מאמר שיטה

בדיקה גנטית לזיהוי מדכאי ריבוי עותקים בסכיזוזאכרומיצס פומבה

DOI:

10.3791/63967

⸱

13 בספטמבר 2022

 ,  ,  , 
1University School of Biotechnology, G.G.S. Indraprastha University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מתארת פרוטוקול לבדיקה גנטית מדכאת מולטי-קופיות בסכיזוזאכרומיצס פומבה. מסך זה משתמש בספריית פלסמידים כלל-גנומית כדי לזהות שיבוטים מדכאים של פנוטיפ אובדן תפקוד הקשור לזן מוטנטי שאילתה. מדכאים גנטיים חדשים של מוטציית האפס ell1 זוהו באמצעות מסך זה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי אינטראקציות גנטיות הוא כלי רב עוצמה לפענוח תפקודי הגנים על ידי מתן תובנות על הקשרים התפקודיים שלהם עם גנים אחרים וארגון למסלולים ותהליכים ביולוגיים. למרות שרוב המסכים הגנטיים פותחו בתחילה ב - Saccharomyces cerevisiae, פלטפורמה משלימה לביצוע בדיקות גנטיות אלה סופקה על ידי Schizosaccharomyces pombe. אחת הגישות הנפוצות המשמשות לזיהוי אינטראקציות גנטיות היא על ידי ביטוי יתר של שיבוטים מספריית פלסמיד בעלת מספר עותקים גבוה בגנום במוטציה של אובדן תפקוד, ולאחר מכן בחירה של שיבוטים המדכאים את הפנוטיפ המוטנטי.

מאמר זה מתאר פרוטוקול לביצוע בדיקה גנטית מבוססת 'דיכוי מרובה קופיות' ב- S. pombe. מסך זה סייע לזהות מדכאי ריבוי עותקים של הפנוטיפ הגנוטוקסי הרגיש ללחץ הקשור להיעדר גורם התארכות שעתוק Ell1 ב- S. pombe. המסך החל על ידי טרנספורמציה של זן מוטנטי ריק ell1 עם ספריית פלסמיד S. pombe cDNA בעלת מספר העתקה גבוה ובחירת המדכאים על לוחות EMM2 המכילים 4-ניטרוקינולין 1-אוקסיד (4-NQO), תרכובת גנוטוקסית הגורמת ללחץ. לאחר מכן, פלסמיד בודד משתי מושבות מדכאות ברשימה הקצרה ועוכל על ידי אנזימי הגבלה כדי לשחרר את הדנ"א המוכנס. פלסמידים המשחררים מקטע דנ"א מוסף הוחזרו לזן המחיקה ell1 כדי לאשר את יכולתם של שיבוטים פלסמידיים מדכאים אלה לשחזר את הצמיחה של מוטציית המחיקה ell1 בנוכחות 4-NQO ותרכובות גנוטוקסיות אחרות. אותם פלסמידים שהראו הצלה של פנוטיפ המחיקה רוצפו כדי לזהות את הגנים האחראים לדיכוי הפנוטיפ הגנוטוקסי הרגיש ללחץ הקשור למחיקה ell1.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רשתות של אינטראקציות גנטיות מספקות מידע פונקציונלי על גנים ומסמנות מסלולים ותהליכים ביולוגיים שגנים אלה עשויים להיות מעורבים בהם in vivo. בנוסף, הם עשויים גם לספק תובנות על האופן שבו גנים שונים מתקשרים זה עם זה, וכתוצאה מכך פנוטיפ מסוים 1,2,3. במהלך השנים, מגוון של בדיקות גנטיות תוכננו על ידי חוקרים כדי לענות על שאלות ביולוגיות בסיסיות ולחקור מחלות אנושיות. ניתן לבצע בדיקות לזיהוי אינטראקציות גנטיות במספר דרכים. אינטראקציות גנטיות שזוהו בבדיקות גנטיות שונות יכולות לייצג יחסים מכניסטיים מובהקים בין גנים. יתר על כן, מחקרים גילו כי קבוצה משותפת של אינטראקציות גנטיות משותפת לגנים המקודדים חלבונים השייכים לאותו מסלול אוקומפלקס 4,5. לפיכך, ניתן להשתמש ברשתות אינטראקציה גנטיות כדי לבסס את הארגון הפונקציונלי בתא, כאשר גנים החולקים את הפרופילים הדומים ביותר שייכים לאותו מתחם או מסלול, אותם גנים החולקים פרופילים קצת פחות דומים שייכים לאותו תהליך ביולוגי, ואותם גנים המציגים פרופילים חופפים אך מגוונים יותר משקפים חברים השייכים לאותו תא תאי6.

