למטבוליטים מיקרוביאליים שמקורם במעיים יש השפעות רבות פנים המובילות להתנהגות מורכבת אצל בעלי חיים. אנו שואפים לספק שיטה שלב אחר שלב כדי להגדיר את ההשפעות של מטבוליטים מיקרוביאליים שמקורם במעיים במוח באמצעות העברה תוך-חדרית באמצעות צינורית מנחה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
העברה תוך-מוחית של מטבוליטים מיקרוביאליים שמקורם במעיים בעכברים הנעים בחופשיות
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
ההשפעה של מיקרוביוטה של המעיים והמטבוליטים שלהם על הפיזיולוגיה וההתנהגות של המארחים נחקרה בהרחבה בעשור זה. מחקרים רבים גילו כי מטבוליטים שמקורם במיקרוביוטה של המעיים מווסתים תפקודים פיזיולוגיים בתיווך המוח באמצעות מסלולים מורכבים בין המעי למוח אצל הפונדקאי. חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs) הן המטבוליטים העיקריים שמקורם בחיידקים המיוצרים במהלך תסיסת סיבים תזונתיים על-ידי המיקרוביום של המעי. SCFAs מופרשים מהמעיים יכולים לפעול באתרים רבים בפריפריה, ולהשפיע על התגובה החיסונית, האנדוקרינית והעצבית עקב התפוצה העצומה של קולטני SCFAs. לכן, מאתגר להבדיל בין ההשפעות המרכזיות וההיקפיות של SCFAs באמצעות מתן פומי ותוך-צפקי של SCFAs. מאמר זה מציג שיטה מבוססת וידאו לחקור את התפקיד התפקודי של SCFAs במוח באמצעות צינורית מנחה בעכברים הנעים בחופשיות. ניתן להתאים את כמות וסוג ה-SCFAs במוח על ידי שליטה בנפח ובקצב העירוי. שיטה זו יכולה לספק למדענים דרך להעריך את תפקידם של מטבוליטים שמקורם במעיים במוח.
מבוא
מערכת העיכול האנושית מכילה מיקרואורגניזמים מגוונים המשפיעים על המארח 1,2,3. חיידקי המעיים האלה יכולים להפריש מטבוליטים שמקורם במעיים במהלך השימוש שלהם ברכיבים תזונתיים הנצרכים על-ידי המארח 4,5. באופן מעניין, מטבוליטים של המעיים שאינם מטבוליסטים בפריפריה יכולים להיות מועברים לאיברים אחרים דרך מחזור6. שימו לב שהמטבוליטים המופרשים האלה יכולים לשמש כמתווכים לציר המעי-מוח, המוגדר כתקשורת דו-כיוונית בין מערכת העצבים המרכזית למעי7. מחקרים קודמים הראו כי מטבוליטים שמקור....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל פרוטוקולי הניסוי והטיפול בבעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת צ'נג קונג (NCKU) (IACUC).
1. הכנה לחיה הניסיונית
- השג עכברים זכרים מסוג C57BL/6JNarl בני 6-8 שבועות מספקים פרטיים.
- אחסן את העכברים בכלוב עכברים סטנדרטי עם צ'או עכבר סטנדרטי ומים מעוקרים ad libitum.
הערה: תנאי הדיור של מרכז חיות המעבדה של NCKU הם טמפרטורה של 22 ± 1 מעלות צלזיוס, 55% ± 10% לחות, ומחזור אור/חושך של 13 שעות/11 שעות.
2. ניתוח סטריאוטקסי
- הכן ועקר את המכשיר הסטריאוטקסי, כלי הניתוח והפריטים הקשורים.
