הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיית PET/MR לא פולשנית במודל עכבר אורתוטופי של קרצינומה הפטוצלולרית

2.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63958

⸱

31 באוגוסט 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Diagnostic Radiology, School of Clinical Medicine, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2Department of Oncology, MRC Oxford Institute for Radiation Oncology, University of Oxford, 3Department of Surgery, School of Clinical Medicine, HKU-SZH & LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 4Department of Biomedical Engineering, The Chinese University of Hong Kong, 5Department of Diagnostic and Interventional Radiology, Kwong Wah Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת קסנושתרים אורתוטופיים של קרצינומה הפטוצלולרית עם ובלי קשירת עורק הכבד ומבצעים הדמיית טומוגרפיה לא פולשנית של פליטת פוזיטרונים (PET) של היפוקסיה גידולית באמצעות [18 F]Fluoromisonidazole ([18 F]FMISO) ו- [18 F]Fluorodeoxyglucose ([18F]FDG).

תקציר

מודלים ניסיוניים פרה-קליניים של קרצינומה הפטוצלולרית (HCC) המחזירים מחלות אנושיות מייצגים כלי חשוב לחקר גידולים ולהערכת גישות טיפוליות חדשניות. הדמיה לא פולשנית של כל הגוף באמצעות טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) מספקת תובנות קריטיות לגבי מאפייני in vivo של רקמות ברמה המולקולרית בזמן אמת. אנו מציגים כאן פרוטוקול ליצירת קסנוגרפט HCC אורתוטופי עם וללא קשירת עורק כבד (HAL) כדי לגרום להיפוקסיה של הגידול והערכת חילוף החומרים של הגידול שלהם in vivo באמצעות [18 F]Fluoromisonidazole ([18 F]FMISO) ו- [18 F]Fluorodeoxyglucose ([18F]FDG) PET/הדמיית תהודה מגנטית (MR). ניתן היה לדמיין היפוקסיה של הגידול בקלות באמצעות סמן ההיפוקסיה [18 F]FMISO, ונמצא כי ספיגת [18 F]FMISO הייתה גבוהה יותר בעכברי HCC שעברו HAL מאשר בקבוצה שאינה HAL, בעוד [18F]FDG לא יכול היה להבחין בהיפוקסיה גידולית בין שתי הקבוצות. גידולי HAL הראו גם רמה גבוהה יותר של ביטוי גורם היפוקסיה (HIF)-1α בתגובה להיפוקסיה. כימות גידולי HAL הראה עלייה של פי 2.3 בספיגת [18F]FMISO בהתבסס על גישת ספיגת הערך המתוקנן (SUV).

מבוא

קרצינומה הפטוצלולרית (HCC) היא הסרטן השישי המאובחן ביותר וגורם המוות השלישי בשכיחותו מסרטן ברחבי העולם, עם יותר מ -900,000 מקרים חדשים ו -800,000 מקרי מוות בשנת 20201. גורם הסיכון העיקרי הוא שחמת הכבד, המתרחשת כתוצאה מזיהומים ויראליים (נגיפי הפטיטיס B ו- C), שימוש לרעה באלכוהול, סוכרת וסטאטוהפטיטיס2 שאינו אלכוהולי. הניהול של HCC הוא מורכב למדי, ומספר אפשרויות טיפול זמינות, כולל כריתה כירורגית, אבלציה תרמית או כימית, השתלה, כימואמבוליזציה transarterial, הקרנות, וכימותרפיה, בהתאם למחלה היערכות 2,3. HCC הוא גידול עמיד לכימותרפיה עם הישנות המחלה בעד 70% מהחולים לאחר טיפול בכוונת ריפוי2.

למרות הרמה הגבוהה של הטרוגניות הגידול, HCC קשור לשתי תוצאות נפוצות: (i) HCC הוא היפוקסי מאוד, ו (ii) היפוקסיה הגידול קשורה לאגרסיביות גדולה יותר של הגידול וכישלון הטיפול. התרבות בלתי מבוקרת של תאי HCC גורמת לקצב צריכת חמצן גבוה שקודם לכלי הדם, ובכך יוצרת מיקרו-סביבה היפוקסית. רמות חמצן תוך-גידוליות נמוכות מעוררות מגוון תגובות ביולוגיות המשפיעות על תוקפנות הגידול ועל תגובת הטיפול. גורמים המושרים להיפוקסיה (HIFs) מוכרים לעתים קרובות כווסתי התמלול החיוניים בתגובה להיפוקסיה 2,3. לפיכך, היכולת לזהות היפוקסיה היא חיונית כדי לדמיין רקמות ניאופלסטיות ולזהות את האתרים הבלתי נגישים, אשר דורשים הליכים פולשניים. זה גם עוזר להבין טוב יותר את השינויים המולקולריים שמובילים לאגרסיביות הגידול ולשפר את תוצאות הטיפול בחולה.

