מאמר שיטה

שיטת ניקוי רקמות להדמיה עצבית מסולמות מזוסקופיים למיקרוסקופיים

DOI:

10.3791/63941

⸱

10 במאי 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroanatomy, Juntendo University Graduate School of Medicine, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Juntendo University Graduate School of Medicine, 3Advanced Research Institute for Health Sciences, Juntendo University, 4Department of Neuroscience, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Japan Society for the Promotion of Science, 6Department of Oral Anatomy and Neurobiology, Graduate School of Dentistry, Osaka University, 7Department of Multi-Scale Brain Structure Imaging, Juntendo University Graduate School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מספק שיטה מפורטת של הדמיה עצבית בפרוסת המוח באמצעות שיטת ניקוי רקמות, ScaleSF. הפרוטוקול כולל הכנת רקמות מוח, הבהרת רקמות, טיפול בפרוסות מנוקות והדמיית מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית של מבנים עצביים מרמות מזוסקופיות למיקרוסקופיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול מפורט מסופק כאן כדי לדמיין מבנים עצביים מרמות מזוסקופיות למיקרוסקופיות ברקמות המוח. מבנים עצביים הנעים בין מעגלים עצביים למבנים עצביים תת-תאיים מוצגים באופן חזותי בפרוסות מוח של עכברים המנוקות אופטית באמצעות ScaleSF. שיטת ניקוי זו היא גרסה שונה של ScaleS והיא שיטה הידרופילית לניקוי רקמות עבור פרוסות רקמה שמשיגה יכולת ניקוי חזקה כמו גם רמה גבוהה של שימור אותות פלואורסצנטיים ושלמות מבנית. תא הדמיה תלת-ממדי (תלת-ממדי) הניתן להתאמה אישית (3D) מתוכנן להרכבה אמינה של רקמות מוח מנוקות. מוחות עכברים שהוזרקו להם וקטור נגיף הקשור לאדנו הנושא גן חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר תוקנו עם 4% פרפורמלדהיד ונחתכו לפרוסות בעובי של 1 מ"מ עם פרוסת רקמה רוטטת. פרוסות המוח נוקו על ידי ביצוע פרוטוקול הסליקה, הכולל דגירות עוקבות בשלוש תמיסות, כלומר, תמיסת ScaleS0, מלח חיץ פוספט (–) ותמיסת ScaleS4, בסך הכל 10.5–14.5 שעות. פרוסות המוח המנוקות הותקנו על תא ההדמיה והוטמעו בג'ל אגרוז של 1.5% שהומס בתמיסת ScaleS4D25(0). רכישת התמונה התלת-ממדית של הפרוסות בוצעה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי המצויד בעדשה אובייקטיבית מרובת טבילות של מרחק עבודה ארוך. החל מהדמיה עצבית מזוסקופית, הצלחנו לדמיין מבנים עצביים תת-תאיים עדינים, כגון עמודי שדרה דנדריטיים ובוטונים אקסונאליים, בפרוסות המוח המנוקות אופטית. פרוטוקול זה יקל על הבנת המבנים העצביים מקנה מידה של מעגלים לרכיבים תת-תאיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות ניקוי רקמות שיפרו הדמיה בלתי תלוית עומק של דגימות ביולוגיות וקליניות באמצעות מיקרוסקופיה קלה, ואפשרו מיצוי של מידע מבני על רקמות שלמות 1,2. טכניקות ניקוי אופטיות עשויות גם להאיץ, ולהפחית את העלות עבור ניתוח היסטולוגי. נכון לעכשיו, קיימות שלוש גישות סליקה עיקריות: שיטות הידרופיליות, הידרופוביות ומבוססות הידרוג'ל 1,2. הגישות ההידרופיליות עולות בשמירה על אותות פלואורסצנטיים ושלמות הרקמות והן פחות רעילות בהשוואה לשתי הגישות האחרות 3,4.

שיטת סליקה הידרופילית, ScaleS, מחזיקה בעמדה ייחודית עם שימור השלמות המבנית והמולקולרית שלה, כמו גם יכולת הסליקה החזקה (ספקטרום ניקוי-שימור)5. במחקר קודם פיתחנו פרוטוקול סליקה מהיר ואיזומטרי, ScaleSF, לפרוסות רקמה (בעובי של כ-1 מ"מ) על ידי שינוי הליך הסליקה של ScaleS6. פרוטוקול סליקה זה דורש דגירות עוקבות של פרוסות מוח בשלושה פתרונות למשך 10.5-14.5 שעות. השיטה מוצגת עם ספקטרום גבוה של ניקוי-שימור, התואם אפילו לניתוח מיקרוסקופיית אלקטרונים (EM) (איור משלים 1), המאפשר הדמיה תלת-ממדית (תלת-ממדית) רב-ממדית ברזולוציה גבוהה (3D) עם שחזור אותות מדויק6. לפיכך, ScaleSF צריך להיות יעיל במיוחד במוח, שבו תאי עצב מפרטים תהליכים שופעים באורך עצום, ומסדרים מבנים תת-תאיים עדינים מיוחדים להעברת וקבלת מידע. חילוץ מידע מבני עם קשקשים מרמות מעגליות לתת-תאיות על תאים עצביים הוא די שימושי להבנה טובה יותר של תפקודי המוח.

