מאמר שיטה

גישה פוטודינמית לחקר תפקוד קרע שלפוחית תוך תאית

DOI:

10.3791/63962

⸱

17 במרץ 2023

 ,  ,  ,  , 
1Inflammation Core Facility, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AlPcS2a-mediated chromophore-assisted laser inactivation (CALI) הוא כלי רב עוצמה לחקר נזק מרחבי-זמני של שלפוחיות תוך-תאיות (IVs) בתאים חיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות תוך תאיות (IVs) נוצרות באמצעות אנדוציטוזה של שלפוחיות לתוך ציטופלסמה. היווצרות IV מעורבת בהפעלת מסלולי אות שונים באמצעות חדירה של ממברנות IV והיווצרות אנדוזומים וליזוזומים. שיטה בשם השבתת לייזר בסיוע כרומופור (CALI) מיושמת כדי לחקור את היווצרות העירויים ואת החומרים בבקרת ויסות IV. CALI היא מתודולוגיה פוטודינמית מבוססת הדמיה לחקר מסלול האיתות המושרה על ידי חדירת ממברנה. השיטה מאפשרת מניפולציה מרחבית-זמנית של האברון שנבחר להיות חדירה בתא. שיטת CALI יושמה כדי לצפות ולנטר מולקולות ספציפיות באמצעות חדירה של אנדוזומים וליזוזומים. הקרע בקרום העירוי ידוע כמגייס באופן סלקטיבי חלבונים קושרי גליקן, כגון גלקטין-3. כאן, הפרוטוקול מתאר את השראת הקרע IV על ידי AlPcS2a ואת השימוש בגלקטין-3 כסמן לסימון ליזוזומים לקויים, אשר שימושי בחקר ההשפעות במורד הזרם של קרע קרום IV ואת ההשפעות במורד הזרם במצבים שונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנדוזומים, סוג של שלפוחית תוך תאית (IV), נוצרים על ידי אנדוציטוזה ולאחר מכן מתבגרים לליזוזומים. מסלולי אות תוך תאיים שונים מעורבים בהיווצרות עירויים; בנוסף, גירויים פנימיים וחיצוניים שונים יכולים לפגוע בעירוי (למשל, פתוגנים יכולים לברוח מהקרום התחום במהלך ההדבקה ולהיכנס לציטופלסמה1). זה בדרך כלל מלווה קרע של שלפוחיות endocytotic2. לכן, ניתן להשתמש בטכניקות למיקוד ופגיעה בעירוי במחקרים קשורים3.

טיפול פוטודינמי (PDT) הוא טיפול תלוי אור להילחם במחלות על ידי הריגת גידולים או פתוגנים4. ב-PDT, תאים ממוקדים מסומנים בכרומופורים לא רעילים, הנקראים פוטונסיטייזרים, שיכולים להיות מופעלים מקומית על ידי תאורת אור 5,6. פוטו-סנסיטייזרים סופגים אנרגיה מהאור והופכים למצב סינגלט מעורר, מה שמוביל למצב השלישייה הנרגשת מאריכת החיים. פוטוסנסיטיזרים של מצב השלישייה יכולים לעבור העברת אלקטרונים או אנרגיה וליצור מיני חמצן תגובתי (ROS) בנוכחות חמצן, ויכולים להרוס מרחבית תאים מסומנים באזור ההארה7. התוצאה משתנה בהתאם לעוצמת האור8. על ידי שליטה בריכוז הפוטונסיטייזרים ובעוצמת תאורת האור, ביומולקולות ממוקדות יכולות להיות מושבתות באופן סלקטיבי ללא ליזה של תאים, המכונה השבתת אור בסיוע כרומופור (CALI)9. עם הפיתוח המשמעותי של פוטונסיטייזרים שיכולים לתייג באופן סלקטיבי מטרות תת-תאיות שונות, CALI הפך לכלי רב ערך לשליטה בנטרול בתיווך אור של ביומולקולות עבור ביומולקולות קטנות כגון נוקלאוטידים וחלבונים, כמו גם אברונים כגון מיטוכונדריה ואנדו-ליזוזומים 3,10,11,12,13.