הדמיה מולקולרית באמצעות טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) משמשת בדרך כלל באבחון ובימוי של סוגי סרטן רבים, כולל HCC. בפרט, השימוש המשולב של הדמיית PET נותב כפול המערב [18 F]Fluorodeoxyglucose ([18F]FDG) ו [11C]אצטט יכול להגדיל באופן משמעותי את הרגישות הכוללת באבחון HCC 4,5. הדמיה של היפוקסיה, לעומת זאת, יכולה להיות מושגת באמצעות סמן היפוקסי נפוץ [18 F]Fluoromisonidazole ([18F]FMISO). בפרקטיקה הקלינית, הערכה לא פולשנית של היפוקסיה חשובה כדי להבדיל בין סוגים שונים של גידולים ואזורים לתכנון טיפול קרינתי6.

הדמיה פרה-קלינית הפכה לכלי חיוני להערכה לא פולשנית ואורכית של מודלים עכבריים למחלות שונות. מודל HCC חזק וניתן לשחזור מייצג פלטפורמה חשובה למחקר פרה-קליני ותרגומי לפתופיזיולוגיה של HCC אנושי ולהערכת טיפולים חדשניים. יחד עם הדמיית PET, ניתן להבהיר התנהגויות in vivo כדי לספק תובנות חשובות ברמה המולקולרית עבור כל נקודת זמן נתונה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת קסנוגרפטים אורתוטופיים של HCC קשירת עורק כבד (HAL) וניתוח חילוף החומרים של גידולי in vivo שלהם באמצעות [18 F]FMISO ו- [18F]FDG PET/MR. השילוב של HAL יוצר מודל מתאים של עכברי HCC טרנסגניים או כימיים כדי לחקור היפוקסיה גידולית in vivo, שכן HAL יכול לחסום ביעילות את אספקת הדם העורקית כדי לגרום להיפוקסיה תוך גידולית 7,8. בנוסף, שלא כמו צביעה אימונוהיסטוכימית ex vivo באמצעות pimonidazole, שינויים בחילוף החומרים של הגידול כתוצאה מהיפוקסיה ניתנים להדמיה קלה ולכימות מדויק באופן לא פולשני באמצעות הדמיית PET, המאפשרת הערכה אורכית של תגובת הטיפול או מדידת הופעת עמידות 3,7,8 . השיטה שלנו המוצגת כאן מאפשרת יצירת מודל HCC היפוקסי חזק יחד עם ניטור לא פולשני של היפוקסיה גידולית באמצעות הדמיית PET/MR לחקר ביולוגיה של HCC in vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לוועדה לשימוש בבעלי חיים בהוראה ובמחקר (CULATR) במרכז לחקר רפואה השוואתית (CCMR) באוניברסיטת הונג קונג, תוכנית המוכרת על ידי האגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה בינלאומיות (AAALAC). החיות ששימשו במחקר היו נקבות עכברים BALB/cAnN-nu (עירום) בגיל 6-8 שבועות, במשקל של 20 גרם ± 2 גרם. מזון ומים סופקו עד לליביטום.

1. הזרקה תת עורית של קווי תאי קרצינומה הפטוצלולרית האנושית

הערה: MHCC97 הוא קו תאי HCC אנושי המשמש ליצירת מודל HCC xenograft תת עורי. תאי MHCC97L מתקבלים מהמכון לסרטן הכבד, בית החולים Zhongshan של אוניברסיטת פודאן, שנחאי, הרפובליקה העממית של סין9 ומאומתים על ידי פרופיל חוזר טנדם קצר (STR).