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט להדמיית מבנים עצביים עם קשקשים מהרמה המזוסקופית/מעגלית לרמה המיקרוסקופית/תת-תאית באמצעות ScaleSF. הפרוטוקול כולל הכנת רקמות, הבהרת רקמות, טיפול ברקמות מנוקות והדמיית מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית (CLSM) של רקמות מנוקות. הפרוטוקול שלנו מתמקד בחקירת מבנים עצביים מקנה מידה של מעגלים לרכיבים תת-תאיים. לקבלת הליך מפורט להכנת הפתרונות והזרקה סטריאוטקסית של וקטורים הקשורים לנגיף אדנו (AAV) למוחם של עכברים, עיין ב- Miyawaki et al. 20167 ו- Okamoto et al. 20218, בהתאמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'ונטנדו (אישור מס '2021245, 2021246) ובוצעו בהתאם להנחיות היסוד לביצוע נכון של ניסויים בבעלי חיים על ידי המועצה המדעית של יפן (2006). כאן נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים שהוזרקו להם וקטור AAV הנושאים גן משופר של חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) ועכברים מהונדסים (PV)/myristoylation (PV)/myristoylation-EGFP-קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה C-terminal בקטריאלי כרומוזום מלאכותי (BAC) עכברים מהונדסים (PV-FGL)9 . עכברי PV-FGL נשמרו ברקע C57BL/6J. לא נמצאו הבדלים בין המינים ביחס למחקר זה.

1. הכנת רקמות

  1. קיבוע פרפוזיה
    הערה: בצע את שלבים 1.1.1 עד 1.1.3 במכסה אדים כדי להגביל את החשיפה לפרפורמלדהיד (PFA).
    1. מרדימים עכברים זכרים בוגרים (בני 8-16 שבועות) על ידי הזרקה תוך-צפקית של מנת יתר של נתרן פנטוברביטל (200 מ"ג/ק"ג). אשרו את הלימות ההרדמה על ידי היעדר נסיגה מכווצת בוהן ורפלקסים של מצמוץ עיניים.
    2. פותחים את חלל בית החזה וחותכים את תוספתן הפרוזדורים הימני עם מספריים כירורגיים. מחדירים לעכברים 20 מ"ל של מלח חיץ פוספט קר כקרח (PBS) באמצעות מחט של 23 גרם המחוברת למזרק של 20 מ"ל, ולאחר מכן זלוף של 20 מ"ל של 4% PFA קר כקרח ב-0.1 M מאגר פוספט (PB) באמצעות מזרק נוסף של 20 מ"ל.
      אזהרה: PFA הוא רעיל וטרטוגני. יש להימנע משאיפה או ממגע עם העור, העיניים והממברנה הרירית.
    3. הסר רקמות מוח מהגולגולת באמצעות פינצטה. מעבירים את רקמות המוח לצינור של 15 מ"ל המכיל 4% PFA ב-0.1 M PB, מגנים על הדגימות מפני אור, ומתנדנדים בעדינות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס על שייקר ב-50-100 סל"ד.
    4. הערה: ניתן לאחסן את רקמות המוח שנקטפו במשך מספר שבועות ב-0.02% נתרן אזיד (NaN3) ב-PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      אזהרה: NaN3 הוא רעיל. יש להימנע משאיפה או ממגע עם העור, העיניים והממברנה הרירית. טפלו בו בתוך מכסה אדים.
  2. הכנת פרוסת מוח
    1. הכן 4% אגר ב- PBS על ידי הוספת 2 גרם של אגר ל-50 מ"ל של PBS. מחממים את התערובת עד שהאגר מומס במלואו. תנו לפתרון להתקרר ל-40-45 מעלות צלזיוס.
      הערה: התכונה הצמיגית המסופקת על ידי אגרופקטין, מרכיב עיקרי של אגר, משפרת את קלות החיתוך של פרוסות טישו.
    2. הוסיפו 10 מ"ל של תמיסת האגר לצלחת תרבית של 6 בארות. להטביע את רקמת המוח בתמיסת האגר באמצעות מלקחיים. תנו לאגר להתמצק על הקרח.
    3. הסר את רקמת המוח המוטבעת מהבאר וגזוז את האגר באמצעות סכין גילוח. הצמידו את גוש האגר לתחתית אמבט הוויברטום בעזרת superglue ושפכו 0.1 M PB למגש החיץ.
    4. נקו סכין גילוח נוסף באמצעות נייר טישו נטול מוך ספוג באתנול והצמידו את הלהב למחזיק הלהב של פרוסת הרקמות הרוטטות.
    5. הגדר את מהירות החתך ל-0.14 מ"מ לשנייה עם משרעת של 1.4 מ"מ והתדר ל-75-77 הרץ. חתך את רקמת המוח לפרוסות בעובי 1 מ"מ ואסוף את הפרוסות בלוח תרבית תאים בן 6 בארות המכיל PBS.
      הערה: ניתן לאחסן את פרוסות המוח במשך מספר שבועות ב-0.02% NaN3 ב-PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