בהשוואה ל- CALI, שיטות כימיות או פיזיקליות משמשות גם לפגיעה בקרום, כגון רעלן חיידקי 14,15 וטיפול Leu-Leu-OMe16 לנזק ליזוזומלי. עם זאת, שיטות אלה מציגות פגיעה בכמות גדולה של עירויים בתוך תאים. פוטונסיטייזרים חזקים (כלומר, Al(III) phthalocyanine chloride disulfonic acid (AlPcS2a)) משמשים ב- CALI; AlPcS2a, המכוון את הליזוזומים באמצעות אנדוציטוזה, משמש לקרע אנדוזומים או ליזוזומים באזור מבוקר17. AlPcS2a הוא כרומופור מבוסס פתלוציאנין אטום לקרום התא הנקשר לשומנים בקרום הפלזמה ומופנם באמצעות אנדוציטוזה ובסופו של דבר מצטבר בתוך הליזוזום דרך המסלול האנדוציטי18. הוא בולע אור בתוך אזור ספקטרלי קרוב לאינפרא אדום ומייצר חמצן סינגלט, ROS עיקרי שנוצר על ידי AlPcS2a18 מעורר. דעיכת חמצן סינגלט מגבילה במהירות את הדיפוזיה שלו ואת מרחק התגובה שלו בתוך אזור זעיר בתאים (בערך 10-20 ננומטר)19. על ידי התאמת משך הדגירה ותאורת האור של AlPcS2a, מותרת בקרה מרחבית-זמנית על נזקי העירויים באזור תת-תאי. קאל"י הופכת אפוא לכלי רב עוצמה לבחינת ההשלכות של נזק לעירוי, והיווצרותם וויסותם של עירויים.

במחקר זה, פרוטוקול ספציפי של CALI המשתמש ב- AlPcS2a כפוטוסנסיטיזר מטופל. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על סוגים שונים של עירויים, כולל אנדוזומים וליזוזומים, ומשמש לבחינת תגובות המעקב לאחר קרע בממברנה. תאי HeLa המבטאים גלקטין מצומד-3 פלואורופור16,20 המתגלים לאחר קרע ליזוזום משמשים להדגמת פרוטוקול זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מלאי AlPcS2a

  1. יש להמיס 10 מ"ג של AlPcS2a ב-400 מיקרוליטר של 0.1 M NaOH. כדי לשפר את מסיסות, מחממים את התמיסה ב-50°C ומערבולת.
  2. ערבבו את התמיסה עם 4 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS). לאחר מכן, סנן את התמיסה עם מסנן 0.22 מיקרומטר כדי להסיר את המשקעים הבלתי מסיסים.
  3. למדוד את ריכוז התמיסה באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis. מקדם ההכחדה של AlPcS2a ב 672 ננומטר הוא 4 x 104 cm-1 M-1. דלל את פתרון AlPcS2a עם PBS כדי ליצור פתרון של 1 mM. הפוך 1 מ"ל aliquots ולאחסן ב -20 °C.

2. טרנספקציה

הערה: Gal3-GFP מיושם כאינדיקטור להדמיית תאים חיים של קרע ליזוזומלי.

  1. שמור על תרבית תאי HeLa ב- DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS). לאחר שטיפת התאים עם PBS, טריפסיניזציה של התאים, ולאחר מכן להשעות מחדש את התאים ב- DMEM בתוספת 10% FBS.
    הערה: השיטה ישימה עבור רוב קווי התאים המחוברים, כולל קווי תאים HeLa ו- A549. באופן עקרוני, למרות שלא נבדקו תאי תרחיף, ניתן היה לבצע איתם בדיקות CALI.
  2. לדלל 300 ng של פלסמיד Gal3-GFP ב 25 μL של תווך סרום מופחת, ולאחר מכן להוסיף 0.6 μL של מגיב P3000. מערבבים בעדינות. לדלל 0.45 μL של מגיב Lipofectamine 3000 ב 25 μL של מדיום סרום מופחת. מערבבים בעדינות.
  3. דוגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מערבבים DNA מדולל וליפופקטמון 3000 מדולל, ולאחר מכן דוגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. מערבבים את תערובת ה- DNA-Lipofectamine, 3 x 105 תאי HeLa מרחפים ו- 200 μL של DMEM + 10% FBS, ולאחר מכן זרעו את התאים באזור הזכוכית המרכזי של צלחת כפתור זכוכית 35 מ"מ.

