פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה של פיגומי ננו-מטריצת בסיס יאנוס (JBNm) שכבה אחר שכבה על ידי הוספת ננו-צינוריות בסיס יאנוס (JBNts), מטרילין-3 וגורם גדילה מתמיר בטא-1 (TGF-β1) ברצף. ה-JBNm היה מפוברק ומאופיין; בנוסף, הוא הפגין פעילות ביולוגית מצוינת, ועודד תפקודי תאים כגון הידבקות, שגשוג והתמיינות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ייצור ואפיון של ננו-מטריצת בסיס יאנוס שכבה אחר שכבה לקידום התחדשות הסחוס
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
פיגומים ביולוגיים שונים פותחו כדי להנחות הידבקות ושגשוג של תאים בתקווה לקדם פונקציות ספציפיות לשימושים במבחנה וב-in vivo . התוספת של גורמי גדילה לתוך פיגומים ביו-חומריים אלה נעשית בדרך כלל כדי לספק סביבת תרבית תאים אופטימלית, המתווכת את התמיינות התא ואת הפונקציות הבאות שלה. עם זאת, גורמי הגדילה בפיגום ביו-חומרי קונבנציונלי מתוכננים בדרך כלל להשתחרר עם ההשתלה, מה שעלול לגרום לתופעות לוואי לא מכוונות על הרקמות או התאים הסובבים אותם. כאן, ננו-מטריצת הבסיס של Janus בהשראת הדנ"א (JBNm) השיגה בהצלחה מיקרו-סביבה מקומית ביותר עם מבנה שכבה אחר שכבה לבניית רקמות סחוס בנות קיימא. JBNms מורכבים בעצמם מננו-צינוריות בסיס יאנוס (JBNts), מטרילין-3, וגורם גדילה מתמיר בטא-1 (TGF-β1) באמצעות ביו-אפיניות. ה-JBNm הורכב ביחס TGF-β1:matrilin-3:JBNt של 1:4:10, שכן זה היה היחס שנקבע שבו הרכבה נכונה למבנה שכבה אחר שכבה יכולה להתרחש. ראשית, הפתרון TGF-β1 נוסף לפתרון matrilin-3. לאחר מכן, תערובת זו היתה pipetted מספר פעמים כדי להבטיח הומוגניות מספקת לפני תוספת של פתרון JBNt. זה יצר את JBNm שכבה אחר שכבה, לאחר פיפטינג מספר פעמים שוב. מגוון ניסויים נערכו כדי לאפיין את מבנה JBNm שכבה אחר שכבה, JBNts לבדו, מטרילין-3 לבדו ו-TGF-β1 לבדו. היווצרות JBNm נחקרה עם ספקטרום קליטת UV-Vis, ומבנה ה- JBNm נצפה במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM). כאשר פיגומי JBNm החדשניים שכבה אחר שכבה נוצרים בקנה מידה מולקולרי, ניתן היה לצפות ב- JBNm המסומן בצבע פלואורסצנטי. ה- TGF-β1 מוגבל בתוך השכבה הפנימית של ה- JBNm הניתן להזרקה, מה שיכול למנוע שחרור של גורמי גדילה לאזורים הסמוכים, לקדם כונדרוגנזה מקומית ולקדם מיקרו-סביבה אנטי-היפרטרופית.
מבוא
פיגומים בהנדסת רקמות ממלאים תפקיד חיוני במתן תמיכה מבנית לחיבור תאים ולהתפתחות רקמות לאחר מכן1. בדרך כלל, מבני רקמה קונבנציונליים ללא פיגומים מסתמכים על סביבת תרבית התאים ומוסיפים גורמי גדילה כדי לתווך התמיינות תאים. יתר על כן, תוספת זו של מולקולות ביו-אקטיביות לפיגומים היא לעתים קרובות הגישה המועדפת בהנחיית התמיינות תאים ותפקודם 2,3. פיגומים מסוימים יכולים לחקות את המיקרו-סביבה הביוכימית של רקמות מקומיות באופן עצמאי, בעוד שאחרים יכולים להשפיע ישירות על תפקודי התאים באמצעות גורמי גדילה. עם זאת, חוקרים נתקלים לעתים קרובות באתגרים בבחירת פיגומים שיכולים להשפיע לטובה על הידבקות הת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. סינתזה של JBNts
- הכן את מונומר JBNt תוך שימוש בשיטות שפורסמו בעבר, הכוללות סינתזה של מגוון תרכובות12.