מסכי אינטראקציה גנטית המבוססים על דיכוי מינון ('דיכוי עותק גבוה או מולטיקופיה') הם אחת הגישות הנפוצות. ניתן לבצע מסכים אלה על ידי המרת זן מוטנטי שאילתה עם ספרייה גנומית או cDNA בעלת מספר עותקים גבוה, ולאחר מכן טכניקות מבחנים/בחירה מתאימות לזיהוי או שיפור האינטראקציות הגנטיות 7,8,9. כדי להבטיח כיסוי גנומי מקיף, מסכים אלה בוצעו גם על ידי ביטוי יתר של גן מסוים בעל עניין באוסף של מוטציה של אובדן תפקוד כלל-גנומי או על ידי ביטוי יתר של ספריית גנום מקודדת פלסמיד או cDNA בספריית שאילתת אובדן תפקוד 9,10,11,12,13,14,15 . אסטרטגיית המולטי-קופי יכולה לעבוד גם בגישה דומיננטית/ביטוי יתר באמצעות מקדם הניתן לוויסות.

היתרונות העיקריים של שימוש במסכים מבוססי מדכאים הם שדיכוי של פנוטיפ קיים מראש בזן מוטנטי על ידי גן אחר יוצר קשר גנטי בין שני תוצרי גנים אלה שאולי לא הודגם באמצעות גישות אחרות. שנית, נצפה כי נוכחותה של מוטציה קיימת מראש גורמת לרגישות במסלול מסוים, ומאפשרת לזהות מרכיבים נוספים של מסלול זה על ידי בידוד של מדכאים, אשר ייתכן שלא זוהו על ידי בחירות גנטיות ישירות יותר. יתר על כן, מסך זה יכול לשמש כדי לזהות מדכאים שיש להם מנגנונים שונים של דיכוי16. אינטראקציות מדכאות מתרחשות בדרך כלל בין גנים הקשורים תפקודית וניתן להשתמש בהם כדי להבהיר היררכיות במסלולים. מנגנון הדיכוי המדויק עשוי להשתנות בהתבסס על מספר גורמים, כולל סוג מוטציית השאילתה המשמשת במסך, תנאי הניסוי ורמת ביטוי הגנים. אחד ממנגנוני דיכוי המינון הנפוצים כולל גנים המקודדים מוצרים המתפקדים יחד באותו קומפלקס או במקביל באותו תהליך תאי/ביולוגי. ניתן להרחיב את התוצאות של מסכים כאלה באורגניזמי מודל פשוטים יותר, כגון שמרים, לאורגניזמים אאוקריוטים גבוהים יותר, שכן רוב המסלולים והתהליכים הביולוגיים הבסיסיים נשמרים לאורך האבולוציה.

ניתן גם לשנות את המסכים הגנטיים האלה בכמה דרכים כדי לענות על שאלות ביולוגיות שונות. לדוגמה, ניתן לזהות גנים אורתולוגיים מאורגניזמים שונים שיכולים לדכא את הפנוטיפ של הזן המוטנטי של השאילתה. הוא שימש גם לתיחום מנגנוני עמידות פוטנציאליים ולקביעת מטרות חלבוניות של תרכובות אנטי-בקטריאליותחדשות 17,18, אנטי-פטרייתיות19,20, אנטי-פטרייתיות 21 ואנטי-סרטניות 22. מסך זה נוצל גם לזיהוי מדכאי פעילותן של תרופות שמנגנון פעולתן אינו ידוע. לכן, באופן עקרוני, אלה מסכי מדכא multicopy יכול להיות מותאם ולהשתמש במגוון רחב של יישומים באורגניזמים שונים. למרות שרוב המסכים הגנטיים המועסקים על ידי חוקרי שמרים פותחו בתחילה ב- S. cerevisiae, S. pombe התגלה כמערכת מודל משלימה לביצוע בדיקות גנטיות שונותומבחנים 23. יתר על כן, ארגון גנומי ותהליכים ביולוגיים ב- S. pombe, כגון התרחשות של אינטרונים בגנים נוספים, מורכבות מקורות שכפול ה- DNA, מבנה הצנטרומר, ארגון מחזור התא ונוכחות מכונות ה- RNAi, מראים דמיון רב יותר בין S. pombe לבין אאוקריוטים גבוהים יותר23,24, מה שמדגיש את החשיבות של תכנון ושימוש בכלים גנטיים ב- S. pombe.