2. הבהרת רקמות

הערה: ההרכבים של פתרונות ScaleS המשמשים מפורטים בטבלה 1. דגימות צריכות להיות מוגנות מפני אור על ידי כיסוי בנייר כסף. שלבי הסליקה מוצגים באיור 1A.

  1. הוסיפו 8 מ"ל של תמיסת ScaleS0 לבאר אחת של צלחת תרבית תאים בת 6 בארות והוסיפו 8 מ"ל של תמיסת ScaleS4 לבאר אחרת של הצלחת וחום מראש ל-37 מעלות צלזיוס באינקובטור.
  2. מעבירים את פרוסות המוח לתמיסת ScaleS0 שחוממה מראש עם מרית ואינקובציה למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב-90 סל"ד.
  3. מעבירים את פרוסות המוח החודרות ב-8 מ"ל של PBS(–) בצלחת תרבית תאים של 6 בארות עם מרית ושוטפים במשך 15 דקות על ידי שמירה על שייקר מסלולי ב-40-60 סל"ד. חזור על כך פעמיים.
  4. מעבירים את פרוסות המוח ב-8 מ"ל המחוממים מראש של תמיסת ScaleS4 עם מרית ומנקים אותן על ידי דגירה באינקובטור רועד ב-90 סל"ד למשך 8-12 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ניתן לראות פרוסות מוח מנוקות באיור 1.

3. הרכבה של פרוסת המוח

הערה: תא הדמיה הניתן להתאמה אישית משמש להרכבה אמינה של פרוסות מוח מנוקות (איור 2)6. התא מורכב ממסגרת התא והכיסוי התחתון. מתאמי שלב המיקרוסקופ מתוכננים גם להרכיב את תא ההדמיה על שלבי המיקרוסקופ ישירות (איור 2A,B). ניתן להדפיס בתלת-ממד את מתאמי שלב מסגרת התא והמיקרוסקופ באמצעות שירותי הדפסה תלת-ממדית פנימיים או במיקור חוץ. נתוני תכנון תלת-ממדי בעזרת מחשב (CAD) של תא ההדמיה מסופקים ב- Furuta et al. 20226.

  1. להכנת התא, חברו את מסגרת התא לכיסוי באמצעות דבק רגיש ללחץ.
  2. הכן 1.5% אגרוז בתמיסת ScaleS4D25(0) (ג'ל ScaleS4) על ידי הוספת 1.5 גרם אגרוז ל-100 מ"ל של התמיסה בבקבוק. מערבבים היטב את התמיסה על ידי ערבוב ומיקרוגל של התמיסה עד שהאגרוז מומס במלואו. לאחר שתסיים, אפשרו לפתרון להתקרר ל-37 מעלות צלזיוס.
  3. הרכיבו את פרוסת המוח המנוקה על הכיסוי התחתון של תא ההדמיה בעזרת מרית. נגבו את התמיסה העודפת מהפרוסה שפונה באמצעות נייר טישו נקי ללא מוך.
  4. הוסיפו את הג'ל ScaleS4 על פרוסת המוח באמצעות מיקרופיפט כדי למלא את תא ההדמיה. מניחים כיסוי נוסף על גבי מלקחיים ומניחים פיסת נייר טישו נטולת מוך ומגלשת זכוכית על הכיסוי בסדר זה.
  5. העבירו את תא ההדמיה למקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מניחים משקולות מתכת על מגלשת הזכוכית ומשאירים אותן למשך 30 דקות.
  6. הסר את משקולות המתכת, החלקת הזכוכית, נייר טישו נטול מוך וכיסויים מתא ההדמיה, וניגב את הג'ל העודף (איור 2A,B).
  7. מניחים את תא ההדמיה בצלחת פטרי מזכוכית בקוטר 60 מ"מ ומחברים את שפת תא ההדמיה לצלחת עם דבק רגיש ללחץ דמוי מרק. חברו את החדר במספר נקודות לצלחת הפטרי.
  8. יוצקים תמיסת ScaleS4 בצלחת ומנערים בעדינות במשך שעה אחת בטמפרטורה של 20-25 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולי ב-40-60 סל"ד. החליפו בתמיסה טרייה והסירו בועות אוויר על משטח הג'ל על ידי גירוד עדין של המשטח באמצעות קצה פיפטה של 200 μL. הרכיבו את תא ההדמיה השקוע על במת מיקרוסקופ (איור 2C).

