מאמר שיטה

כליות שלמות כתמים תלת מימדיים עם CUBIC

4.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63986

⸱

18 ביולי 2022

 , 
1Division of Nephrology and Endocrinology, The University of Tokyo

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטת ניקוי רקמות והכתמה אימונופלואורסצנטית שלמה להדמיית כליות תלת-ממדית (3D). טכניקה זו יכולה להציע פרספקטיבות מקרוסקופיות בפתולוגיה של הכליות, מה שמוביל לתגליות ביולוגיות חדשות.

תקציר

למרות שהפתולוגיה הקונבנציונלית סיפקה מידע רב על מיקרו-מבנה הכליות, היה קשה לדעת את המבנה המדויק של כלי דם, צינוריות פרוקסימליות, צינורות איסוף, גלומרולי ועצבים סימפתטיים בכליה בשל היעדר מידע תלת מימדי (3D). סליקה אופטית היא אסטרטגיה טובה להתגבר על המשוכה הגדולה הזו. ניתן לנתח תאים מרובים באיבר שלם ברזולוציה של תא בודד על ידי שילוב של ניקוי רקמות וטכניקת הדמיה תלת-ממדית. עם זאת, שיטות תיוג תאים להדמיית איברים שלמים עדיין אינן מפותחות. בפרט, צביעת איברים שלמים היא מאתגרת בגלל הקושי בחדירת נוגדנים. הפרוטוקול הנוכחי פיתח כתמי כליה של עכברים שלמים להדמיה תלת-ממדית בשיטת ניקוי הרקמות CUBIC (קוקטיילים ברורים ללא הפרעה להדמיית מוח/גוף ואנליזה חישובית). הפרוטוקול איפשר לדמיין ניתוק עצבים סימפתטי כלייתי לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה וגלומרולאומגהליה בשלב מוקדם של מחלת כליות סוכרתית מנקודת מבט מקיפה. לפיכך, טכניקה זו יכולה להוביל לתגליות חדשות בחקר הכליות על ידי מתן פרספקטיבה מקרוסקופית.

מבוא

הכליה מורכבת מאוכלוסיות תאים שונות. למרות שהפתולוגיה הקונבנציונלית נותנת לנו מידע רב על המיקרו-סביבה של הכליות, יש צורך בהדמיה תלת-ממדית (3D) כדי להבין במדויק את ההצלבה הבין-תאית במהלך התקדמות מחלת הכליות. בעבר, היה צורך לבצע מספר עצום של חתכים סדרתיים ושחזור תמונה עבור הדמיה תלת-ממדית של איבר שלם1. עם זאת, שיטה זו דרשה מאמץ רב מדי והיו לה בעיות מבחינת יכולת השכפול.

סליקה אופטית היא אסטרטגיה טובה להתגבר על מכשולזה 2,3. אטימות הרקמות נובעת בעיקר מפיזור וספיגת אור מכיוון שכל איבר מורכב מחומרים שונים, כולל מים, חלבון ושומנים. לפיכך, האסטרטגיה הבסיסית של ניקוי רקמות היא החלפת מים ושומנים ברקמות עם מקדם שבירה (RI) תואם ריאגנטים בעלי תכונות אופטיות זהות לאלה של חלבונים4. על מנת לצפות בדגימה שקופה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור שימושית5. לוחות אור מאירים את הדגימה השקופה מהצד, ואותות עירור נרכשים דרך העדשה האובייקטיבית הממוקמת במצב אנכי6. מיקרוסקופיה זו מקבלת מידע חתך רוחב במטאטא אחד, השונה מהמיקרוסקופיה הפלואורסצנטית הקונפוקלית או הרב-פוטונית. לכן, הוא יכול לרכוש במהירות z-stack תמונות עם רמה נמוכה של photobleaching.

קוקטיילים ברורים ללא הפרעה של דימות מוח/גוף ואנליזה חישובית (CUBIC) היא אחת משיטות ניקוי הרקמות המאפשרת הדמיה של איברים שלמים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור 2,7,8. מכתים אימונופלואורסצנטיים מעוקבים ושלמים ממוטבים במחקר הנוכחי כדי לדמיין מבנים תלת-ממדיים של כליות עכברים 9,10,11. באמצעות שיטת צביעה זו, השינוי בעצבים סימפתטיים כלייתיים הוא הדמיה לאחר פגיעה איסכמיה-reperfusion 9,10 ו glomerulomegaly בשלב מוקדם של מחלת כליות סוכרתית 11, כמו גם כלי דם, צינוריות פרוקסימליות, ואיסוף צינורות בכליה שלמה9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת טוקיו. כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות. עכברי C57BL/6NJcl זכרים, בני 8 שבועות, שימשו למחקר הנוכחי. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).