מאמר זה מתאר פרוטוקול לזיהוי אינטראקציות גנטיות המבוסס על 'דיכוי מינון' של פנוטיפ מוטנטי אובדן תפקוד ב - S. pombe. הבסיס לפרוטוקול זה הוא שמדובר בשיטה מהירה ויעילה לסינון ספריית cDNA המבטאת יתר על המידה גנים מסוג בר, בין אם על גבי פלסמיד רב-קופי ו/או ממקדם חזק. פרוטוקול זה כולל ארבעה שלבים עיקריים: הפיכת הספרייה לזן מוטנטי שאילתה, בחירה של שיבוטים פלסמידיים המדכאים את הפנוטיפ הרצוי של זן מוטנטי השאילתה, שליפת הפלסמיד(ים) משיבוטים מדכאים אלה, וזיהוי הגן האחראי לדיכוי הפנוטיפ. כפי שנכון עבור כל שיטה המבוססת על בחירה וזיהוי של cDNAs מספרייה, הצלחת המסך תלויה בשימוש בספרייה איכותית ומורכבת במיוחד מכיוון שהמסך יכול לאחזר רק את שיבוטי ה- cDNA שנמצאים בספרייה.

באמצעות פרוטוקול זה, זיהינו בהצלחה שני מדכאים חדשים של הפנוטיפ הגנוטוקסי הרגיש ללחץ של השאילתה S. pombe ell1 null mutant. משפחת ELL (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) של גורמי התארכות שעתוק מדכאת השהיה חולפת של RNA פולימראז II על גבי תבניות דנ"א במבחנים ביוכימיים במבחנה, והם נשמרים על פני אורגניזמים שונים, משמרי ביקוע ועד בני אדם25. עבודה מוקדמת יותר סיפקה ראיות לכך שמוטציה של S. pombe ell1 null מראה רגישות ללחץ גנוטוקסי בנוכחות 4-ניטרוקינולין 1-אוקסיד (4-NQO) ומתיל מתנסולפונט (MMS)26. לכן, הפכנו ספריית cDNA בקידוד פלסמיד של S. pombe למוטציה של שאילתה S. pombe ell1 null וזיהינו שני שיבוטים פוטטיביים שהפגינו את היכולת לדכא את הרגישות הגנוטוקסית ללחץ של מוטציית S. pombe ell1 null בנוכחות 4-NQO, תרכובת הגורמת לנגעים בדנ"א. ריצוף מאוחר יותר של התוסף הקיים בשיבוטים של פלסמיד זיהה כי הגנים המקודדים rax2+ ו- osh6+ היו אחראים לדיכוי הרגישות ללחץ הגנוטוקסי של מוטנט האפס ell1 כאשר הם מתבטאים יתר על המידה במוטציה של ell1 null.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. טרנספורמציה של ספריית cDNA לשאילתה S . pombe זן מוטנטי כדי לסנן מדכאי מולטי-קופי

הערה: שיטת ליתיום-אצטט סטנדרטית27 הופעלה כדי להפוך את ספריית S. pombe cDNA לזן S. pombe ell1Δ עם כמה שינויים:

  1. הגדילו את זן S. pombe ell1Δ בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס על צלחת בינונית YE (טבלה 1) בתוספת 225 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד של אדנין, לאוצין ואורציל. לחסן לולאה מלאה באינוקולום של זן ell1Δ מהצלחת הנ"ל ב-15-20 מ"ל של YE בינוני בתוספת 225 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד של אדנין, לאוצין ואורציל. לדגום אותו למשך הלילה בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס עם רעידות (200-250 סל"ד).
  2. למחרת, דללו את תרבית הלילה ב-100 מ"ל של מדיום YE טרי עם התוספים הרצויים ל-OD 600 ננומטר (צפיפות אופטית ב-600 ננומטר) של 0.3 ודגירה ב-32 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-200-250 סל"ד עד שה-OD600 ננומטר יגיע לשלב אמצע העץ.
  3. מחלקים את תרבית 100 מ"ל לשני צינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל, ולאחר מכן צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב-4,000 × גרם.
  4. יש להשליך את הסופר-נאטנט ולשטוף את כדור התא עם 1 מ"ל של מים סטריליים, כלומר, להשעות את התאים ב 1 מ"ל של מים סטריליים צנטריפוגה ב 4,000 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. יש להשליך את תמיסת הסופר-נאטנט ולשטוף כל כדור תא בתמיסת LiAc-TE אחת (100 mM ליתיום אצטט, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) כמתואר בשלב 1.4.
  6. הסר את הסופר-נאטנט ושלח מחדש כל גלולת תא ב-250 μL של 1x LiAc-TE. השתמש בתאים המוכשרים האלה של S. pombe (500 μL) להתמרה עם הדנ"א המעניין. העבר 125 μL מהתאים המוסמכים לארבעה צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים שונים לשלבי הטרנספורמציה הבאים.
  7. מרתיחים דנ"א נשא מאשכי סלמון או זרע הרינג למשך דקה אחת ומניחים מיד על קרח. עבור כל טרנספורמציה, יש להוסיף 10 μL של 10 מ"ג/מ"ל דנ"א נשא חד-גדילי לצינור המיקרוצנטריפוגה המכיל 125 μL מהתאים המתאימים, ולאחר מכן ערבוב עדין באמצעות קצה מיקרופיפטה. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוגרם של ספריית ה- CDNA של S. pombe לצינור ה- DNA המוסמך של תערובת ה- DNA נושאת התאים.
  8. דגרו את צינורות המיקרוצנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולאחר מכן הוסיפו 260 μL של תמיסת פוליאתילן גליקול-ליתיום אצטט (40% [w/v] PEG 4,000, 100 mM ליתיום אצטט, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) לצינורות וערבבו בעדינות בעזרת קצה מיקרופיפט.
  9. דגירה של צינורות microcentrifuge המכילים את תערובת הטרנספורמציה ב 32 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות ללא רעידות. הוסיפו 43 μL של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) שחומם מראש לצינור המיקרוצנטריפוגה וערבבו בעדינות. לאחר מכן, לחשוף את הצינורות להלם חום ב 42 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
  10. גלולה את התאים ב 4,000 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את תמיסת ה-supernatant והסירו את תמיסת PEG-LiAc-TE השיורית בעזרת קצה מיקרופיפט.
  11. יש לתלות את התאים ב-100 μL של מים סטריליים וצלחת על צלחת EMM2 אחת (טבלה 1) (150 מ"מ) עם התוספים הדרושים ו-0.2 מיקרוגרם/מ"ל של 4-NQO.
  12. דגירה של הלוחות בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס למשך 5-6 ימים כדי לאפשר למושבות להופיע על הלוחות. פסים את המושבות המתקבלות על אותה צלחת בינונית בנוכחות 0.2 מיקרוגרם למ"ל של 4-NQO ולהשתמש להקרנה נוספת.
  13. עבור ניסוי טרנספורמציה אחד בספרייה, השתמש ב-500 μL של תאים מוסמכים (125 μL של תאים מוכשרים x 4 צינורות מיקרוצנטריפוגה) לצורך טרנספורמציה כמתואר בשלבים 1.8 עד 1.14 לעיל.
  14. כבקרה, צלחת 1/10th של תערובת הטרנספורמציה על צלחת EMM2 אחת (150 מ"מ) עם תוספי מזון נדרשים, אך חסרים 4-NQO, כדי לחשב את המספר הכולל של שיבוטי הספרייה שהתקבלו לאחר טרנספורמציה של הספרייה, ולסנן בידוד של שיבוטים מדכאים.

2. לבדוק ולאמת את ההצלה/דיכוי של הפנוטיפ הקשור לזן המוטנטי של השאילתה על ידי המדכא הפוטטיבי

הערה: מבחני נקודת מתח בוצעו כמתואר להלן כדי לבדוק ולאמת את ההצלה/דיכוי של רגישות הלחץ 4-NQO הקשורה למחיקה של ell1 על ידי מדכא(ים) פוטטיביים.