הערה: כל הפריטים ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
העכבר הוחדר ל-SCFAs שבוע לאחר ההחלמה מהשתלת צינורית המדריך כדי להעריך את פעילות התנועה בכלוב חדש. העכבר הוכנס לכלוב חדשני והוחדר עם 2,100 nL של SCFAs או ACSF ב-5 הדקות הראשונות (קצב אספקה של 7 nL/s) לתוך המוח דרך צינורית המדריך המסחרית שהושתלה בחדר הצדדי של המוח. פעילות התנועה בכלוב חדש נרשמה במשך 30 דקות נוספות לאחר העירוי. לא נצפה הבדל בפעילות התנועתית בכלוב החדש בין עירוי של SCFAs ו-ACSF (איור 6) (n = 2 עכברים לכל קבוצה; הנתונים מוצגים כממוצע ± s.e.m. ומנותחים על ידי ANOVA דו-כיווני).
.......הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מטבוליטים שמקורם במעיים נקשרו למחלות המתווכות על ידי המוח ללא מנגנון מדויק רב, בין היתר בשל אתרי הקשירה המרובים שלהם בגוף 6,12,24. דיווחים קודמים הצביעו על כך ש-SCFAs יכולים לשמש כליגנדים לקולטנים מצומדים לחלבון G, לווסתים אפיגנטיים ולמקורות לייצור אנרגיה במספר אתרים בגוף 6,12. כדי לעקוף את הגורמים המבלבלים שמקורם בפריפריה (כגון תאי מערכת החיסון, הורמונים ומערכת העצבים ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים הקשורים לעבודה זו.
תודות
אנו מודים לצוות מרכז חיות המעבדה באוניברסיטת נשיונל צ'נג קונג (NCKU) על הטיפול בבעלי החיים. עבודה זו נתמכה על ידי מלגה מקרן החינוך של פרופ' קון-ין הואנג מקרן צ'נג-סינג לרפואה ל- C.-W.L.; הכספים ממשרד המדע והטכנולוגיה (MOST) בטייוואן: (מחקר לתואר ראשון MOST 109-2813-C-006-095-B) ל- T.-H.Y.; (רוב 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) ל W.-L.W.; ופרויקט נבטי ההשכלה הגבוהה, משרד החינוך למטה קידום האוניברסיטה ב- NCKU ל- W.-L.W.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>חומר | |||
| אדוויל ליקווי-ג'ל מסיס איבופרופן A2:D41 | פייזר | n/a | |
| Alexa Fluor 488 חמור נגד ארנב | ThermoFisher Scientific | A-21206 | |
| אנטי פלואורסצנטי זהב (פוליקלונל ארנב) | Millipore | AB153-I | |
| מסנן ואקום עליון לבקבוק, 500 מ"ל, 0.22 μ m, PES, NEST סטרילי | 121921LA01 | ||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | ACSF: 0.14 גרם/ליטר |
| פילינג כלורהקסידין 2% | Phoenix | NDC 57319-611-09 | |
| תמיסת כלורהקסידין | Phoenix | NDC 57319-599-09 | |
| דמה מסחרית | RWD Life Science | 62004 | Single_OD 0.20 מ"מ / M3.5 / G = 0.5 מ"מ |
| מדריך מסחרי קנול | RWD מדעי החיים | 62104 | Single_OD 0.41 מ"מ-27 גרם / M3.5 / C = 2.5 מ"מ |
| מזרק מסחרי | RWD Life Science | 62204 | Single_OD 0.21 מ"מ-33G/ חברים עם M3.5/C = 3.5 מ"מ/G = 0.5 מ"מ |
| D-(+)-גלוקוז | סיגמא-אולדריץ' | G8270 | ACSF: 0.61 גרם/ליטר |
| אקריליק דנטלי | היגן | n/a | |
| ברגי קיבוע | RWD Life Science | 62521 | |
| מדיום הרכבה פלואורושילד עם DAPI | Abcam | AB104139 | |
| סרום סוסים | ThermoFisher Scientific | 16050130 | |
| מזרקי אינסולין | BBraun | XG-LBB-9151133S-1BX | 1 מ"ל |
