן להשתמש ב-DDM כדי לנתח תמונות שבהן הצפיפות הגבוהה של החלקיקים או הרזולוציה האופטית המוגבלת אוסרות על לוקליזציה מדויקת של חלקיקים, עבור תמונות של חרוזים של 0.6 מיקרומטר ברשתות וימנטין, הצלחנו למקם ולעקוב אחר חרוזים באמצעות תוכנת trackpy (https://github.com/soft-matter/trackpy)⁷⁹. חבילת תוכנה זו למעקב אחר חלקיקים משתמשת באלגוריתמים שתוארו על ידי קרוקר וגרייר⁸⁰.

איור 7: תזוזה ממוצעת בריבוע לעומת זמן השהיה עבור רשתות וימנטין. ה-MSD נקבע באמצעות שתי שיטות. ראשית, ה- MSD חושב ממטריצת DDM (מוצגת עם סמלים מוצקים). לאחר מכן, ה-MSD נקבע על ידי שימוש במעקב אחר חלקיקים בודדים (SPT) כדי למצוא מסלולי חלקיקים (סמלים פתוחים). פסי שגיאה נקבעים באותו אופן כפי שתואר בשתי האגדות הקודמות. (A) MSDs עבור חרוזים של 0.6 מיקרומטר ברשת 19 μM vimentin מצביעים על תנועה תת-פיזורית, עם הסכמה טובה בין שתי השיטות למציאת ה-MSD. (B) MSDs עבור חרוזי 0.6 μm ברשת 49 μM vimentin מצביעים על תנועה בכלוב, עם הסכמה טובה בין שתי השיטות למציאת MSD ועם MSD המרבי שנמצא מהפרמטר nonergodicity. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

ה-MSDs לעומת זמן ההשהיה עבור חרוזים של 0.6 מיקרומטר ברשת 19 μM vimentin וברשת 49 μM vimentin מוצגים באיור 7. בשני המקרים, ה-MSD שנקבע מ-DDM הסכים היטב עם ה-MSD שנמצא באמצעות מעקב אחר חלקיקים בודדים (SPT). יתר על כן, עבור הרשת הפחות מרוכזת, מעריך קנה המידה התת-מתפזר (α ב- ) היה בערך 0.9. זה עולה בקנה אחד עם קנה המידה τ(q) של נמצא על ידי התאמת ה- ISF כדי לקבוע τ(q) (כלומר, 2/2.2 = 0.9). עבור הרשת המרוכזת יותר, רמת ה-MSD מתייצבת בזמני השהיה ארוכים יותר. ה-MSD המרבי שנמצא על-ידי ניתוח התלות ב-q של הפרמטר nonergodicity (המוצג באיור 7B עם הקו האופקי ב-δ² = 0.0032 μm²) היה בערך אותו ערך שנראה כי ה-MSDs הן מ-SPT והן מ-DDM מתקרבים אליו. קיים פער בין זמן ה-MSD של זמן ההשהיה הארוך ביותר שנקבע מ-DDM ו-SPT באיור 7A. אמנם ייתכן שהדבר נובע ממספר מוגבל של מסלולי זמן השהיה ארוכים, אך ייתכן גם שאופטימיזציה נוספת של טווח ערכי ה-q שעבורם מטריצת ה-DDM משמשת להערכה עבור כל זמן השהיה (כפי שנעשה על ידי Bayles et ^al.76 ו-Edera et ^al.77) תשפר את התוצאות שלנו, ואופטימיזציה כזו תהיה המוקד של עבודה עתידית.