1. הכנת בעלי חיים וקיבוע כליות

  1. בצע קיבוע פרפוזיה לפי השלבים הבאים.
    1. הרדמת העכבר על ידי שאיפת איזופלורן (3%, 2.0 ליטר/דקה) ומתן תוך-צפקי של מדטומידין הידרוכלוריד (0.3 מ"ג/ק"ג), בוטורפנול טרטרט (5 מ"ג/ק"ג) ומידזולם (4 מ"ג/ק"ג) (ראו טבלת חומרים).
    2. יש ליטול את החיה עם 20 מ"ל של PBS (pH 7.4) ו-30 מ"ל של 4% PFA בחיץ פוספט (PB) דרך החדר השמאלי של הלב12.
  2. בצעו את קיבוע הטבילה מיד לאחר קיבוע הזלף ודגימת הכליות9.
    1. טבלו את הכליה ב-4% PFA ב-4 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות נוספות, ואז שטפו אותה עם PBS במשך שעתיים (שלוש פעמים)9 (איור 1).
      אזהרה: פורמלדהיד ופרפורמלדהיד הם חומרים מגרים רעילים. טפלו בריאגנטים במכסה אדים עם ציוד מגן אישי מתאים.

2. דה-קולוריזציה ודליפידציה

  1. הכן את CUBIC-L לדה-צביעה ולעדנה המורכבת מ-10 wt% של טריטון X-100 ו-10 wt% של N-buthyldiethanolamine (ראו טבלת חומרים), בעקבות דוחות שפורסמו בעבר 4,8,9.
  2. בצע דה-צביעה והפחתה על-ידי CUBIC-L בהתאם לשלבים הבאים.
    1. טבלו את הכליה הקבועה ב-7 מ"ל של 50% (v/v) CUBIC-L (תערובת של 1:1 של מים ו-CUBIC-L) בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל (ראו טבלת חומרים) עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר למשך 6 שעות (איור 2A). לאחר מכן, טבלו אותו ב-7 מ"ל של CUBIC-L בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל עם רעידות עדינות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.
    2. רענן את CUBIC-L מדי יום במהלך תהליך זה. לאחר תהליך הדה-צביעה וההעדה, שטפו את הכליה עם PBS בטמפרטורת החדר למשך שעתיים (שלוש פעמים)9 (איור 1). השתמשו בכף חלוקה לטיפול בדגימה (איור 2B).

3. צביעה אימונופלואורסצנטית שלמה

  1. מכינים את המאגרים המכתימים.
    1. הכינו את חיץ הצביעה לנוגדנים ראשוניים על ידי ערבוב של 0.5% (v/v) Triton X-100, 0.5% קזאין ב-PBS ו-0.05% נתרן אזיד9.
    2. הכינו את מאגר הצביעה לנוגדנים משניים על ידי ערבוב של 0.5% (v/v) Triton X-100, 0.1% קזאין ב-PBS ו-0.05% נתרן אזיד9.
  2. בצע צביעה עם נוגדנים ראשוניים.
    1. Immunostain הכליה הפגועה עם נוגדנים ראשוניים (1:100 או 1:200, ראו טבלת חומרים) במאגר המכתים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין למשך 7 ימים.
      הערה: כמות חיץ הכתמים הדרושה לכליה אחת היא 500-600 μL (איור 2C).
    2. שטפו את הכליה ב-0.5% (v/v) Triton X-100 ב-PBS (PBST) בטמפרטורת החדר למשך יוםאחד 9 (איור 1).
  3. בצע צביעה עם נוגדנים משניים.
    1. מכתים את הכליה בנוגדנים משניים (1:100 או 1:200, ראו טבלת חומרים) בחיץ המכתים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות למשך 7 ימים. שטפו את הכליה עם PBST בטמפרטורת החדר למשך יוםאחד 9 (איור 1).
    2. לאחר קיבוע9, טבלו את הכליה בפורמלדהיד 1% ב-PB (תערובת של 37% פורמלדהיד ו-PB ביחס של 1:36) למשך 3 שעות, ושטפו אותה עם PBS בטמפרטורת החדר למשך 6 שעות (איור 1).