| איזופלורן | פאניון & BF ביוטק | DG-4900-250D | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | ACSF: 0.19 גרם/ליטר |
| קטופרופן | סוויס פרמצבטיקה | n/a | |
| לידוקאין | AstraZeneca | n/a | |
| נקודת התכה נמוכה agarose | Invitrogen | 16520 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | ACSF: 0.19 גרם/ליטר |
| כיסוי מיקרוסקופ | MARIENFELD | 101242 | |
| שקופיות מיקרוסקופ | ThermoFisher Scientific | 4951PLUS-001E | |
| שמן מינרלי אור, לבן NF | Macron Fine Chemicals | MA-6358-04 | |
| NaCl | סיגמא-אולדריץ' | S9888 | ACSF: 7.46 גרם/ליטר |
| NaH<תת>2PO4 | סיגמא-אולדריץ' | S8282 | ACSF: 0.18 גרם/ליטר |
| NaHCO<תת>3 | Sigma-Aldrich | S5761 | ACSF: 1.76 גרם/ליטר |
| דבק n-butyl cyanoacrylate (דבק רקמות) | 3M | 1469SB | 3M Vetbond |
| Neural tracer | Santa Cruz | SC-358883 | FluoroGold |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| צינור פוליאתילן | RWD מדעי החיים | 62329 | OD 1.50, תעודת זהות 0.50 מ"מ ו-OD 1.09, תעודת זהות 0.38 מ"מ |
| Puralube משחה וטרינרית (עין) | Dechra | ||
| נתרן אצטט | Sigma-Aldrich | S2889 | SCFAs: 13.5 מ"מ |
| נתרן אזיד | סיגמא-אולדריץ' | S2002 | |
| נתרן בוטיראט | Sigma-Aldrich | B5887 | SCFAs: 8 מ"מ |
| נתרן פרופיונט | Sigma-Aldrich | P1880 | SCFAs: 5.18 מ"מ |
| צינורית מדריך אל חלד | Chun Ta נירוסטה ארגונית ושות', בע"מ. | n/a | OD 0.63 מ"מ; ספק מקומי |
| מזרק אל חלד | Chun Ta מפעל נירוסטה ושות', בע"מ | n/a | OD 0.3 מ"מ; דמה עשויה ממזרק; הספק המקומי |
| Superglue | Krazy Glue | KG94548R | |
| Triton X-100 | Merck | 1.08603.1000< | |
| חזק>ציוד | |||
| מחזיק צינורית | RWD Life Science | B485-68217 | |
| מצלמת תקרה | FOSCAM | R2 | |
| מכשירים סטריאוטקסיים דיגיטליים | Stoelting | 51730D | |
| מיקרוסקופ ניתוח | INNOVIEW | SEM-HT/TW | |
| מעקר חרוזי זכוכית | RWD מדעי החיים | RS1501 | |
| כרית חימום | Stoelting | 53800M | |
| מיקרוסקופ לייקה | Leica | DM2500 | |
| מיקרו מלקחיים מנתחים | ROBOZ | RS-5136 | משונן, עקומה קלה; עדין במיוחד; רוחב קצה 0.5 מ"מ; אורך 4 אינץ' |
| מספריים מיקרו חיתוך | ROBOZ | RS-5918 | 4.5 אינץ' |
| בקר מיקרו-הזרקה | מכשירי דיוק עולמיים (WPI) | MICRO2T | SMARTouch |
| בקר משאבת מזרק מיקרו-הזרקה | מכשירי דיוק עולמיים (WPI) | UMP3T-1 | UltraMicroPump3 |
| מזרק מיקרוליטר | המילטון | 80014 | 10 ומיקרו; L |
| סיבים אופטיים אור קר עם סיבים כפולים | צעד | LGY-150 | ספק מקומי |
| גוזם חיות מחמד | WAHL | 09962-2018 | |
| וופורייזר עבור Isoflurane | Step | AS-01 | ספק מקומי |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| תוכנה | |||
| בעלי חיים התנהגות וידאו תוכנת מעקב | Noldus | EthoVision | גרסה: 15.0.1416 |
| Leica Application Suite X תוכנה | Leica | LASX | גרסה: 3.7.2.22383 |
מקורות
- Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
- Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