4. הדמיית CLSM

  1. השג תמונות באמצעות CLSM המצויד בעדשה אובייקטיבית מרובת טבילות של מרחק עבודה ארוך (WD) (16x/0.60 מפתח צמצם מספרי [NA], WD = 2.5 מ"מ).
    הערה: עדשות אובייקטיביות בעלות NA גבוהה יכולות לספק רזולוציה מוגבלת עקיפה גבוהה.
  2. הפעל את כל ציוד ההדמיה הרלוונטי (תחנת עבודה, מיקרוסקופ, סורק, לייזרים ומנורת כספית) והפעל תוכנת הדמיה CLSM.
  3. הגדר את צווארון התיקון של העדשה האובייקטיבית מרובת הטבילות ל- 1.47. לתמיסת ScaleS4 יש מקדם שבירה (RI) של כ-1.47 5,7. סטיות הנגרמות על-ידי אי-התאמה של RI עלולות להפריע להיווצרות התמונה (איור 3).
  4. לטבול את העדשה האובייקטיבית בתמיסה, ולתת לה להתקרב לפרוסה לאט. הסר את בועות האוויר הכלואות בקצה העדשה האובייקטיבית. מצא אזורי עניין (ROIs) ברקמות המנוקות באמצעות אפיפלואורסצנציה.
  5. הגדר פרמטרים של רכישת תמונה על-ידי בדיקת הגדרות מתאימות.
    1. קבע את עומק הסיביות עבור רכישת תמונה. גודל הנתונים של התמונה גדל עם עומק הסיביות.
    2. הגדר את אורך הגל של הגילוי. התאם את השער המתאים לגלאי בהתאם לספקטרום הפליטה. ודא שאורך הגל של הגילוי אינו מכסה קווי לייזר כלשהם.
    3. הגדר את רזולוציית xy . פורמטים גדולים יותר מספקים רזולוציות xy טובות יותר, אך לוקח זמן רב יותר לאסוף את התמונות.
    4. הגדר את מהירות הסריקה. מהירות סריקה איטית יותר מספקת יחס אות לרעש גבוה. עם זאת, הוא גם מגדיל את זמן השהייה של הפיקסלים ואת הסיכון להלבנת תמונות. בחר בהתאם.
    5. התאם את גודל חור הסיכה. גודל חור הפין שולט בעובי המקטע האופטי. גודל חור סיכה קטן יותר יוצר מקטע אופטי דק יותר, ולכן רזולוציית z טובה יותר, אך מקטין את האות הפלואורסצנטי. הגדלת גודל חור הפין מספקת מקטע אופטי עבה יותר עם אות פלואורסצנטי חזק יותר.
    6. הגדר את עוצמת הלייזר, את רווח הגלאי/מגבר והסט. הגדל בהדרגה את כוח הלייזר ואת רווח הגלאי/מגבר עד לקבלת תמונה מתאימה. עוצמת לייזר גבוהה נושאת את הסיכון של הלבנת תמונות. התאם את ההיסט (ניגודיות) כראוי כדי לקבל יחס אות לרעש גבוה.
    7. קבע את שטח העיבוד הדרוש בהתבסס על גודל ההחזר על ההשקעה. ודא שכל האורך והרוחב של ההחזר על ההשקעה נלכדים.
    8. נווטו ברקמות המנוקות בכל המישורים, והגדירו את נקודות ההתחלה והסיום של הערימה. הגדר את גודל הצעד z בהתאם לרזולוציית z הרצויה.
  6. אסוף תמונות כאשר הן מרוצות מהגדרות רכישת התמונות, והקליט תמונות שצולמו. לעבד את התמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניקוי אופטי של פרוסת מוח של עכבר בעובי 1 מ"מ הושג באמצעות פרוטוקול זה. איור 1B מייצג תמונות שידור של פרוסת מוח של עכבר לפני ואחרי הטיפול בפינוי. שיטת ניקוי הרקמות הפכה פרוסת מוח עכברית בעובי 1 מ"מ לשקופה. הרחבה קלה בגדלים הסופיים של פרוסות המוח נמצאה לאחר הדגירה בתמיסת הסליקה במשך 12 שעות (הרחבה ליניארית: 102.5% ± 1.3%). השימור של פלואורסצנציה ושלמות המבנית של הרקמות הוערך באמצעות ביטוי EGFP ממוקד בקרום הפלזמה בעכברי PV-FGL (איור 1C). בעכברים אלה, EGFP ממוקד קרום סומטודנדריט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלבים קריטיים בפרוטוקול