ניסויים אלה שבהם תועדו רצפי תמונה של חרוזי עקיבה שהוטמעו ברשת של חוטי ביניים של וימנטין אפשרו ניתוחים עצמאיים: DDM (באמצעות החבילה המתוארת כאן) ו-SPT (באמצעות trackpy). שני הניתוחים יכולים לחשוף את מידת תת-הפיזור ואורך הכליאה, מה שמאפשר להשתמש בשתי טכניקות ניתוח תמונה עצמאיות כדי לספק מדדים משלימים. ישנן כמויות נוספות שניתן להשוות מ- SPT ו- DDM. לדוגמה, ההטרוגניות בדינמיקה של הדגימה יכולה לחשוף את עצמה כלא-גאוסיאניות בהתפלגות תזוזות החלקיקים (כלומר, התפלגות ואן הוב) שנקבעה מ-SPT, כמו גם ב-ISF שנקבע מ-DDM שמתאים לאקספוננציאלי מתוח^34,35. איור S1 מראה את התפלגות ואן הוב עבור חלקיקי 0.6 מיקרומטר ברשתות וימנטין ודן במעריך המתיחה שנמצא מהתאמת ה-ISFs – מדדים ששימשו במקביל במחקרים קודמים כדי להדגים את הדינמיקה ההטרוגנית של חלקיקים במערכות ביומימטיות ^9,10,47 או סביבות צפופות אחרות ³⁴ . כדוגמה נוספת, ניתן לחשב את ה-ISF ממסלולי חלקיקים שנמדדו עם SPT ולהשוות אותו ל-ISFs הנרכשים ב-DDM. בעוד שהתזוזות הריבועיות הממוצעות והתפלגויות התזוזה הן המדדים הנשלפים לרוב מניתוח SPT, ניתן גם לחשב את ה-ISF ממסלולי חלקיקים, באמצעות (ראו איור S2). ניתן להשוות ISF זה עם ISFs שנוצרו על ידי DDM ולהשתמש בו כדי לחשוף דינמיקה שאינה נראית לעין ב- MSD⁵⁹.

בעוד שרכישת תמונות של חלקיקי עוקבים בתוך רשת עשויה לאפשר להשתמש בשיטות האנליזה המשלימות של SPT ו-DDM, חשוב לציין שהיתרון של DDM על פני SPT הוא שהוא אינו דורש תמונות של חרוזים (או תכונות אחרות) שניתן למקם ולעקוב אחריהם בקלות. כדי להדגים נקודה זו, אנו מדגישים בהמשך את הניתוח של רשתות פעילות של חוטי אקטין ומיקרוטובול, שבהן תיוג פלואורסצנטי של אקטין וטובולין מאפשר הדמיה של שני סוגי החוטים, הנבדלים זה מזה באמצעות פלואורופורים שונים, עם מיקרוסקופ קונפוקלי רב-צבעי לסריקת לייזר.

התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר של רשתות אקטין-מיקרוטובול עם פעילות המונעת על ידי מיוזין (מיוזין שריר השלד של ארנב II; #MY02 ציטוסקלטון). פרטי הניסויים והתוצאות תוארו בעבר¹¹, והתוצאות הייצוגיות המוצגות כאן הן מניתוח של שני סרטים שסופקו בחומרים המשלימים (סרטים S1 ו-S4) עבור¹¹. שני רצפי התמונות הוקלטו בקצב של 2.78 פריימים לשנייה עבור 1000 פריימים.

כדי לנתח תמונות אלה, מטריצת DDM חושבה עבור 50 זמני השהיה הנעים בין 0.4 שניות ל-252 שניות (מסגרת אחת עד 700 מסגרות). מטריצת ה- DDM התאימה אז למודל , כאשר פונקציית פיזור הביניים הייתה . ישנם, אם כן, ארבעה פרמטרים מתאימים: A, τ, s ו- B. התוצאות של ההתאמות האלה מוצגות באיור 8. נצפה כי מטריצת ה-DDM עבור ערך q מסוים הייתה בעלת מישור בזמני השהיה נמוכים, גדלה עם זמן ההשהיה, ולאחר מכן מישורית (או הראתה סימנים של התחלה למישור) בזמני השהיה גדולים. מטריצת ה-DDM עבור הערכים הנמוכים יותר של q לא הגיעה למישור בזמני השהיה ארוכים. לכן, יש לצפות לדיוק ירוד במדידת זמן הדעיכה עבור דינמיקות q נמוכות אלה (בקנה מידה גדול).