  1. הוסף 100-200 μL מים סטריליים בכל אחת מהבארות השונות של צלחת microtiter סטרילית 96-well.
  2. בחר כמות קטנה של אינוקולום מכל אחת מהמושבות השונות שהתקבלו לאחר טרנספורמציה של ספריית cDNA על הצלחת המכילה 4-NQO באמצעות קיסם סטרילי או קצה מיקרופיפטה של 20-200 μL. מוסיפים את האינוקולום מכל אחת מהמושבות השונות לבארות עצמאיות נפרדות של לוחית המיקרוטיטר המכילה 100-200 מיקרון של מים סטריליים. מערבבים היטב.
  3. ספוט 3 μL של תרחיף התא מכל באר על לוחות אגר EMM2 המכילים אדנין (225 מיקרוגרם/מ"ל) ואורציל (225 מיקרוגרם/מ"ל) אך חסרים לאוצין (הסמן האקסוטרופי הניתן לבחירה הנמצא על וקטור הפלסמיד המשמש לבניית הספרייה המשמשת בעבודה זו). הוסיפו ריכוזים מתאימים של 4-NQO לצלחות לפי הצורך.
  4. לדגום את הצלחות בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים כדי לאפשר לתאים לגדול. זהה את המושבות המראות צמיחה בנוכחות ריכוזים שונים של 4-NQO כמדכאי פוטטיביים.
  5. כדי לאמת עוד יותר את המדכאים, הגדילו את המדכאים שנבחרו יחד עם זני בקרה מתאימים למשך הלילה בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס עם רעידות (200-250 סל"ד) בתווך EMM2 המכיל 225 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד של אדנין ואורציל אך חסר לאוצין.
  6. למחרת, דלל את התאים ל-OD 600 ננומטר של 0.3 במדיום EMM2 טרי וגדל אותם בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס עם רעידות עד לשלב אמצע העץ (בערך OD600 ננומטר של 0.6-0.8).
  7. זיהוי דילולים סדרתיים מתאימים (1:10 או 1:5) של תרביות על לוחות EMM2 עם תוספי תזונה נדרשים המכילים 0.4 μM 4-NQO או 0.01% MMS. לשליטה, אתרו את הזנים על צלחת EMM2 עם תוספי התזונה הנדרשים, אך ללא כל חומר המזיק לדנ"א.
  8. לדגור את הצלחות ב 32 מעלות צלזיוס במשך 3-5 ימים כדי לפקח על הצמיחה.
    הערה: יש להשתמש במבחנים מתאימים המבוססים על הפנוטיפ הקשור לזן המוטנטי של השאילתה כדי לבדוק את ההצלה או הדיכוי של הפנוטיפ. לדוגמה, אם יש צורך לזהות מדכאים של פנוטיפ רגיש לקור של זן מוטנטי שאילתה, הבדיקה לבדיקה ואימות של שיבוטים מדכאים תהיה כרוכה בגידול טרנספורמטורים בטמפרטורה נמוכה.
  9. זהה את הזנים המוטנטים שעברו טרנספורמציה עם גן עניין באורך מלא (Spell1 במקרה זה) או וקטור ריק כבקרות חיוביות ושליליות, בהתאמה, יחד עם הטרנספורמטורים של הספרייה.

3. בידוד הפלסמיד משיבוטים מדכאי S. pombe

הערה: בידוד פלסמיד מ- S. pombe בוצע על ידי ביצוע הפרוטוקול המתואר בשמרי ביקוע: מדריך מעבדה28 עם כמה שינויים.

  1. לחסן מושבת שמרים אחת במדיום EMM2 המכילה 225 מיקרוגרם/מ"ל של אדנין ואורציל ולגדל את התאים בן לילה ב-32 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-200-250 סל"ד. למחרת, קציר 5 תאי O.D. (כלומר, תרבית 10 מ"ל של O.D. 0.5) על ידי צנטריפוגה במשך 2 דקות ב 4,000 × גרם בטמפרטורת החדר.
  2. הסר את הסופר-נאטנט ושלח מחדש את כדור התא ב-0.2 מ"ל של מאגר ליזה (2% טריטון X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 8.0) ו-1 mM Na2EDTA).
  3. הוסף 0.2 מ"ל של פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל (25:24:1) ו-0.3 גרם של חרוזי זכוכית שטופים בחומצה לצינור המיקרוצנטריפוגה. מערבלים את צינור המיקרוצנטריפוגה למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ודוגרים על קרח למשך דקה אחת. חזור על שלב זה 6x.
  4. צנטריפוגה את הצינור ב 10,000 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים את השכבה המימית העליונה לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי ומוסיפים 200 μL של פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל (25:24:1).
  5. צנטריפוגה את הצינור ב 10,000 × גרם במשך 10 דקות. מעבירים את השכבה המימית העליונה לצינור טרי ומוסיפים שני נפחים של 100% אתנול (~400 μL) ו-1/10 נפח של נתרן אצטט (3 M, pH 5.8) (~20 μL) לצינור. לדגום את צינור microcentrifuge -70 °C במשך 1 שעות.
  6. מזרזים את הדנ"א על ידי צנטריפוגה ב-10,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ומסירים את הסופר-נטנט. שטפו את כדור הדנ"א ב-70% אתנול (~500 μL) ושמרו אותו בטמפרטורת החדר לייבוש באוויר.
  7. יש לתלות את הדנ"א ב-20 מיקרוגרם של מים סטריליים. השתמש 2-5 μL של DNA פלסמיד עבור טרנספורמציה של תאי E. coli מוכשרים.
    הערה: ניתן לבודד פלסמיד גם מתאי שמרים באמצעות כל אחת מהערכות המסחריות לבידוד פלסמיד שמרים.