  1. תרבית תאי MHCC97L ושמירה בתרבית בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין וסטרפטומיצין בבקבוק תרבית תאי T-75 בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח המסופק עם 5%CO2 (ראה טבלת חומרים). החליפו את מצע התרבית כל יומיים וקצרו את התאים במפגש של 80%-90%.
    הערה: מספר התא ההתחלתי הוא 1.5 x 10 6 תאים, והתאים נמצאים בשימוש בתוך6-8 מעברים.
  2. אחסנו את תרבית המצע ואת החומצה טריפסין-אתילאנדיאמין-טטראצטית (טריפסין-EDTA) בטמפרטורה של 4°C בחושך עד לשימוש. חממו מראש את מצע התרבית ל-37°C ואת הטריפסין-EDTA לטמפרטורת החדר לפני השימוש. עיין בטבלת החומרים עבור כל הריאגנטים והחומרים המתכלים המשמשים בסעיף זה.
  3. הסר את תקשורת התרבות. יש לשטוף את שכבת התא במי מלח סטריליים חוצצים פוספט ב-10 מ"ל (DPBS, ראו טבלת חומרים).
  4. הוסף 5 מ"ל של טריפסין-EDTA לבקבוק התרבית ודגר על התאים ב 37 ° C. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 20 (ראה טבלת חומרים) עד ששכבת התא מפוזרת ומנותקת לחלוטין מהבקבוק. ודא כי התאים אינם נשארים טריפסין-EDTA במשך יותר מ -15 דקות.
  5. הוסף 5 מ"ל של מדיה תרבותית לבקבוק התרבות. שאפו את התאים על ידי פיפטינג עדין. העבירו את מתלה התא לצינור צנטריפוגה וסובבו במהירות של 1,107 x גרם למשך 5 דקות (ראו טבלת חומרים).
  6. הסר את supernatant בעדינות resuspend את גלולת התא עם 1 מ"ל של PBS. פיפטה ביסודיות כדי להשיג השעיה תא אחד. קבע את מספר התא באמצעות מונה התאים האוטומטי (ראה טבלת חומרים) והכן את תרחיף התא לריכוז של 5 x 106 תאים/מ"ל ב- PBS.
  7. צייר 200 μL של השעיית תאים עם מחט 25 G מזרק 1 מ"ל. כל מזרק מכיל 1 x 106 MHCC97L תאים (ב 200 μL). שמור את המזרק על קרח רטוב.
  8. להרדים את העכבר עם הזרקה intraperitoneal (i.p.) של תערובת של קטמין (87.5 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (12.5 מ"ג / ק"ג). הקפידו על הרדמה נאותה באמצעות רפלקס צביטת הבוהן. הקפד למרוח חומר סיכה לעיניים על העכבר כדי למנוע התייבשות והיווצרות פוטנציאלית של כיבים בקרנית. הניחו את העכבר במצב שכיבה על פד סטרילי (ראו טבלת חומרים).
  9. לעקר את האזור הגבי ליד האגף התחתון (צד שמאל או ימין) של העכבר עם 70% אתנול (ראה טבלה של חומרים). הרימו את העור בעזרת מלקחיים והכניסו בעדינות את המשקע של המחט מתחת לעור.
  10. מקדמים את המחט 4-5 מ"מ לאורך המישור התת עורי מאתר הניקוב כדי למנוע דליפה מקרית של תרחיף התא מאתר ההזרקה עם משיכת המחט. ודא כי החדרת המחט אינה עמוקה מדי מתחת לעור, אשר עלול לגרום נזק איברים בשוגג.
  11. שחררו את המלקחיים ופרקו בזהירות ובאיטיות את תכולת המזרק, תוך הקפדה שלא לחדור לצד הנגדי. משוך את המחט כדי לבדוק אם יש נפיחות בזריקה. החזירו את העכבר לכלוב כשהוא יושב על משטח חימום שחומם מראש כדי לסייע בהתאוששות מההרדמה ולהחזיר את הניידות. המשך לעקוב אחר העכבר עד שהעכבר ער לחלוטין ושומר על שכיבת עצם החזה.
  12. עקוב אחר צמיחת הגידול ורווחתו של העכבר על בסיס שבועי. מדוד את נפח הגידול (V) באמצעות קליפר (ראה טבלת חומרים). חשב ורשום את נפח הגידול באמצעות הנוסחההבאה 10:
    V = (W 2× L)/2
    כאשר W הוא הרוחב ו-L הוא אורך הגידול.
  13. בין 4-6 שבועות לאחר ההזרקה יש לבדוק כי מתקבל גודל משמעותי של גידול תת עורי, בין 800-1000 מ"מ3. יש לוודא כי עומס הגידול הכולל אינו עולה על 10% ממשקל הגוף.