זמני הדעיכה האופייניים, τ, מההתאמות למטריצת DDM מוצגים באיור 9. התוצאות מוצגות עבור רשת מרוכבת פעילה של אקטין-מיקרוטובול (בדומה לסרט S1¹¹) ועבור רשת אקטין פעילה (בדומה לסרט S4¹¹). שתי הרשתות הוכנו עם אותם ריכוזים של אקטין ומיוזין, אך הרשת האקטין בלבד נוצרה ללא טובולין, כפי שתואר^ב-11. עבור שני סוגים אלה של רשתות פעילות, יחסי חוק הכוח שנצפו היו . שינוי קנה מידה זה מצביע על תנועה בליסטית ועל כך שההתכווצות והזרימה המונעות על ידי מיוזין שולטות על התנועה התרמית של החוטים. מ - τ = (vq)^-1, ניתן היה למצוא מהירות אופיינית, v, של כ- 10 ננומטר לשנייה עבור רשת האקטין-מיקרוטובול הפעילה ו- 75 ננומטר לשנייה עבור רשת האקטין הפעילה. ערכים אלה עולים בקנה אחד עם ניתוח הוולוצימטריה של תמונת החלקיקים של אותם סרטונים המוצגים^ב-11. קנה המידה לא החזיק בערכי ה-q הנמוכים יותר עבור הרשת המרוכבת הפעילה אקטין-מיקרוטובול. הסיבה לכך היא ככל הנראה שזמני הדעיכה האמיתיים של רשת מרוכבת אקטין-מיקרוטובול זו בערכי q הנמוכים יותר ארוכים מזמן ההשהיה המרבי של מטריצת ה-DDM המחושבת. זמן ההשהיה המרבי מצוין בקו האדום האופקי באיור 9, וזמני הדעיכה חרגו מקנה המידה הצפוי בסמוך לזמנים הארוכים האלה.

איור 8: מטריצת DDM לעומת זמן השהיה עבור רשת מרוכבת פעילה של אקטין-מיקרוטובול. מטריצת ה-DDM עבור מספר ערכים של q משורטטת כפונקציה של זמן השהיה מסרט של רשת מורכבת המורכבת ממונומרים של אקטין 2.9 μM, דימרים של טובולין 2.9 μM ומיוזין 0.24 μM. נתונים אלה מראים את הניתוח של ערוץ המיקרו-טובול בלבד של סדרת תמונות זמן צבעונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 9: זמן דעיכה לעומת מספר גלים עבור רשתות אקטין-מיקרוטובול פעילות. מהתאמת מטריצת ה-DDM, נמצא זמן הדעיכה, τ, כפונקציה של מספר גלים, q. התוויה היא τ לעומת q עבור תמונות של רשת אקטין-מיקרוטובול פעילה (המנתחת רק את ערוץ המיקרוטובול) בחום ועבור תמונות של רשת אקטין פעילה בירוק. לשתי הרשתות יש את אותם ריכוזים של אקטין ומיוזין (2.9 μM ו- 0.24 μM, בהתאמה); לקומפלקס אקטין-מיקרוטובול יש 2.9 μM של דימרים של טובולין. זמני הדעיכה של רשת האקטין הפעילה קטנים בהרבה מזמני הדעיכה של רשת האקטין-מיקרוטובול הפעילה, מה שמצביע על תנועה מהירה יותר של רשת האקטין הפעילה. בשני המקרים, הדינמיקה היא בליסטית מכיוון שהנתונים עוקבים אחר מגמה. Inset: החלקה של ה- ISFs לעומת זמן ההשהיה שגודלו על ידי מספר הגל (Δt × q) מציגה קריסה של ה- ISFs על פני טווח של ערכי q . זה גם מצביע על תנועה בליסטית. ה- ISFs המוצגים בכניסה זו הם מרשת האקטין הפעילה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