4. זיהוי הגן המקודד על ידי שיבוט המדכא

  1. הפוך את פלסמידי השמרים המבודדים לזן E. coli Top10 [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] באמצעות הפרוטוקול הסטנדרטי29 ופזר את התאים על צלחות LB (מרק לוריא) עם אנטיביוטיקה נדרשת.
  2. בודדו את הפלסמיד(ים) מטרנספורמנטים של E. coli באמצעות פרוטוקול הליזיס אלקליין הסטנדרטי 29, ועקבו אחר השילוביםהמתאימים של אנזימי הגבלה כדי לבדוק את שחרור מקטע הדנ"א המכניס על ידי הגבלת העיכול.
    הערה: פלסמיד 84 מדכא עוכל עם אנזים הגבלת BamHI, ופלסמיד מדכא 104 עוכל עם אנזימי הגבלה PstI/BamHI.
  3. שחזרו את הפלסמידים המראים שחרור מוסף לאחר הגבלת העיכול בזן ell1 Δ כדי לבדוק את יכולתם להציל את הפנוטיפ הרגיש ללחץ גנוטוקסי של זן ell1Δ.
  4. בחר את שיבוטי הפלסמיד המראים דיכוי של רגישות הלחץ הגנוטוקסית ורצף את מקטע ה- DNA המכניס הנמצא בשיבוטים פלסמידיים אלה באמצעות פריימרים ספציפיים לווקטור קדימה ואחורה.
    הערה: במחקר זה, נעשה שימוש בפריימר הקדמי האוניברסלי הספציפי למקדם adh1 (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3')30.
  5. כדי לזהות את הגן האחראי לדיכוי, יישר את הרצף המתקבל באמצעות פיצוץ נוקלאוטיד NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) או כלי יישור רצף Pombase (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). בחר את הרצף המציג יישור מרבי וזהה אותו כגן עבור הפלסמיד מדכא המולטיסקופיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקרנה לדיכוי מרובה עותקים של רגישות ללחץ גנוטוקסי הקשור למחיקה ב- S. pombe
ביצענו את הבדיקה הגנטית באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל כדי לזהות מדכאי ריבוי עותקים של פנוטיפ אובדן התפקוד של זן מוטנטי המחיקה של שאילתה. הרגישות הקשורה לגדילה של זן המחיקה ell1 שנצפתה בנוכחות החומר הגנוטוקסי 4-NQO אומצה כפנוטיפ אובדן תפקוד לבחירה עבור מדכאי מולטיסקופיה. איור 1 מראה ייצוג סכמטי של המסך הגנטי. כדי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שמרים היו בשימוש נרחב כדי לחקור את התהליכים הביולוגיים הבסיסיים ואת המסלולים אשר נשמרים אבולוציונית על פני אורגניזמים אאוקריוטים. הזמינות של כלים גנטיים וגנומיים יחד עם הנוחות שלהם להליכים ביוכימיים, גנטיים ומולקולריים שונים הופכים את השמרים לאורגניזם מודל מצוין למחקר גנטי34,35,36. במהלך השנים, בדיקות גנטיות שונות תוכננו על ידי חוקרי שמרים כדי לזהות אינטראקציות גנטיות שישפכו אור על תפקודם של גנים בודדים, כמו גם על המסלולים והתהל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי מענק מחקר מהמחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו (מענק לא. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) לנמישה שארמה. המחברים מודים לפרופ' צ'ארלס הופמן (בוסטון קולג', ארה"ב) על תרומת ספריית ה-cDNA של S. pombe ולפרופ' סוזן פורסבורג על פלסמידי השמרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4-NQOSigmaN8141
חומצה אצטית,סיגמא1371301000
אדנין סולפטHimediaGRM033
אגרHimediaGRM026
אגרוזלונזה50004L
אמוניום כלורידHimediaMB054
BamHIFermentasER0051
ביוטיןHimediaRM095
חומצה בוריתHimediaMB007
סידן כלוריד סיגמאC4901
כלורופורם: אלכוהול איזואמיל 24:1סיגמאC0549
חומצת לימוןHimediaRM1023
דיסודיום מימן פוספט נטול מיםHimediaGRM3960
DNA חד גדילי מאשכי סלמוןSigmaD7656
EDTA דיסודיוםSigma324503
ברזל כלוריד הקסהידראטHimediaRM6353
גלוקוזאמרסקו188
יונוזיטולHimediaGRM102
איזופרופנולQualigenQ26897
לאוציןHimediaGRM054
ליתיום אצטטהסיגמא517992
מגנזיום כלוריד הקסהידראטHimediaMB040
חומצה מוליבדיתHimediaRM690
חומצה ניקוטיניתHimediaCMS177
PEG, MW 4000Sigma81240
חומצה פנטותיניתHimediaTC159
פנולHimediaMB082
ערכת מיצוי פלסמידQiagen27104
אשלגן כלוריSigmaP9541
אשלגן מימן פתלטMercDDD7D670815
אשלגן יודידHimediaRM1086
RNAseFermentasEN0531
SDSHimediaGRM205
נתרן הידרוקסידHimediaGRM1183
נתרן סולפטHimediaRM1037
Tris free BaseHimediaMB209
UracilHimediaGRM264
אבקת תמצית שמריםHimediaRM668
אבץ סולפט HeptahydrateMercDJ9D692580
קרחוני