2. השתלת כבד אורתוטופית וקשירת עורק כבד

  1. הכינו את הריאגנטים והכלים הכירורגיים הבאים בארון בטיחות ביולוגי שעבר חיטוי: 10 מ"ל של תרבית בצלחת, 10% תמיסת פובידון-יוד, 70% אתנול, כלי ניתוח אוטוקלאביים, כלומר מספריים חדים, מספריים קפיציים, מלקחיים (מעוקלים דקים וקהים ישרים), מחזיק מחט, להב אזמל, תפר ניילון 6-0 ו-5-0, כרית חימום.
  2. אוטוקלבו את כל כלי הניתוח וטפלו בהם רק על ספסל סטרילי. לספק את הטיפול ההולם והנחוץ לפני, תוך ואחרי הניתוח לעכברים במהלך ההליכים הכירורגיים (ראה שלבים להלן).
    1. להקלה על כאבים לפני הניתוח, יש להזריק לעכבר זריקה תת-עורית של בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג) לפחות 30 דקות לפני תחילת ההליך הכירורגי. לטיפול וניהול לאחר הניתוח, יש להזריק לעכבר זריקה תת עורית של בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג) למשך 3 ימים ברציפות, אחת ל-8-12 שעות. עיין בטבלת החומרים עבור כל הריאגנטים והחומרים המתכלים המשמשים בסעיף זה.
  3. הרדימו את העכבר הנושא גידול תת עורי עם הזרקת I.P. של pentobarbital (330 מ"ג / ק"ג). בצע חתך על העור של אתר הגידול באמצעות להב אזמל. מוציאים את גוש הגידול התת עורי ומעבירים אותו מיד לאמצעי התרבות. בצע שלב זה במהירות האפשרית.
  4. חותכים את גוש הגידול ל-1 מ"מ3 קוביות גידול קטנות בעזרת מספריים כירורגיים חדים. שמור את כל קוביות הגידול בתקשורת התרבית. הימנע משימוש באזור הליבה של גוש הגידול התת עורי.
  5. מרדימים את העכבר שיעבור את ניתוח השתלת הגידול האורתוטופי הבא עם הזרקת I.P. של תערובת קטמין (87.5 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (12.5 מ"ג/ק"ג). ודא כי לפחות 30 דקות חלפו לאחר מתן buprenorphine לפני הרדמת העכבר. הקפד למרוח חומר סיכה לעיניים על העכבר כדי למנוע התייבשות והיווצרות פוטנציאלית של כיבים בקרנית.
  6. הניחו את העכבר במצב שכיבה על פד סטרילי שנמצא על גבי כרית חימום שחוממה מראש. עקוב ורשום את המצב הפיזיולוגי של העכבר כל 15 דקות עד סוף ההליך הכירורגי.
  7. הרחב את הגפיים של העכבר. אבטחו אותם בעזרת נייר דבק כדי למקסם את החשיפה של הבטן הגחונית ובית החזה. לעקר את כל עור הבטן של העכבר עם תמיסת 10% פובידון-יוד, ואחריו 70% אתנול. הערך את עומק ההרדמה של העכבר על ידי בדיקה שאין תגובה לצביטת הבוהן - רפלקס המשיכה של הדוושה.
  8. בצע laparotomy על ידי ביצוע חתך קו אמצע כ 10 מ"מ כדי לגשת הצפק באמצעות מספריים חדים. מהדקים ומושכים את תהליך הקסיפואיד לכיוון הראש עם מלקחיים ומיישמים את החוזרים התת-קוסטליים כדי לפתוח את שדה הניתוח. יש לוודא כי בוצע חתך מתאים כדי לאפשר ראייה טובה של אתר הניתוח.
  9. משכו את האונות החציוניות והשמאליות כלפי מעלה בעזרת מקלון גזה רטוב. העבר את המעיים מחוץ לבטן לצד שמאל של העכבר וכסה אותם במקלון גזה רטוב. בצע קשירת עורק כבד (HAL) על עורק הכבד המשותף (CHA), שמקורו מראש הלבלב ועד לשורשו בפדיקור הכבד, תחת מנורה מגדלת להדמיה אופטימלית.
  10. משכו את האונות החציוניות והשמאליות לאחור/מטה בעזרת מקלון גזה רטוב כדי לחשוף את האונה השמאלית. בצע חתך באורך ובעומק של כ -2 מ"מ על פני האונה השמאלית עם להב אזמל סטרילי.
    הערה: ניתן גם להשתמש באונה החציונית של הכבד להשתלת גידול כדי למזער קרעים מקריים או חתכים כתוצאה מטראומה לאיברי בטן שכנים.
  11. מיד להכניס קטע גידול לתוך חתך הכבד עם מלקחיים סטריליים. קברו את הגידול כך שישב היטב בכבד. יש למרוח תפר דמוי שמונה עם תפר ניילון 6-0 מעל אתר החתך כדי להבטיח השתלה תקינה של מקטע הגידול בכבד ובהמוסטאזיס. בצע פעולה זו מהר ככל האפשר כדי למנוע דימום מוגזם. בסיום, לסגור את החתך בבטן עם תפרים קטועים 5-0.
  12. החזירו את העכבר לכלוב כשהוא יושב על גבי כרית חימום שחוממה מראש כדי לסייע בהתאוששות מההרדמה ולהחזיר את רפלקס הימין. המשך לעקוב ולתעד את המצב הפיזיולוגי של העכבר כל 15 דקות עד שהעכבר ער לחלוטין ושומר על שכיבת עצם החזה.
  13. חזור על ההליך עד שכל העכברים עברו השתלת גידול אורתוטופית. לספק טיפול לאחר הניתוח לכל העכברים על ידי ניטור רציף של מצבם הפיזיולוגי מדי יום במשך 3 הימים הבאים לאחר הניתוח. תן buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג) כל 8-12 שעות.

3. הגדרת כיולים ותהליכי עבודה של PET/MR

הערה: ההדמיה מתבצעת באמצעות מערכת PET/MR 3T פרה-קלינית (ראה טבלת חומרים).

  1. השתמש 5% isoflurane (1 L / min רפואי O2) כדי להרדים את העכבר בתא אינדוקציה. עבור כל סריקה, בזהירות להניח את העכבר מורדם על מיטת הדמיה עם חימום מתמשך; ראשית, סרוק עם MR (Scout View) כהפניה אנטומית לסריקות סטטיות [18 F]FMISO או [18F]FDG PET, ולאחר מכן הדמיית MR ייחוס אנטומי.
  2. צור זרימת עבודה רציפה של דימות PET/MR בתוכנה (ראה טבלת חומרים) כדי לכלול סריקת PET סטטית, הדמיית MR משוקללת T1 (תיקון הנחתה) ומשוקללת T2 (התייחסות אנטומית), ושחזור PET יום אחד לפני הפעלת ההדמיה המתוכננת.
  3. כדי לרכוש PET, בחר אפליה ברמת 400-600 keV, איזוטופ מחקר F-18, מצב צירוף מקרים 1-5 וסריקות של 20 דקות.
  4. כדי לרכוש MR משוקלל T1 לכל הגוף, השתמש בהד-תלת-ממד הדרגתי עם TE = 4.3 אלפיות השנייה, TR = 16 אלפיות השנייה, שדה ראייה (FOV) = 90 מ"מ x 60 מ"מ, מספר עירורים (NEX) = 3, 28 פרוסות בעובי 0.9 מ"מ וגודל ווקסל = 0.375 מ"מ 3 x 0.375 מ"מ 3 x 0.9 מ"מ3.
  5. כדי לרכוש MR משוקלל T2 לכל הגוף, השתמש בהד מהיר דו-ממדי עם TE = 71.8 אלפיות השנייה, TR = 3000 אלפיות השנייה, FOV = 90 מ"מ x 60 מ"מ, NEX = 5, 28 פרוסות בעובי 0.9 מ"מ, גודל ווקסל = 0.265 מ"מ 3 x 0.268 מ"מ 3 x 0.9 מ"מ3.
  6. כדי לשחזר את PET, בחר באלגוריתם Tera-Tomo (TT3D), איטראציות = 8, תת-קבוצות = 6, מצב צירוף מקרים 1-3, ועם תיקוני דעיכה, זמן מת, אקראי, הנחתה ופיזור כדי ליצור תמונות בגודל ווקסל כולל של 0.3 מ"מ3.
  7. בצעו בדיקת פעילות PET לפני תחילת הניסוי כדי לבדוק את דיוק כימות ה-PET11.
    1. מלא מזרק 5 מ"ל עם 5-8 MBq [18F]FMISO מדולל במים או מלוחים לפי המלצת היצרן. השתמש בכיול מינון כדי להקליט את פעילות המזרק (ראה טבלת חומרים). שימו לב לזמן המדידה.
    2. צייר נפח של עניין (VOI) על התמונה המשוחזרת כדי לכסות את כל המזרק. השווה את הפעילות המשוחזרת מהתמונה לערך המתקבל מכייל המינון. המשך עם מחקרי הדמיה כאשר הפעילות המשוחזרת מדויקת בתוך ±5%.