עבור נתונים אלה של רשתות פעילות, בחרנו להתאים למטריצת DDM, . זאת בניגוד למה שנעשה עבור נתוני החרוזים ברשת הווימנטין, כאשר A (q) ו-B הוערכו ללא כל התאמה לבודד את ה-ISF, f (q, Δt). במקרה זה, עבור נתוני הרשת הפעילים, A ו - B הושארו כפרמטרים מתאימים מכיוון שהשיטות ששימשו להערכת B לא הביאו להתאמות טובות. שיטת ברירת המחדל להערכת B היא לחשב ולהניח שב-q כללי זה הולך ל-B/2. עם זאת, שיטה זו העריכה יתר על המידה את B עבור נתונים אלה, אשר נראתה בעובדה שכאשר מחשבים את ה- ISFs מ- B הנאמדים בדרך זו (לא מוצגים), ה- ISFs היו גדולים מ- 1 בזמני השהיה מוקדמים (בעוד שהם צריכים לעבור ממקסימום של 1 לאפס או לפרמטר כלשהו של אי-התאמה עם הגדלת זמן ההשהיה). ניתן לבחור שיטות אחרות להערכת B באמצעות הפרמטר background_method. אחת השיטות האחרות הללו היא להעריך את B כמינימום של מטריצת ה-DDM בזמני השהיה מוקדמים (עם background_method=1). שיטה דומה שימשה את Bayles et ^al.76, אם כי הם לא הניחו ש-B קבוע עם q. אפשרות נוספת היא להעריך את B כערך הממוצע על פני כל זמני ההשהיה של מטריצת ה-DDM ב-q המרבי (שנקבע עם background_method=2). שיטות שונות אלה להערכת הרקע, כמו גם התוצאות המאפשרות ל-B להיות פרמטר מתאים באופן חופשי, מוצגות באיור 10. מאותן חלקות ניתן לראות שהמשרעת, A, לא הגיעה לאפס בערכי ה-q הגדולים ביותר שנבדקו, מכיוון שלא התייצבה ב-q בכללותה (איור 10B), ומכיוון ש-D(q_max, Δt) עברה מרמה נמוכה יותר של זמן השהיה למישור זמן השהיה גבוה יותר (כלומר, ב-q_max, היה A שאינו אפס; איור 10D). לכן, לא מעריכים את ב' כ- וגם לא כפי שיהיה מתאים. יש לבדוק לעומת q ו-D(q_max, Δt) לעומת Δt לפני שמחליטים כיצד (או אם) להעריך את B.