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R., Lander, E. S. The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1193-1198 (2012).
  2. Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. -L. V., Kruglyak, L. Finding the sources of missing heritability in a yeast cross. Nature. 494 (7436), 234-237 (2013).
  3. Bloom, J. S., et al. Genetic interactions contribute less than additive effects to quantitative trait variation in yeast. Nature Communications. 6 (1), 8712(2015).
  4. Tong, A. H. Y., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303 (5659), New York, N.Y. 808-813 (2004).
  5. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), New York, N.Y. 425-431 (2010).
  6. Costanzo, M., et al. A global genetic interaction network maps a wiring diagram of cellular function. Science. 353 (6306), New York, N.Y. (2016).
  7. Mullen, J. R., Kaliraman, V., Ibrahim, S. S., Brill, S. J. Requirement for three novel protein complexes in the absence of the Sgs1 DNA helicase in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (1), 103-118 (2001).
  8. Kaplan, Y., Kupiec, M. A role for the yeast cell cycle/splicing factor Cdc40 in the G1/S transition. Current Genetics. 51 (2), 123-140 (2007).
  9. Carlsson, M., Hu, G. -Z., Ronne, H. Gene dosage effects in yeast support broader roles for the LOG1, HAM1 and DUT1 genes in detoxification of nucleotide analogues. PLOS One. 13 (5), 0196840(2018).
  10. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Molecular Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
  11. Duffy, S., et al. Overexpression screens identify conserved dosage chromosome instability genes in yeast and human cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 9967-9976 (2016).
  12. Appling, D. R. Genetic approaches to the study of protein-protein interactions. Methods (San Diego, Calif). 19 (2), 338-349 (1999).
  13. Forsburg, S. L. The art and design of genetic screens: yeast. Nature Reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).
  14. Kitazono, A. A., Tobe, B. T. D., Kalton, H., Diamant, N., Kron, S. J. Marker-fusion PCR for one-step mutagenesis of essential genes in yeast. Yeast (Chichester, England). 19 (2), 141-149 (2002).
  15. Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nature Reviews. Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).
  16. Prelich, G. Suppression mechanisms: themes from variations. Trends in Genetics. 15 (7), 261-266 (1999).
  17. Li, X., et al. Multicopy suppressors for novel antibacterial compounds reveal targets and drug efflux susceptibility. Chemistry & Biology. 11 (10), 1423-1430 (2004).
  18. Apfel, C. M., et al. Peptide deformylase as an antibacterial drug target: Target validation and resistance development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1058-1064 (2001).
  19. Tsukahara, K., et al. Medicinal genetics approach towards identifying the molecular target of a novel inhibitor of fungal cell wall assembly. Molecular Microbiology. 48 (4), 1029-1042 (2003).
  20. Calabrese, D., Bille, J., Sanglard, D. A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole. Microbiology. 146 (11), 2743-2754 (2000).
  21. Cotrim, P. C., Garrity, L. K., Beverley, S. M. Isolation of genes mediating resistance to inhibitors of nucleoside and ergosterol metabolism in leishmania by overexpression/selection. Journal of Biological Chemistry. 274 (53), 37723-37730 (1999).
  22. Nodake, Y., Yamasaki, N. Some properties of a macromolecular conjugate of lysozyme prepared by modification with a monomethoxypolyethylene glycol derivative. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (4), 767-774 (2000).
  23. Sunnerhagen, P. Prospects for functional genomics in Schizosaccharomyces pombe. Current Genetics. 42 (2), 73-84 (2002).