- נקה מונומר JBNt גולמי לאחר שהוא מסונתז עם כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) באמצעות עמודה בפאזה הפוכה. השתמש בממס A: 100% מים, ממס B: 100% אצטוניטריל, וממס C: תמיסת מים HCl עם pH = 1. השתמש בקצב זרימה של 3 מ"ל/דקה. אסוף את הפסגה הגדולה ביותר שהושגה ב- HPLC ב- 7.2 דקות.
2. ייצור עבור JBNt/Matn1/TGF-β1 (וידאו 1)
הערה: סרטון 1 מראה כי JBNm הוא מוצק הניתן להזרקה שנוצר בסביבה פיזיולוגית (תמיסת מים, ללא אור ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעקבות הפרוטוקול, JBNts סונתזו בהצלחה ואופיינו בספיגת UV-Vis ו- TEM. ה- JBNm הוא פיגום מוצק הניתן להזרקה העובר תהליך ביומימטי מהיר. לאחר ש-JBNts נוספו לתערובת של תמיסת TGF-β1/matrilin-3 בסביבה פיזיולוגית, נוצר פיגום רשת לבן מוצק המעיד על הרכבה מוצלחת של JBNm, כפי שניתן לראות באיור 1. הדבר הודגם בשיטות האפיון.
בתנאים פיזיולוגיים, מטרילין-3 טעון שלילית בגלל הנקודה האיזואלקטרית27 שלו (איור 2A). לאחר הוספת תמיסת TG.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מטרת מחקר זה היא לפתח פלטפורמת פיגומים ביומימטיים, JBNm, כדי להתגבר על המגבלות של מבני רקמה קונבנציונליים המסתמכים על סביבות תרביות תאים כדי לתווך התמיינות תאים. ה- JBNm הוא פיגום מבנה שכבה אחר שכבה לבניית רקמת סחוס בת קיימא. העיצוב החדשני מבוסס על ננו-חומרים חדשניים בהשראת דנ"א, ה-JBNts. ה-JBNm, המורכב מ-JBNts30, TGF-β1 ו-matrilin-3, מורכב בטכניקה חדשנית של שכבה אחר שכבה, שבה ההרכבה העצמית של הפיגום נשלטה ברמה המולקולרית. ההרכבה של JBNm נצפתה ואופיינה במדידת פוטנציאל זטה, ספיגת UV-Vis, TEM ואנליז.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
ד"ר יופנג צ'ן הוא מייסד שותף של Eascra Biotech, Inc. ו- NanoDe Therapeutics, Inc. .
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי מענקי NIH 7R01AR072027 ו- 7R03AR069383, פרס הקריירה של NSF 1905785, NSF 2025362 ואוניברסיטת קונטיקט. עבודה זו נתמכת בחלקה גם על ידי מענק NIH S10OD016435.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 10% סרום עיזים רגיל | Thermo Fisher | 50062Z | חומר המשמש לחסימת פעולות קשירת נוגדנים לא ספציפיות במהלך הצביעה. |
| צלחת 24 בארות | קורנינג | 07-200-740 | צלחת 24 בארות המשמשת לתרבית תאים השוואתית. |
| צלחת שחורה לא מטופלת 384 באר | Thermo Fisher | 262260 | צלחת 384 בארות המשמשת למדידות ספיגה. |
| זכוכית כיסוי 8 תאים | Thermo Fisher | 155409PK | 8 בארות כיסוי המשמשת לתרבית תאים השוואתית. |
| 96 בארות תחתית | שטוחה קורנינג | 07-200-91 | צלחת 96 בארות המשמשת לתרבית תאים השוואתית. |
| צלחת 96 בארות צלחת | תרמו פישר | 260895 | צלחת 96 בארות המשמשת לתרבית תאים השוואתית וניתוח. |
| אגרוז ג'ל | סיגמא-אולדריץ' | A9539 | הידרוג'ל המשמש לתרבית תאים. |
| Agarose Gel | Sigma Aldrich | A9539 | הידרוג'ל משמש כסביבה לתרבית תאים. |
| ערכת תיוג חלבון בקנה מידה מיקרו של Alexa Fluor | Thermo Fisher | A30006 (488) ו- A30007 (555) | צבע פלואורסצנטי המשמש לתיוג חלבונים. |
| נוגדן אנטי-קולגן X | תרמו פישר | 41-9771-82 | נוגדן המשמש לצביעה של קולגן-X. |
| מכונת Bio-Rad PCR | Bio-Rad | המשמש לביצוע PCR על דגימות. | |
| C28/I2 תאי קו כונדרוציטים | המשמשים לניתוח יכולות שגשוג של דגימות שונות. | ||
| ערכת ספירת תאים 8 | Milipore Sigma | 96992 | בדיקת התפשטות תאים. |
| תוכנת Cell Profiler | Broad Institute | המשמשת לניתוח תמונות תאים. | |