איור 10: רקע לעומת מספר גלים עבור רשתות אקטין-מיקרוטובול פעילות. מהתאמת מטריצת DDM, ניתן למצוא את הרקע, B, כפונקציה של מספר גלים, q. מוצגB   לעומת q עבור תמונות של רשת אקטין-מיקרוטובול פעילה (המנתחת רק את תעלת המיקרוטובול) שנקבעה מתוך התאמות אלה עם הסמלים הסגולים. שלושת הקווים המוצקים ב-(A) מראים הערכות של הרקע שנמצאו ללא כל התאמה. הקו העליון, הכהה ביותר ב- (A) מציג את הרקע המשוער באמצעות , אשר עשוי להיות מתאים אם הוא מתאים אם הוא מתאים לערך קבוע ב- q גדול. מתוך (B), שים לב שעדיין לא הגיע לערך קבוע ב- q הגדול ביותר. לכן, שימוש בשיטה זו מעריך יתר על המידה את הרקע. השורה התחתונה ב- (A) מציגה את הרקע המשוער באמצעות . אם מטריצת DDM מציגה רמת זמן השהיה נמוכה כפי שמוצג ב- (C) עם הקו האדום, שיטה זו עשויה להתאים להערכת הרקע. הקו האמצעי, הקל ביותר ב- (A) מציג את הרקע המשוער מ- . שיטה זו עשויה להיות מתאימה אם, ב-q_{מקסימום}, המשרעת, A, הגיעה לאפס. מ-(D), נראה כי המשרעת אינה אפסית, ולכן שיטה זו מעריכה יתר על המידה את הרקע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים S1: התפלגויות הסתברות של תזוזות חלקיקים. התפלגויות הסתברות של תזוזות חלקיקים מראות אי-גאוסיות עבור ריכוזי וימנטין של 34 μM ו-49 μM. מעקב אחר חלקיקים בודדים של חרוזים בקוטר 0.6 מיקרומטר בוצע ברשתות וימנטין בריכוזים שונים. זמני השהיה שונים מוצגים בהתפלגויות התזוזה עבור שלושת התנאים. (A) התפלגות תזוזות החלקיקים ברשת וימנטין של 19 μM מתאימה לפונקציה של גאוס. רוחבו של הגאוס גדל עם הגדלת זמן ההשהיה. (B) התפלגות תזוזות החלקיקים ברשת וימנטין של 34 μM מראה יותר אי-גאוסיאניות, במיוחד בתזוזות גדולות, מאשר במקרה של 19 μM. (C) התפלגות תזוזות החלקיקים ברשת וימנטין של 49 μM מראה גם אי-גאוסיאניות. יתר על כן, רוחב ההתפלגויות אינו גדל עם זמן ההשהיה באופן משמעותי כמו בדגימות עם ריכוזי וימנטין נמוכים יותר, מה שמעיד על תנועה מוגבלת. התפלגויות ואן הוב שאינן גאוסיות (הנראות עבור כל דגימות הווימנטין אך הבולטות ביותר בריכוזים הגבוהים יותר) קשורות לדינמיקה הטרוגנית כפי שניתן לראות לעתים קרובות בהעברת חלקיקים בסביבות צפופות ומוגבלות. אינדיקטור נוסף לתעבורה הטרוגנית שנקבע מניתוח DDM הוא מעריך המתיחה המשמש להתאמת פונקציית פיזור הביניים (הפרמטר s במשוואה עבור ISF המשמש כאן: + ). מעריכי המתיחה הממוצעים בטווח q של 0.4 ^μm-1 עד 9.4 ^μm-1 הם, מריכוז הווימנטין הגבוה ביותר לנמוך ביותר, 0.53 ± 0.07, 0.64 ± 0.02 ו-0.86 ± 0.04 (סטיית תקן ± ממוצעת). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור S2 משלים: פונקציות פיזור הביניים מ-DDM ו-SPT. מוצגות פונקציות פיזור הביניים (ISF) עבור חמישה מספרי גל שונים. זמן ה-ISF לעומת ההשהיה שנמצא באמצעות DDM משורטט עם סמנים מעגליים, וה-ISF מחושב ממסלולים של חלקיק יחיד עם ריבועים פתוחים. קווים שחורים מנוקדים מראים את ההתאמות ל- ISFs שנרכשו על ידי DDM. ה- ISF מחושב ממסלולים של חלקיק יחיד, , באמצעות . ב-(A), ה-ISF מוצג עבור חלקיקי 0.6 מיקרומטר ברשתות 19 μM vimentin. ב-(B), ה-ISF מוצג עבור חלקיקי 0.6 מיקרומטר ברשתות הווימנטין של 34 μM. הפערים ב- ISF שנמצאו מ- DDM ו- SPT נובעים ככל הנראה ממספר מוגבל של מסלולי זמן השהיה ארוכים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1: פרוטוקול לשימוש ב- DDM. הקלט והפלט של השלבים המוצגים בפרוטוקול מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: פרטים על הכנה לדוגמה וקבצי פרמטרים לדוגמה עבור רשתות vimentin. שלבים מפורטים להכנת דגימה ורכישת תמונה ברשתות vimentin מסופקים. בנוסף, מסופק גם קובץ פרמטרים לדוגמה לניתוח הנתונים המוצגים בסעיף התוצאות הייצוגיות ברשתות vimentin. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