4. [18 F]FMISO ו-[18F]הזרקת FDG

  1. קבל מינון קליני של [18F]FMISO מהספק 30 דקות לפני תחילת מחקרי ההדמיה. יש ללבוש את ציוד המגן האישי המתאים (PPE), כגון מעיל מעבדה, כפפות, משקפיים מעל, תג סרט וטבעת דוזימטרים בעת טיפול בחומרים רדיואקטיביים. החליפו כפפות לעתים קרובות כדי למנוע זיהום צולב של החומרים הרדיואקטיביים.
  2. מקם את תמיסות המלאי הרדיואקטיבי במיכל אחסון העופרת מאחורי מגן שולחן בלוק L. מוציאים אליציטוט של [18F]FMISO ומדללים במי מלח מעוקרים. ודא כי ריכוז הפעילות הכולל הוא 18-20 MBq ב 100 μL.
  3. צייר את [18F]FMISO עם מזרק 1 מ"ל עם מחט (ראה טבלת חומרים). רשום את הרדיואקטיביות והזמן המוצגים בכיול המינון.
  4. רשום את משקל העכבר לפני ההזרקה של radiotracer. השתמש באיזופלורן 5% (1 ליטר / דקה רפואי O2) כדי להרדים את העכבר, ולאחר מכן הזריק בזהירות את המוכן [18F]FMISO דרך וריד הזנב. רשום את זמן ההזרקה ואת פעילות השאריות של המזרק כדי לקחת בחשבון תיקון ריקבון. החזירו את העכבר לכלוב למשך 180 דקות כדי לאפשר ספיגת FMISO [18F]FMISO לפני סריקת PET. אפשר לעכבר להתאושש במשך יום אחד לאחר [18F]FMISO PET.
    הערה: למרות הפרופילים הפרמקוקינטיים השונים מאוד in vivo עבור [18 F]FMISO ו- [18 F]FDG, שני נותבי הרדיו מסומנים ברדיו עם F-18, שהוא רדיונוקליד PET עם זמן מחצית חיים של 109.77דקות (< 2 שעות). מכיוון שאות ה-PET מקורו ב-F-18, מחצית מהרדיואקטיביות הראשונית המוזרקת תאבד כל שעתיים. במקרה זה, סורק ה-PET אינו יכול עוד לזהות את האות השיורי 24 שעות לאחר ההזרקה. בנוסף, הפער של יום אחד בין זריקות [18 F]FMISO (יום 1) ו-[18 F]FDG (יום 3) יאפשר דעיכה מלאה של [18 F]FMISO כאשר [18 F]FDG PET מבוצע, ולכן אין חפיפה של אות [18 F]FMISO בסריקת [18F]FDG PET.
  5. חזור על שלבים 4.1.-4.4. עבור הזרקת [18F]FDG ביום השלישי, למעט ריכוז פעילות כולל של 6-8 MBq ב 100 μL מוזרק עם ספיגה של 60 דקות לפני תחילת סריקת PET.
  6. חשב את הפעילות המוזרקת [18 F]FMISO או [18F]FDG באמצעות הנוסחה הבאה 11:
    פעילות בהזרקה (MBq) = פעילות במזרק לפני הזרקה - פעילות במזרק לאחר ההזרקה