| קריוסטט | המשמש לייצור מקטעים דקים של דגימות לשימוש בצביעה ומיקרוסקופיה. | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | כתם פלואורסצנטי כחול הנקשר לאזורי DNA אדנין-תימין. |
| קובטות חד פעמיות | FISHER Scientific | 14-955-128 | מיכל המשמש לספקטרופוטומטריה. |
| DMEM Cell Culture Medium | Thermo Fisher | 10566032 | Media המשמש לתמיכה בצמיחה תאית. |
| סרום בקר עוברי | GIBCO | A4766801 | סרום המשמש במדיום תרבית תאים לתמיכה בצמיחת תאים. |
| Fluoromount-G הרכבה בינונית | תרמו פישר | 00-4958-02 | פתרון המשמש להרכבת שקופיות לצביעה חיסונית. |
| תרכובת פורמלדהיד | המשמשת לקיבוע דגימות לפני מיקרוטום. | ||
| עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג מאוד Thermo | Fisher | A16110 | נוגדן המשמש לצביעת חלבון. |
| תאי גזע מזנכימליים אנושיים | LONZA | PT-2501 | תאים המשמשים לניתוח יכולות התמיינות של דגימות שונות. |
| מדיום כונדרוגני גזע מזנכימלי אנושי | LONZA | PT-3003 | מדיום תאים המשמש לקידום התמיינות כונדרוגנית. |
| ImageJ | המכונים הלאומיים לבריאות | תוכנת ניתוח תמונות המשמשת בשילוב עם מיקרוסקופיה. | |
| itaq ערכת צעד אחד ירוקה אוניברסלית SYBR ערכת | 1725150 BioRad | המשמשת ל-PCR. | |
| ננו-צינוריות בסיס ג'אנוס (JBNts) | ננו-צינוריות העשוי מנוקלאובסיסים סינתטיים כדי לשמש ככלי פיגומי תאים. | ||
| LaB6 20-120 kV מיקרוסקופ אלקטרוני שידור | ציוד טכני | המשמש לביצוע מיקרוסקופ אלקטרונים שידור על דגימה. | |
| MATLAB | MathWorks | תוכנה סטטיסטית המשמשת למידול וניתוח נתונים. | |
| Matrilin-3 | Fisher Scientific | 3017MN050 | חלבון מבני המשמש כאתרי הידבקות לכונדרוציטים. |
| ספקטרופוטומטר NanoDrop | תרמו פישר | המשמש למדידת ערכי ספיגה של דגימה. | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי ספקטרלי של Nikon A1R מיקרוסקופ קונפוקלי | Nikon | A1R HD25 | המשמש לניתוח דגימות. |
| מספר 1.5 קאמרי Coverglass | Thermo Fisher | 152250 | סביבה לתרבית תאים סטרילית והדמיה. |
| תרכובת בטמפרטורת חיתוך אופטימלית | המשמשת להטמעת תאים לפני מיקרוטום. | ||
| תרכובת Paraformaldehyde | Thermo Scientific | AAJ19943K2 | המשמשת לקיבוע תאים. |
| מנקה פלזמה PDC-32G מנקה | פלזמה | משמש להכנת רשתות לפני מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | GIBCO | 15-140-148 | חומר אנטיביוטי המשמש לעיכוב צמיחת חיידקים במהלך תרבית תאים. |
| תמיסת 10010023 Thermo Fisher Thermo Fisher חוצץ פוספט | המשמשת לשטיפת מדיום התא ומשמשת כחוצץ במהלך הניסויים. | ||
| רודמין-פלואידין | Invitrogen | R415 | F-Actin צבע פלואורסצנטי אדום. |
| מיני צמחים | Rneasy QIAGEN | 74904 | משמשת לסינון והומוגניזציה של דגימות במהלך מיצוי RNA. |
| תמיסת | המשמשת לעיבוד דגימות לפני מיקרוטום. | ||
| ערכת ELISA אנושית TGF beta-1 | Invitrogen | BMS249-4 | המשמשת לקביעת נוכחות TGF-ובטא; 1 במדגם. |
| TGF ובטא; 1 | PEPROTECH | 100-21C | גורם גדילה המשמש לגירוי התמיינות כונדרוגנית והתפשטות. |
| Triton-X | Invitrogen | HFH10 | תרכובת המשמשת לליזה של תאים שאינם מקובעים בתהליך הצביעה. |
| מגיב TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | מגיב המשמש לבידוד RNA. |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern ציוד אנליטי | המשמש למדידת ערכי פוטנציאל זטה של מדגם. |
מקורות
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
- Heo, D. N., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