חבילת התוכנה המתוארת כאן משתמשת ב- DDM כדי לנתח תנודות צפיפות שנצפו בתמונות שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ אופטי. תוצאות מייצגות מהנתונים של חלקיקי עוקבים המוטמעים ברשתות וימנטין הוצגו לראשונה. ניתוח של נתונים כאלה יכול לשמש כדי לאפיין את גודל הרשת ואת נוקשותה של הרשת באופן דומה לאופן שבו נעשה שימוש במעקב אחר חלקיקים בודדים במחקרים רבים בעבר של רשתות שלד ציטוסקלטון ^6,12,13. יתרון של שימוש ב-DDM על פני מעקב אחר חלקיקים בודדים הוא ש-DDM אינו דורש שהחלקיקים יהיו מקומיים. לכן, אפילו בתמונות שבהן צפיפות החלקיקים גבוהה מדי או החלקיקים קטנים מכדי למקם אותם ולעקוב אחריהם, DDM עדיין יכול לקבוע את הדינמיקה. המקום שבו מעקב אחר חלקיקים בודדים יהיה יתרון הוא כאשר בוחנים את השתנות החלקיק לחלקיק. עם DDM, מוצאים את הדינמיקה הממוצעת של ההרכב, בעוד שעם מעקב אחר חלקיקים בודדים, ניתן לחשב הן את ה-MSD של חלקיק בודד והן את ה-MSD הממוצע של אנסמבל. עם זאת, ניתן להשתמש ב- DDM כדי לחקור דינמיקה הטרוגנית על ידי ניתוח מספר אזורי עניין בתוך שדה ראייה גדול.

לאחר מכן, תוצאות מייצגות מנתונים של חוטים המסומנים באופן פלואורסצנטי ברשת פעילה המורכבת משני סוגי חוטי שלד ציטוסקטליים המסומנים באופן שונה הוצגו¹¹. עם נתונים אלה, התנועה הבליסטית אופיינה ללא צורך בתכונות מקומיות כלשהן בתוך התמונה. מכיוון ש-DDM מחלץ את הדינמיקה הממוצעת של האנסמבל עם מעט קלטי משתמשים, הוא הופך את ההשוואה בין סדרות תמונות שנרכשו עם תנאים שונים לפשוטה (למשל, השוואת דגימות עם יחסים שונים של אקטין למיקרוטובולים או דגימות עם ריכוזים שונים של מיוזין, כפי שנעשה^ב-50). בנוסף, באמצעות הדמיה פלואורסצנטית, אנו יכולים לחקור את הדינמיקה של רכיבים שונים של רשת באמצעות תיוג צבעוני. זה נעשה^ב-11,50, שם הדינמיקה של אקטין ושל מיקרוטובולים נותחה בנפרד ברשת מרוכבת אקטין-מיקרוטובול פעילה באמצעות הדמיה צבעונית. בסעיף התוצאות הייצוגיות כאן הוצגו רק התוצאות מערוץ המיקרוטובול, אך בעבודה קודמת השווינו את הדינמיקה של חוטי המיקרוטובול והאקטין¹¹.

נציין כי תוצאות מייצגות אלה מציגות תת-דיפוזיה פסיבית או תנועה בליסטית אקטיבית. חשוב לציין, ניתן להשתמש ב- DDM כדי לנתח מערכות שבהן יש הצלבה בסוג הדינמיקה בסקאלות זמן ביניים או אורך. כדוגמאות, Kurzthaler et al. השתמשו ב- DDM עם מערכת של קולואידים פעילים של Janus כדי לחקור תנועה מכוונת פעילה בקני מידה של זמן קצר ואקראיזציה של הכיוון בסולמות זמן ארוכים יותר⁵⁹; Giavazzi et al. השתמשו ב-DDM עם קצף גס ומצאו קרוסאובר בדינמיקה המתאימה לסולם האורך של בועה³³; ו-Cho et al. השתמשו ב-DDM עם ג'לים קולואידיים ומצאו שלושה משטרים הניתנים להבחנה בקני מידה שונים באורך שונה, החל מאשכולות הפרקטל ועד לרשת³² כולה.