5. רכישת PET/MR

  1. הפעל את מחמם האוויר כדי לחמם את מיטת ההדמיה של העכבר לפני סריקת PET המתוזמנת. השתמש 5% isoflurane (1 L / min רפואי O2) כדי להרדים את העכבר בתא אינדוקציה.
  2. לאחר הרדמה ובדיקה נכונה באמצעות תגובת צביטת הבוהן, העבירו בזהירות ומיד את העכבר למיטת החימום ושמרו על הרדמה באיזופלורן 2%-2.5%. הניחו את ראש העכבר על מוט הנשיכה ומרחו חומר סיכה לעיניים על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות והיווצרות אפשרית של כיבים בקרנית. כסו את מיטת ההדמיה בסדין פלסטיק כדי לשמור על הטמפרטורה שמסביב למיטה.
  3. נטר ורשום את קצב הנשימה וטמפרטורת הגוף של העכבר באמצעות כרית הנשימה הפנימית והבדיקה התרמית, בהתאמה. ודא כי טמפרטורת הגוף של העכבר נשמרת על 37 ° C בעוד קצב הנשימה נשמר בטווח של 40-50 נשימות לדקה (bpm) על ידי התאמת רמת isoflurane.
  4. בצע תצוגת מעקב כדי לאתר את מיקום העכבר בתוך הסורק. התאם את מיקום מיטת העכבר כך שיכסה את כל גוף העכבר, כאשר אזור פלג הגוף העליון ממוקם במרכז FOV של ה- MR.
  5. כדי להתחיל סריקת PET, בחר/י ״ רכישת PET ״ בחלון רשימת המחקר ולאחר מכן בחר/י ״טווח סריקה ברכישה קודמת ״ כדי להשתמש במיקום מיטת העכבר שנקבע מראש מתצוגת הצופים. לחץ על הכן > אישור כדי להעביר אוטומטית את מיטת העכבר מ- MR ל- PET ולהתחיל את הרכישה.
  6. תחת עורך התרופות הרדיואקטיביות, בחר את הרדיונוקליד המתאים, ולאחר מכן הזן את הפרטים של מינון ההזרקה והזמן לפני ואחרי [18 F]FMISO או [18F]הזרקת FDG, כפי שנמדד בשלב 4.3. ושלב 4.4. הזן את עובי העכבר בתפריט Subject Information.
  7. המשך ברכישות MR עם השלמת סריקת PET. לשם כך, בחר הכן כדי להעביר את העכבר ל- MR מ- PET. לחץ על אישור כדי להמשיך.
  8. לאחר השלמת כל הסריקות, בחר בית כדי להזיז את מיטת ההדמיה בחזרה למיקום ברירת המחדל.
  9. כבו את חומר ההרדמה ושטפו את מיטת ההדמיה ב-O2 רפואי. בדוק את רפלקס המשיכה של דוושת העכבר. העבירו את העכבר ממיטת ההדמיה בחזרה לכלוב דיור נקי המונח על גבי כרית חימום כדי לסייע בהתאוששות מההרדמה ולהחזיר את רפלקס הימין.
  10. תחת Raw Scan, בחר PET Acquisition כדי לטעון את נתוני ה-PET הגולמיים שנרכשו לצורך שחזור PET . בחר MM לשימוש כמפת חומרים. המשך בשחזור PET באמצעות הפרמטר כמתואר בשלב 3.6.
  11. יש להקפיד על ההנחיות המקומיות והמוסדיות בעת טיפול בעכברים לאחר מחקרי הדמיה של PET. יש להתייחס לכל החומרים המתכלים המשומשים, כגון מזרקים, מחטים, כפפות, מגבונים ופסולת ביולוגית, כגון מצעי כלוב וחומר צואתי, שהיו במגע ישיר עם העכבר כפסולת רדיואקטיבית, ולטפל בזהירות בהתאם לתקנות המקומיות.

6. ניתוח תמונות PET

  1. פתח את התוכנה Image Analysis (ראה רשימת חומרים) ובחר Load DICOM Data כדי לפתוח את תמונות PET ו-MR.
  2. גררו את תמונות ה-PET וה-MR התואמות לחלון התצוגה של התוכנה ובחרו באפשרות 'רישום אוטומטי' כדי לבצע רישום משותף אוטומטי של תמונות ה-PET וה-MR שהתקבלו.
    1. בתפריט Registration Setup , בחר Rigid Transformation. השתמשו ב'הזחה ' וב'סיבוב ' בתפריט 'קשיח'/'עדינה' .
    2. בתפריט בחירת תפקיד גלובלית, לחץ על MM כהפניה ועל סריקת PET סטטית כפריכה.
    3. בדוק את תמונות ה-PET/MR הרשומות במשותף כדי לוודא יישור תקין. במידת הצורך, השתמש ברישום ידני כדי להתאים את התמונות באופן ידני.
    4. אתר את הגידול האורתוטופי בכבד באמצעות תמונת MR. השתמש ב - Interpolated Ellipse ROI כדי לצייר VOI על הגידול, תוך שימוש בתמונת MR לעיון. העבר את VOI הגידול שנוצר מ- MR לתמונת PET. בחרו בכלי מברשת ובכלי מחק כדי להגדיר בקפידה את גבול VOI שקופית אחר שקופית. יש להקפיד להימנע מזליגה של ספיגת רדיואקטיביות מהכבד בתמונת ה-PET.
    5. השתמש באליפסואיד VOI כדי ליצור 3 מ"מ3 VOI על הכבד כאיבר ייחוס. הקפד להימנע מאזורים של מבנים גלויים של כלי הדם ודרכי המרה בכבד על ידי שימוש בתמונת MR כמדריך.
    6. בחר הצג טבלת החזר השקעה כדי לשנות את שמם של כל ה- VOI שצוירו. רשום את כל הנתונים הדרושים, כגון רדיואקטיביות (kBq/mL) ונפח הגידול (מ"מ3), בגיליון אלקטרוני. שמור עותק של שרטוטי VOI ואחסן בארכיון הן את נתוני ההדמיה הגולמיים והן את נתוני ההדמיה המשוחזרים בכונן קשיח חיצוני לאחר השלמתם.
    7. חשב את ערך הספיגה המתוקנן (SUV) עבור כל VOI באמצעות המשוואה הבאה11:
      SUV = CPET(t)/(ID/BW)
      כאשר CPET(t) היא הפעילות הנמדדת ב-VOI, ID הוא המינון המוזרק הנמדד ב-kBq, ו-BW הוא משקל גוף העכבר בק"ג, בהנחה שצפיפות הרקמה היא 1 גרם/מ"ל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להשיג בלוק גידול מתאים להשתלה אורתוטופית עוקבת, שיבוטים יציבים נוצרו תחילה על-ידי הזרקה תת-עורית של 200 מיקרוליטר של תרחיף תאים ב-DPBS (המכיל תאי MHCC97L) לתוך האגף התחתון של עכברים עירומים (איור 1A). צמיחת הגידול נוטרה, וכאשר גודל הגידול הגיע ל 800-1000 מ"מ 3 (כ -4 שבועות לאחר ההזרקה), עכברים הורדמו, וגוש הגידול שנוצר נחתך לכ 1 מ"מ3 מקטעים להשתלה אורתוטופית בכבד לאחר מכן בקבוצה אחרת של עכברים עירומים (n = 6). עכברים חולקו באקראי לשתי קבוצות: קבוצת ביקורת (C1, n = 3...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה, תיארנו את ההליכים לביצוע HAL על HCC xenografts אורתוטופי בכבד באמצעות גידולים תת עוריים, יחד עם שיטות לניטור לא פולשני של היפוקסיה גידולית ב xenografts אורתוטופיים באמצעות [18 F]FMISO ו [18F]FDG PET/MR. העניין שלנו הוא הדמיה מטבולית של מודלים שונים של סרטן ומחלות לאבחון מוקדם והערכת תגובה לטיפול11,13,14,15. עד כה, יצירת HAL HCC xenografts ומטבוליזם הגידול in ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

אנו מודים על תמיכתה של קרן הנאמנות נגד סרטן של הונג קונג, קרן המחקר השיתופית של מועצת מענקי המחקר של הונג קונג (CRF C7018-14E) לניסויי הדמיה בבעלי חיים קטנים. אנו מודים גם לתמיכת המרכז לדימות מולקולרי וציקלוטרון רפואי (MIMCC) באוניברסיטת הונג קונג על אספקת [18 F]FMISO ו- [18F]FDG.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.9% מי מלח סטרילייםBBraunN/A0.9% נתרן כלוריד עירוי תוך ורידי, 500 מ"ל
10# להב אזמלRWD Life Science Co., ltdS31010-01כלי לניתוח בעלי חיים
10% תמיסת פובידון-יודBanitore6.425.678לחיטוי
מחט 25G עם מזרק 1 מ"לBD PrecisionGlideN/Aמזרק 1 מ"ל עם מחט 25G לזריקות מתלי תאים
מזרק 5 מ"לTerumoSS05L5 מ"ל מזרק Luer Lock
70% אתנולMerck1.07017לחיטוי
אוטומטי מונה תאיםInvitrogenAMQAF2000לספירת תאים אוטומטית
BuprenorphineHealthDirectN/Aהזרקה תת עורית (0.05-0.2 מ"ג/ק"ג/12 שעות) עבור משכך כאבים לאחר ניתוח
צלחת תרבית תאים (קוטר 60 מ"מ)Thermo Scientific150462לעיבוד רקמות גידול
צנטריפוגהסיגמא3-16KL, רוטור זווית קבועה 12311לאיסוף תרחיפי תאים
צינור חרוטיEppendorfEP0030122151לאיסוף תרחיפי תאים
מדיית תרבית (Dulbecco' s שונה Eagle' s בינוני)Gibco10566024גלוקוז גבוה, GlutaMAX™ תוסף
קליפר דיגיטליRS PRO841-2518למדידת גודל גידול תת עורי
חום ישיר CO2 incubatorTechcomp LimitedNU5841לכיול
מינוןתרבית תאים Biodex  לא ישים Atomlab500
DPBS (Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט)Gibco14287072לשטיפת תאים והזרקה
חומר סיכה לעינייםAlcon Duratears  N/Aמשחת סיכה סטרילית לעיניים, 3.5 גרם
סרום בקר עוברי (FBS)GibcoA4766801משמש למגוון רחב של סוגי תאים, במיוחד קווי תאים רגישים
מלקחיים (קהים עדינים וישרים)RWD Life Science Co., ltdF12012-10 & F12011-13כלי לניתוחי בעלי חיים
כרית חימוםALA מכשירים מדעייםN/Aכרית חום לעכברים במהלך ניתוח
מזרק אינסוליןTerumo10ME2913מזרק אינסולין 1 מ"ל עם מחט להזרקות רדיואקסר
תוכנת היתוך InterViewMedisoגרסה 3.03תוכנת עיבוד וניתוח תמונה
מיקרוסקופ הפוךYu Lung סיינטיפיק ושות', בע"מBM-209Gלהדמיית מורפולוגיה של תאים
IsofluraneChanelle Pharma  Iso-Vet, חומר הרדמה באינהלציה, 250 מ"ל
קטמיןAlfasan International B.V.HK-37715תמיסת הזרקת קטמין 10%, 10 מ"ל 
חמצן רפואיLinde HKO101-HRגז דחוס, 99.5% טוהר
nanoScan PET/MR סורקMediso  N /A 3 טסלה MR
מחזיק מחטRWD מדעי החיים ושות', בע"מF31026-12כלי ניתוח בעלי חיים
Nucline nanoScan תוכנהMedisoגרסה 3.0תוכנת הפעלה
סורק תפר ניילון (6/0 ו- 5/0)Healthy Medical Company Ltd000524 & 000526כלי לניתוח בעלי חיים
פניצילין- סטרפטומיציןGibco15140122אמצעי תרבית לריכוז סופי של 50 עד 100 יחב"ל/מ"ל פניצילין ו-50 עד 100 ומיקרו; גרם/מ"ל סטרפטומיצין.
PentabarbitalAlfaMedic13003הזרקה תוך צפקית (330 מ"ג/ק"ג) כדי לגרום להפסקת נשימה של עכברים
מספריים חדיםRWD Life Science Co., ltdS14014-10כלי לניתוח בעלי חיים
מספריים אביבRWD Life Science Co., ltdS11005-09כלי לניתוח בעלי חיים
Trypan Blue Solution, 0,4%Gibco15250061לספירת תאים
חומצה טריפסין-אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA, 0.25%), פנול אדום.Gibco25200072לעיכול תאים
XylazineAlfasan International B.V.HK-56179תמיסת הזרקת קסילזין 2%, 30 מ"ל

מקורות

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Chen, C., Lou, T. Hypoxia inducible factors in hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 8 (28), 46691-46703 (2017).
  3. Lu, R. -C., et al. Positron-emission tomography for hepatocellular carcinoma: Current status and future prospects. World Journal of Gastroenterology. 25 (32), 4682-4695 (2019).
  4. Larsson, P., et al. Adding 11C-acetate to 18F-FDG at PET examination has an incremental value in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Molecular Imaging and Radionuclide Therapy. 21 (1), 6-12 (2012).
  5. Huo, L., et al. Kinetic analysis of dynamic 11C-acetate PET/CT imaging as a potential method for differentiation of hepatocellular carcinoma and benign liver lesions. Theranostics. 5 (4), 371-377 (2015).
  6. Lopci, E., et al. PET radiopharmaceuticals for imaging of tumor hypoxia: A review of the evidence. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 4 (4), 365-384 (2014).
  7. Mao, X., et al. Mechanisms through which hypoxia-induced caveolin-1 drives tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma. Cancer Research. 76 (24), 7242-7253 (2016).
  8. Kung-Chun Chiu, D., et al. Hypoxia regulates the mitochondrial activity of hepatocellular carcinoma cells through HIF/HEY1/PINK1 pathway. Cell Death & Disease. 10 (12), 934(2019).
  9. Li, Y., et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World Journal of Gastroenterology. 7 (5), 630-636 (2001).
  10. Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42 (6), 217-224 (2013).
  11. Liu, Q., Tan, K. V., Chang, H. C., Khong, P. L., Hui, X. Visualization and quantification of brown and beige adipose tissues in mice using [18F] FDG micro-PET/MR imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (173), e62460(2021).
  12. Lin, W. -H., et al. Hypoxia-activated cytotoxic agent tirapazamine enhances hepatic artery ligation-induced killing of liver tumor in HBx transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11937-11942 (2016).
  13. Wong, T. L., et al. CRAF methylation by PRMT6 regulates aerobic glycolysis-driven hepatocarcinogenesis via ERK-dependent PKM2 nuclear relocalization and activation. Hepatology. 71 (4), 1279-1296 (2020).
  14. Yang, X., et al. Development of cisplatin-loaded hydrogels for trans-portal vein chemoembolization in an orthotopic liver cancer mouse model. Drug Delivery. 28 (1), 520-529 (2021).
  15. Shi, J., et al. Longitudinal evaluation of five nasopharyngeal carcinoma animal models on the microPET/MR platform. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (5), 1497-1507 (2021).
  16. Kilian, K., et al. Imaging of hypoxia in small animals with F fluoromisonidasole. Nukleonika. 61 (2), 219-223 (2016).
  17. Kawamura, M., et al. Evaluation of optimal post-injection timing of hypoxic imaging with 18F-Fluoromisonidazole-PET/CT. Molecular Imaging and Biology. 23 (4), 597-603 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

היפוקסיה גידוליתקשירת עורק הכבדדימות FMISO PETדימות FDG PETמטבוליזם של גידוליםגורם השראת היפוקסיהמודל סרטן פרה-קליני
הדמיית PET/MR לא פולשנית במודל עכבר אורתוטופי של קרצינומה הפטוצלולרית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.