3. צביעת AlPcS2a

  1. כדי לאפשר חיבור תאים, יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור המסופק עם 5%CO2 למשך 4 שעות לפחות.
  2. לדלל AlPcS 2a ב DMEM בתוספת 10% FBS כדי ליצור 1 מיקרומטר AlPcS2a פתרון. חממו מראש את המדיום המכיל AlPcS2a באמבט מים של 37°C. החלף את מדיום התרבית במדיום המכיל AlPcS2a.
  3. לדגור את התאים ב 37 ° C באינקובטור מסופק עם 5% CO2 בלילה (16-18 שעות).
  4. למחרת, שטפו את התאים פעמיים עם PBS כדי להסיר AlPcS2a חוץ-תאי. החלף את המדיום בתווך טרי, ולאחר מכן דגר ב 37 ° C במשך 4 שעות כדי לאפשר צבע שיורי לאורך המסלול האנדוציטי להצטבר לליזוזומים.
    הערה: כדי להכתים אנדוזומים, לדגור על תאים ב-1 מיקרומטר AlPcS2a ב-DMEM המכיל 10% FBS למשך 15 דקות ב-37°C. לאחר מכן, לשטוף תאים פעמיים עם PBS לדגור אותם בתווך מחומם מראש לפני הדמיה .

figure-protocol-1
איור 1. איור סכמטי המייצג את נזקי IV סלקטיביים עם AlPcS2a. האיור מציג את הסכמות של נזק IV סלקטיבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-2
איור 2. צביעה ליזוזומלית עם AlPcS2a. ליזוזומים המסומנים במהלך הלילה עם 1 מיקרומטר AlPcS2a בתאי HeLa מוכתמים באופן חיובי בצבע פלואורסצנטי ירוק של 50 ננומטר. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. הדמיה מדגמית ותאורת אור

הערה: ניתן לבצע נזק IV בתוך אזור תת-תאי של תא בודד או של כל התאים המסומניםב-AlPcS 2a בצלחת תרבית. תאורה בתפזורת של כל צלחת התרבית מאפשרת מחקר כמותי של נזק זה, כולל מחקרים ביוכימיים.

  1. תמרן תאים בודדים על ידי פגיעה בליזוזומים בתוך תא יחיד, כמתואר להלן.
    1. מניחים את צלחת התרבית על במה של מיקרוסקופ קונפוקלי. השתמש בלייזרים של 488 ננומטר ו- 561 ננומטר עבור GFP ו- AlPcS2a מלהיבים, בהתאמה.
    2. הקף בעיגול 5 x 5 מיקרומטר2 אזור עניין (ROI) על שלפוחיות המסומנות AlPcS2a שנבחרו להינזק.
    3. פולס מאיר את החזר ההשקעה עם לייזר 633 ננומטר של 0.21 mW למשך 70 חזרות. עקוב אחר היווצרות Gal3 puncta כאינדיקטור לחדירת קרום ליזוזומלי.
  2. נזק לכל התאים המסומנים בצלחת תרבית כמתואר להלן.
    1. הניחו את מנת התרבות על פלטפורמה. האר את המנה עם 660 ננומטר של אור LED משולב (אור אינפרא אדום קרוב הוא בסיס אידיאלי על ספקטרום העירור של AlPcS2a).
    2. הניחו את צלחת התרבית על המיקרוסקופ ועקבו אחר האינדיקטורים לחדירת הממברנה כאמור בשלב 4.1.3.
  3. להעריך פגיעה של IVs באמצעות האינדיקטורים הבאים.
    1. התוכן של אנדוזום או ליזוזום הם גליקוזילציה גבוהה ביותר, אשר נחשפים cytosol עם קרע IV. תייגו אותם במהירות באמצעות גלקטינים קושרי גליקן ציטוסולי, כולל גלקטין-1, גלקטין-3, גלקטין-8 וגלקטין-916,20.
    2. גודל הפצע יכול להיקבע על ידי שחרור של צבע אטום לקרום כמתואר ב21.
    3. ההבדל בין אנדוזומים וליזוזומים הוא ערך החומציות הלומינלי שלהם. קרע ליזוזומלי מפריע ל-pH הלומינלי, אותו ניתן למדוד באמצעות צבע רגיש ל-pH, כגון FITC-dextran3.