ישנם כמה שלבים קריטיים בפרוטוקול שיש לבצע בזהירות מרבית כדי להשיג תוצאות משמעותיות. קיבוע אחיד של דגימות הוא הכרחי להדמיה תלת-ממדית בתוך רקמות בקנה מידה גדול. העדשה האובייקטיבית, המדגם ונוזל הטבילה צריכים להיות בעלי RI תואם. אי-התאמה של RI ביניהם תוביל להדמיה מופרעת מאוד של תאים המבטאים EGFP בתוך פרוסות המוח המנוקות (איור 3). התאמת צווארון התיקון של העדשה האובייקטיבית לנוזל הטבילה ממזערת סטיות כדוריות המושרות בעומק כדי למקסם את האות, הניגודיות והרזולוציה המרחבי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים ליוקו אישידה (אוניברסיטת ג'ונטנדו) על ייצור וקטור AAV ולקיסארה הושינו (אוניברסיטת ג'ונטנדו) על הסיוע הטכני. מחקר זה נתמך על ידי JSPS KAKENHI (JP20K07231 עד K.Y.; JP21H03529 עד T.F.; JP20K07743 עד M.K.; JP21H02592 עד H.H.) ומחקר מדעי על אזור חדשני "תהודה ביו" (JP18H04743 עד H.H.). מחקר זה נתמך גם על ידי הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (AMED) (JP21dm0207112 ל- T.F. ו- H.H.), מו"פ Moonshot מסוכנות המדע והטכנולוגיה של יפן (JST) (JPMJMS2024 עד H.H.), מחקר מונחה היתוך למדע וטכנולוגיה משבשים (יער) מ- JST (JPMJFR204D עד H.H.), מענקים בסיוע ממכון המחקר למחלות זקנה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ונטנדו (X2016 עד K.Y.; X2001 ל-H.H.), ופרויקט מיתוג בתי הספר הפרטיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
16x עדשה אובייקטיבית מרובת טבילהLeica MicrosystemsHC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR
AgarNacalai Tesque01028-85
AgaroseTaKaRa BioL03
דימתיל סולפוקסידNacalai Tesque13407-45
D-סורביטולNacalai Tesque06286-55
γ- ציקלודקסטריןWako Pure Chemical Industries037-10643
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G9012
HuygensEssential Scientific Volume Imagingver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b
ImarisBitplanever. 9.0.0
Leica Application Suite XLeica MicrosystemsLAS X, ver. 3.5.5.19976
מתיל-ובטא;-ציקלודקסטריןטוקיו התעשייה הכימיתM1356
ParaformaldehydeMerck Millipore1.04005.1000
פוספט תמיסת מלח בופר (10x; pH 7.4)Nacalai Tesque27575-3110x PBS(–)
נתרן אזידNacalai Tesque31233-55
נתרן פנטוברביטלKyoritsu SeiyakuN/A
TCS SP8Leica MicrosystemsN/A
Triton X-100Nacalai Tesque35501-15
OreaNacalai Tesque35940-65
פורס רקמות רוטטDosaka EMPRO7N

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  2. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  3. Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
  4. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
  5. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  6. Furuta, T., et al. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 25 (1), 103601(2022).
  7. Miyawaki, A., et al. Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy. Protocol Exchange. , (2016).
  8. Okamoto, S., et al. Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system. STAR Protocols. 2 (1), 100230(2021).
  9. Kameda, H., et al. Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites. The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).
  10. Sohn, J., et al. A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system. PLoS One. 12 (1), 0169611(2017).
  11. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  12. Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).
  13. Kuramoto, E., et al. Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors. Cerebral Cortex. 19 (9), New York, N.Y. 2065-2077 (2009).
  14. Matsuda, W., et al. Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
  15. Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
  16. Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
  17. Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6, 34331(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים