באמצעות שימוש בפולימר קטיוני פולימרי זול פוליאתילן (PEI), ייצרנו חלקיקים לנטי-ויראליים לביטוי יציב של shRNA בתאי גזע עובריים אנושיים H9 (hESCs) ותאי אב עצביים שמקורם ב-H9 (NPCs) שעברו התמרה חולפת ביעילות גבוהה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Lentiviral מתווך אספקה של shRNA ל- hESCs ו- NPCs באמצעות פולימר קטיוני בעלות נמוכה Polyethylenimine (PEI)
במאמר זה
סיכום
תקציר
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בחלקיקים לנטי-ויראליים להעברת רנ"א קצרים (shRNA) הן לתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) והן לתאי אב עצביים (NPCs) המופקים מ-hESCs ביעילות גבוהה. חלקיקים לנטי-ויראליים נוצרו על-ידי טרנספקציה משותפת של תאי HEK293T באמצעות וקטורים של כניסה (הנושאים shRNA) יחד עם פלסמידי אריזה (pAX ו-pMD2.G) תוך שימוש בפולימר קטיוני בעלות נמוכה של פוליאתילן פולימרי קטיוני (PEI). חלקיקים נגיפיים התרכזו באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה, מה שהביא לממוצע טיטרים מעל 5 x 107. גם hESCs וגם NPCs יכולים להיות נגועים ביעילות גבוהה באמצעות חלקיקים לנטי-ויראליים אלה, כפי שמוצג על ידי בחירת פורומיצין וביטוי יציב ב- hESCs, כמו גם ביטוי GFP חולף ב- NPCs. יתר על כן, ניתוח כתמים מערבי הראה ירידה משמעותית בביטוי של גנים הממוקדים על ידי shRNA. בנוסף, התאים שמרו על הפלוריפוטנטיות שלהם כמו גם על פוטנציאל ההתמיינות שלהם, כפי שמעידה ההתמיינות שלהם לאחר מכן לשושלות שונות של מערכת העצבים המרכזית. הפרוטוקול הנוכחי עוסק במסירת shRNA; עם זאת, אותה גישה יכולה לשמש לביטוי חוץ רחמי של cDNAs למחקרי ביטוי יתר.
מבוא
תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) שמקורם במסת התאים הפנימיים של הבלסטוציסט הם פלוריפוטנטיים וניתן להתמיין ביניהם לסוגי תאים שונים בהתאם לגורמים חיצוניים בתנאים חוץ גופיים 1,2. על מנת לרתום באופן מלא את הפוטנציאל של hESCs, חובה על שיטות אספקת גנים מהירות ואמינות עבור תאים אלה. באופן קונבנציונלי, ניתן לסווג את הטכניקות המשמשות באופן נרחב לשני סוגים: מערכות העברת גנים לא ויראליות ונגיפיות 3,4. מערכות העברת הגנים הלא-ויראליות הנפוצות יותר הן שאיבת שומן, אלקטרופורציה וגרעין. מערכות אספקה לא ויראליות הן יתרון בגלל פחות מוטציות בהחדרה וירידה כוללת באימ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. טרנספקציה של תאי HEK293T באמצעות PEI או ריאגנט ליפופקטמין 3000
- תאי HEK293T בתרבית ב-DMEM + 10% FBS + 1x פניצילין/סטרפטומיצין ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם אטמוספירה של 5% CO2 ו-21% O2 עד שהם נפגשים ב-90% לפני הזריעה לטרנספקציה. השתמש במספר נמוך יחסית של תאים במעבר לייצור נגיפי טיטר גבוה (באופן אידיאלי פחות מ-P30).
- זרע 4 x 106 תאים ב-10 מ"ל של מדיום גדילה מלא בצלחת תרבית רקמה של 100 מ"מ וגדלים בן לילה באינקובטור תרבית רקמה לח עם אטמוספירה של 5% CO2 ו-21% O2.
- עבור כל טרנספקציה, דיללו את הדנ"א של פלסמיד (1 מ"ג/מ"ל) ב-1 מ"ל של מדיית DMEM נטולת סרום בצינורות צנטרי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לאחר העברת גנים, נדרשת בהכרח כדאיות גבוהה של hESCs. למרות המאמצים והאופטימיזציה של פרוטוקולים להפחתת מוות תאי בעקבות אלקטרופורציה של hESCs, יותר מ -50% מוות תאי עדיין נצפה לאחר אלקטרופורציה של תאים אלה, יחד עם יעילות טרנספקציה נמוכה20. העברת גנים בתיווך Lentiviral לא רק גורמת ליעילות גבוהה של העברת גנים, אלא גם מדגימה רמות גבוהות של כדאיות תאים לאחר התמרה. התוצאות שלהלן מציגות שתי גישות: האחת משתמשת ב-GFP ככתב ובביטוי חולף ב-NPCs שמקורם ב-HESCs והשנייה משתמשת בפורומיצין לבחירה יציבה של hESCs לניסו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
היכולת לשנות גנטית תאי גזע למטרות מחקר או קליניות מוגבלת הן על ידי הטכנולוגיה והן על ידי ההבנה הבסיסית של הביולוגיה של hESCs. טכניקות שהראו פוטנציאל משמעותי ב-ESCs של עכברים, כמו דלקת שומן ואלקטרופורציה, אינן יעילות במיוחד עבור hESCs, אשר ידועים לשמצה כקשים להעברת גנים בשיטות קונבנציונליות20. רעיון זה הוביל לא רק לאופטימיזציה של טכניקות קיימות, אלא גם לפיתוח שיטות חדשניות ליעילות טרנספקציה מוגברת ב- hESCs. המוקד של פיתוחים חדשים אלה היה העברת גנים יעילה ויציבה ל-hESCs תוך שמירה על השפעה מינימלית ע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר מאוניברסיטת איחוד האמירויות הערביות (UAEU), מענק # 31R170 (מרכז זאיד למדעי הבריאות) ו # 12R010 (מענק UAEU-AUA). אנו מודים לפרופ' רנדל מורס (מרכז וודסוורת', אולבני, ניו יורק) על שעזר לנו לערוך את כתב היד לסגנון ולדקדוק.
כל הנתונים זמינים על פי בקשה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 מ"ל, סטרילי + מאושר בחינם פתוח Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| bFGF רקומביננטי אנושי | Invitrogen | PHG0261 | |
| בקר סרום אלבומין FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
| קורנינג מטריג'ל מטריצת ממברנת מרתף, | קורנינג | 354234 | |
| טכנולוגיות תאי גזע | ציקלופמין | 72074 | |
| מדיה DMEM | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM תערובת תזונתית F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS עם: Ca ו-Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| סרום בובי עוברי | Invitrogen | 10270106 | |
| GAPDH (14C10) נוגדן mAb ארנב | CST | 2118S | |
| עדינים | טכנולוגיות תאי גזע | 7174 | |
| HyClone חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) תמיסה 100X | GE healthcare | SH30238.01 | |
| ליטר גלוטמין, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2HGDH נוגדן פוליקלונלי | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
| mTesR1 מדיה מלאה | טכנולוגיות תאי גזע | 85850 | |
| מדיום נוירובזאלי 1X CTS | תוסף Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 תוסף 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| סטרפטומיצין פניצילין SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pLKO.1 וקטור TRC | Addgene | 10878 | |
| pLL3.7 וקטור | Addgene | 11795 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| מגיב זיהום פוליברן | סיגמא | TR1003- G | |
| פוליאתילנימין, סיגמא מסועף | 408727 | ||
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| פורמורפמין | טוקריס | 4551/10 | |
| פורומיצין | אינוויטרוגן | ||
| מעכב A1113802 ROCK Y-27632 דיהידרוכלוריד | טוקריס | 1254 | |
| SB 431542 | טוקריס | 1614/10 | |
| טריפסין .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
מקורות
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