figure-protocol-3
איור 3. CALI בתיווךAlPcS 2a גורם לגיוס מקומי של TagRFP-galectin-3 (Gal3) לליזוזומים באזור התאורה. ליזוזומים בתאי HeLa מבוטא TagRFP-galectin-3 הוכתמו במהלך הלילה עם 1 מיקרומטר AlPcS2a, ולאחר מכן הארה ממוקדת עם אור אינפרא אדום קרוב (633 ננומטר) בתוך הריבוע הצהוב. אות AlPcS2a בתוך הריבוע הצהוב הוא photobleached, מלווה היווצרות של TagRFP-galectin-3 puncta. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור סכמטי המייצג את הנזק שנגרם על-ידי AlPcS2a של IV, כולל אנדוזום וליזוזום, הוצג (איור 1).

ניתן להשתמש בסמנים זמינים מסחרית כדי לקבוע את תנאי הצביעה של AlPcS2a . לדוגמה, AlPcS2a puncta וצבע פלואורסצנטי ירוק22 לוקליזציה (איור 2).

ניתן ליישם גלקטין-3 עם תווית פלואורופורית כאינדיקטור לניטור נזק לעירוי (איור 3). יתר על כן, נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AlPcS2a נקשר לקרום הפלזמה, ואז מופנם על ידי אנדוציטוזה ובסופו של דבר מצטבר בליזוזומים. לפיכך ניתן למקם AlPcS2a בתאים התת-תאיים על ידי התאמת משך הדגירה. מגבלה של מתודולוגיה זו היא שרק תת-אוכלוסייה של עירויים יכולה להיות מסומנת על ידי AlPcS2a באמצעות אנדוציטוזה מכיוון שישנם מקורות ממברניים רבים אחרים של עירויים, כגון ER ומכשיר Golgi. בנוסף, התיוג הסלקטיבי של AlPcS2a לאנדוזומים מוקדמים או מאוחרים יהיה מאתגר, עם זאת, ניתן להשתמש בסמנים פלואורסצנטיים כדי להבדיל בין אנדוזומים שנוצרו ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות ל-Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS על התמיכה במחקר. מתקן הליבה ממומן על ידי Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213). המחברים מודים למתקן הליבה של ציוד משותף של המכון למדעים ביו-רפואיים (IBMS), אקדמיה סיניקה (AS) על הסיוע ברכישת התמונה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>מגיב
Al(III) פתלוציאנין כלוריד חומצה דיסולפונית (AlPcS2a)FrontierScientificP40632
צלחת תרביתibidi812128-200
תרבית DMEMבינונית בתוספת 10% FBS ו-100 U/mL פניצילין G ו-100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין
DMEMGibco11965092
FBSThermo Fisher ScientificA4736301
Gal3-GFP פלסמידaddgene
Lipofectamine 3000 ערכתThermo Fisher ScientificL3000008
LysoTracker ירוק DND-26Thermo Fisher ScientificL7526צבע פלורסנט ירוק
Multiwall צלחתperkinelmerPK-6005550
NaOHThermo Fisher ScientificQ15895
OptiMEMThermo Fisher Scientific31985070
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140163
תמיסת מלח פוספט (PBS)Gibco21600-069137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na2HPO4, 1.8 מ"מ KH2PO4
<חזק>קו תאים
HeLa Cell LineATCCCCL-2השיטות ישימות לרוב קווי התאים המחוברים. יש לקבוע את התנאים באופן פרטני.
<חזק>ציוד
0.22 ומיקרו; m מסנןMerckSLGV013SL
תאורת LED קולימטית  (660 ננומטר)ThorlabsM660L3-C1 ו-DC2100Near-infared light הוא בסיס אידיאלי על ספקטרום העירור של AlPcS2a.
מיקרוסקופיה קונפוקליתCarl ZeissLSM 780נדרשת מערכת דגירה להדמיה ארוכת טווח.
NanoDrop 2000/2000c ספקטרופוטומטריםתרמו פישר מדעי
אדום LED אורTholabsM660L4-C1