הנתונים שנכללו בסעיף התוצאות הייצוגיות נרכשו באמצעות מיקרוסקופיית ברייטפילד ומיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר. עם זאת, כפי שצוין קודם לכן, ניתן להשתמש ב- DDM עם שיטות הדמיה רבות. עם כל שיטת הדמיה, משתמשים צריכים לשקול הגדרות אופטיות כגון מידת החתך האופטי או עומק השדה. רמה גבוהה של חתך אופטי עשויה להפחית את האות מעצמים מחוץ למיקוד, אך לא ניתן יהיה למדוד במדויק את הדינמיקה על פני צירי זמן גדולים יותר מציר הזמן שבו אובייקטים יזוזו מעומק השדה^25,28. דיון מעמיק יותר באופן שבו עומק השדה התלוי ב-q משפיע על ניתוח DDM ניתן למצוא^ב-22. עבור הדמיית שדה בהיר, ייתכן שהמשתמשים יצטרכו גם לקחת בחשבון את עובי הדגימה. בעוד שעבור דגימות פיזור חלשות, דגימות עבות יותר עשויות לספק יותר אות⁴², דגימות עכורות עשויות לדרוש שינוי של הניתוח כך שיתחשב בפיזור מרובה⁸¹. לבסוף, עבור שיטות הדמיה שאינן אינווריאנטיות של מרחב ליניארי (כלומר, כאשר העוצמה שנרשמה על ידי המצלמה של אובייקט תלויה היכן אותו אובייקט נמצא במישור הדגימה x-y), ייתכן שיהיה צורך להסביר את שונות המרחב הליניארי, כפי שהודגם עם שדה כהה DDM²⁷.

עבור אלה שמתחילים עם DDM, אנו מבקשים להדגיש את החשיבות של התחשבות ברזולוציה המרחבית והזמנית. כאשר בוחנים את זמני הדעיכה שנקבעו כפונקציה של מספר גלים, חשוב לסמן את גבולות הרזולוציה של האדם (כלומר, זמני ההשהיה המרביים והמינימום ומספר הגלים המרבי, כפי שנעשה באיור 5). יש לחשוב היטב על מגבלות אלה לפני איסוף הנתונים, כך שניתן יהיה לבחור את העדשה האובייקטיבית האופטימלית, גודל התמונה, קצב הפריימים ומשך הסרט. השיקול החשוב הנוסף הוא כיצד להעריך את פרמטר הרקע B. בספרות נעשה שימוש בשיטות רבות להערכת הרקע, וההשפעות של הערכת יתר או הערכת חסר של B תוארו בפרסומים קודמים^62,77. כפי שניתן לראות באיור 10, PyDDM מאפשר למשתמשים ליישם שיטות שונות להערכת B, ואנו מציעים למשתמשים חדשים לנסות את השיטות האלה ולהעריך אילו מתאימות לשימוש.

חוזקה של חבילה זו היא התיעוד וההדרכה היסודיים שלה הכוללים נתונים לדוגמה, אחסון וארגון של מטא-נתונים כדי לעקוב אחר אופן ביצוע הניתוחים, והגמישות כיצד לנתח את מטריצת ה- DDM (מודלים מתאימים שונים, שיטות מרובות להערכת פרמטר הרקע B, היכולת למצוא את ה- MSD). עם זאת, ישנם היבטים מרובים לקוד זה שניתן לשפר. נכון לעכשיו, הקוד לא הותאם למהירות חישוב מהירה. שיטות להאצת החישוב דווחו^{על 61,62}, ואלה ייושמו במהדורות עתידיות. בנוסף, אנו מתכננים ליישם שיטות שדווחו לאחרונה כדי להעריך טוב יותר את אי הוודאות ולהשתמש בסימולציות להנחיית משתמשים למודל ISF^{62 המתאים}. לשיפורים אחרים, אנו מקווים שמשתמשים ייצרו איתנו קשר עם הצעות.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מצלמת CMOS, Orca-Flash 4.0	Hamatsu
F-127 Pluronic	Sigma Aldrich
Jupyter Notebook
Nanodrop	Thermo Fisher
Nikon Ti-Eclipse מיקרוסקופ	Nikon
PLL-PEG-bio	SuSos AG, Dü בנדורף, שוויץ
חרוזי פוליסטירן	סיגמא אולדריץ'
חלבון דיאליזה מיני קלטת	Thermo Fisher
PyDDM	אוניברסיטת סן דייגו	N/A	תוכנת קוד פתוח זמינה מ-https://github.com/rmcgorty/PyDDM