  24. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
  25. Sharma, N. Regulation of RNA polymerase II-mediated transcriptional elongation: Implications in human disease. IUBMB Life. 68 (9), 709-716 (2016).
  26. Sweta, K., Dabas, P., Jain, K., Sharma, N. The amino-terminal domain of ELL transcription elongation factor is essential for ELL function in Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 163 (11), Reading, England. 1641-1653 (2017).
  27. Murray, J. M., Watson, A. T., Carr, A. M. Transformation of Schizosaccharomyces pombe: Lithium acetate/dimethyl sulfoxide procedure. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 090969(2016).
  28. Hagan, I., Carr, A. M., Grallert, A., Nurse, P. Fission yeast: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
  29. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 3932(2006).
  30. Janoo, R. T., Neely, L. A., Braun, B. R., Whitehall, S. K., Hoffman, C. S. Transcriptional regulators of the Schizosaccharomyces pombefbp1 gene include two redundant Tup1p-like corepressors and the CCAAT binding factor activation complex. Genetics. 157 (3), 1205-1215 (2001).
  31. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS: Maxipreparation. CSH Protocols. 2006 (1), 4090(2006).
  32. Choi, E., Lee, K., Song, K. Function of rax2p in the polarized growth of fission yeast. Molecules and Cells. 22 (2), 146-153 (2006).
  33. Eisenreichova, A., Różycki, B., Boura, E., Humpolickova, J. Osh6 revisited: Control of PS transport by the concerted actions of PI4P and Sac1 phosphatase. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 747601(2021).
  34. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), New York, N.Y. 1259-1260 (1997).
  35. Forsburg, S. L. The yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research. Gravitational and Space Biology Bulletin: Publication of the American Society for Gravitational and Space Biology. 18 (2), 3-9 (2005).
  36. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  37. Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nature Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
  38. Kitada, K., Johnson, A. L., Johnston, L. H., Sugino, A. A multicopy suppressor gene of the Saccharomyces cerevisiae G1 cell cycle mutant gene dbf4 encodes a protein kinase and is identified as CDC5. Molecular and Cellular Biology. 13 (7), 4445-4457 (1993).
  39. Melnykov, A. V., Elson, E. L. MCH4 is a multicopy suppressor of glycine toxicity in Saccharomyces cerevisiae. , 653444(2019).
  40. Kosodo, Y., et al. Multicopy suppressors of the sly1 temperature-sensitive mutation in the ER-Golgi vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 18 (11), 1003-1014 (2001).
  41. Nakamura, T., Takahashi, S., Takagi, H., Shima, J. Multicopy suppression of oxidant-sensitive eos1 mutation by IZH2 in Saccharomyces cerevisiae and the involvement of Eos1 in zinc homeostasis: Eos1 involvement in zinc homeostasis. FEMS Yeast Research. 10 (3), 259-269 (2010).
  42. Hernández-López, M. J., García-Marqués, S., Randez-Gil, F., Prieto, J. A. Multicopy suppression screening of Saccharomyces cerevisiae identifies the ubiquitination machinery as a main target for improving growth at low temperatures. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7517-7525 (2011).
  43. Sweta, K., Sharma, N. Functional interaction between ELL transcription elongation factor and Epe1 reveals the role of Epe1 in the regulation of transcription outside heterochromatin. Molecular Microbiology. 116 (1), 80-96 (2021).
  44. Kim, D. -U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 617-623 (2010).
  45. Adames, N. R., Gallegos, J. E., Peccoud, J. Yeast genetic interaction screens in the age of CRISPR/Cas. Current Genetics. 65 (2), 307-327 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Ell1DNA

מאמרים קשורים