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cossart, P., Helenius, A. Endocytosis of viruses and bacteria. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (8), 016972(2014).
  2. Daussy, C. F., Wodrich, H. 34;Repair me if you can": membrane damage, response, and control from the viral perspective. Cells. 9 (9), 2042(2020).
  3. Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111(2013).
  4. Sharma, S. K., et al. Photodynamic therapy for cancer and for infections: what is the difference. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 691-705 (2012).
  5. Kübler, A. C. Photodynamic therapy. Medical Laser Application. 20 (1), 37-45 (2005).
  6. De Rosa, F. S., Bentley, M. V. Photodynamic therapy of skin cancers: sensitizers, clinical studies and future directives. Pharmaceutical Research. 17 (12), 1447-1455 (2000).
  7. Hamblin, M. R. New photosensitizers for photodynamic therapy. Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).
  8. Lavie, G., et al. A photodynamic pathway to apoptosis and necrosis induced by dimethyl tetrahydroxyhelianthrone and hypericin in leukaemic cells: possible relevance to photodynamic therapy. British Journal of Cancer. 79 (3-4), 423-432 (1999).
  9. Jay, D. G. Selective destruction of protein function by chromophore-assisted laser inactivation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (15), 5454-5458 (1988).
  10. Grate, D., Wilson, C. Laser-mediated, site-specific inactivation of RNA transcripts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (11), 6131-6136 (1999).
  11. Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
  12. Hsieh, C. W., Yang, W. Y. Triggering mitophagy with photosensitizers. Methods in Molecular Biology. 1880, 611-619 (2019).
  13. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of Parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
  14. Molinari, M., et al. Vacuoles induced by Helicobacter pylori toxin contain both late endosomal and lysosomal markers. Journal of Biological Chemistry. 272 (40), 25339-25344 (1997).
  15. Prince, L. R., et al. Subversion of a lysosomal pathway regulating neutrophil apoptosis by a major bacterial toxin, pyocyanin. Journal of Immunology. 180 (5), 3502-3511 (2008).
  16. Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11 (8), 1408-1424 (2015).
  17. Prasmickaite, L., Hogset, A., Berg, K. Evaluation of different photosensitizers for use in photochemical gene transfection. Photochemistry and Photobiology. 73 (4), 388-395 (2001).
  18. Berg, K., et al. Photochemical internalization: a novel technology for delivery of macromolecules into cytosol. Cancer Research. 59 (6), 1180-1183 (1999).
  19. Moan, J., Berg, K. The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen. Photochemistry and Photobiology. 53 (4), 549-553 (1991).
  20. Thurston, T. L., Wandel, M. P., von Muhlinen, N., Foeglein, A., Randow, F. Galectin 8 targets damaged vesicles for autophagy to defend cells against bacterial invasion. Nature. 482 (7385), 414-418 (2012).
  21. Repnik, U., et al. L-leucyl-L-leucine methyl ester does not release cysteine cathepsins to the cytosol but inactivates them in transiently permeabilized lysosomes. Journal of Cell Science. 130 (18), 3124-3140 (2017).
  22. Griffiths, G., Hoflack, B., Simons, K., Mellman, I., Kornfeld, S. The mannose 6-phosphate receptor and the biogenesis of lysosomes. Cell. 52 (3), 329-341 (1988).
  23. Jia, J., et al. Galectin-3 Coordinates a cellular system for lysosomal repair and removal. Developmental Cell. 52 (1), 69-87 (2020).
  24. Chu, Y. P., Hung, Y. H., Chang, H. Y., Yang, W. Y. Assays to monitor lysophagy. Methods in Enzymology. 588, 231-244 (2017).
  25. Nguyen, L., Madsen, S. J., Berg, K., Hirschberg, H. An improved in vitro photochemical internalization protocol for 3D spheroid cultures. Lasers in Medical Science. 36 (8), 1567-1571 (2021).
  26. Daugelaviciene, N., et al. Lysosome-targeted photodynamic treatment induces primary keratinocyte differentiation. Journal of Photochemistry and Photobiology. B, Biology. 218, 112183(2021).
  27. Hong, M. H., et al. Intracellular galectins control cellular responses commensurate with cell surface carbohydrate composition. Glycobiology. 30 (1), 49-57 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Galectin 3HeLaAlPcS2a

מאמרים קשורים