4. התאמת מקדם שבירה (RI)

  1. הכן CUBIC-R+.
    1. הכינו את CUBIC-R על ידי ערבוב של 45 wt% של 2,3-דימתיל-1-פניל-5-פיראזולון/אנטיפירין ו-30 wt% של ניקוטין-אמיד (ראו טבלת חומרים).
    2. הכן את CUBIC-R+ להתאמת מקדם השבירה (RI) על ידי הוספת 0.5 v% של N-buthyldiethanolamine ל- CUBIC-R בעקבות הדוחות שפורסמו בעבר 4,8,9.
  2. בצע את התאמת ה- RI.
    1. יש לטבול את הכליה ב-7 מ"ל של 50% (v/v) CUBIC-R+ (תערובת של 1:1 של מים ו-CUBIC-R+) בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר למשך יום אחד. לאחר מכן, טבלו אותו ב-7 מ"ל של CUBIC-R+ בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר למשך יומיים9 (איור 1).
      הערה: למרות שהכליה צפה ב-50% CUBIC-R+ בתחילת התאמת ה-RI, היא שוקעת והופכת לשקופה ב-CUBIC-R+ בסוף התהליך (איור 2D).

5. רכישת תמונה ושחזורה

  1. טבלו את הכליה התואמת ל-RI בתערובת של שמן סיליקון (RI = 1.555) ושמן מינרלי (RI = 1.467) (55:45) במהלך רכישת התמונה (RI = 1.51)5 (איור 3).
  2. קבל תמונות תלת-ממדיות של הכליה כולה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטיבעל 9 יריעות אור שנבנה בהתאמה אישית (ראו טבלת חומרים). אסוף את כל נתוני התמונה הגולמיים בתבנית TIFF של 16 סיביות. הצג באופן חזותי ולכוד את התמונות המעובדות בתלת-ממד באמצעות תוכנת ניתוח ההדמיה (Imaris, ראה טבלת חומרים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות שיטת הכתמים הזו,הודגמו עצבים סימפתטיים [נוגדן אנטי-טירוזין הידרוקסילאז (TH)] ועורקים [נוגדן אקטין נגד α שריר חלק (αSMA)] בכליה שלמה (איור 4A,B ווידאו 1). עצבים סימפתטיים כלייתיים חריגים הודגמו גם לאחר פגיעה באיסכמיה/רפרפוזיה (IRI)9,10 (איור 4C). יתר על כן, הדמיה של עצבים סימפתטיים בכל הטחול13 הושגה באמצעות פרוטוקול ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול הנוכחי איפשר הדמיה תלת-ממדית של כליות שלמות של מבנים שונים כגון עצבים סימפתטיים, צינורות איסוף, עורקים, צינוריות פרוקסימליות וגלומרולי 9,10,11. שיטת צביעה זו הציעה תצפית מקרוסקופית והובילה לתגליות ביולוגיות חדשות, על ידי הדמיה של השינוי בעצבים הסימפתטיים הכלייתיים לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה 9,10 וגלומרולאומגהליה בשלב הראשוני של מחלת כליות סוכרתית 11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

חלק מעבודה זו נערך בשיתוף פעולה עם פרופ' הירוקי ר. אואדה (אוניברסיטת טוקיו), פרופ' אטסואו א. סוסאקי (אוניברסיטת ג'ונטנדו), פרופ' טטסוהירו טאנאקה (אוניברסיטת טוהוקו), פרופ' מסאפומי פוקגאווה, ד"ר טקהיקו ואדה וד"ר הירוטאקה קומבה (אוניברסיטת טוקאי).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
14 מ"ל תחתית עגולה בהירות גבוהה PP מבחנהפלקון352059ניקוי רקמות, צביעה, שטיפה
2,3-דימתיל-1-פניל-5-פיראזולון/אנטיפיריןטוקיו תעשייה כימיתD1876CUBIC-R+
37%-תמיסת פורמלדהידנקלאי טסק16223-55לאחר קיבוע
4%-פרפורמלדהיד תמיסת חיץ פוספטנקלאי טסק09154-85קיבוע כליות
קמח אלקסה 555 חמור מצומד נגד כבשים נוגדן IgGInvitrogenA-21436נוגדן משני (1:100)
קמח אלקסה 647 חמור מצומד נגד ארנב נוגדן IgGInvitrogenA-31573נוגדן משני (1:200)
נוגדן נגד אקוופורין 2 (AQP2) Abcamab199975נוגדן ראשוני (1:100)
נוגדן נגד פודוציןSigma-AldrichP0372נוגדן ראשוני (1:100)
נוגדן אנטי נתרן גלוקוז קוטרנספורטר 2 (SGLT2) נוגדןAbcamab85626נוגדן ראשוני (1:100)
נוגדן אנטי טירוזין הידרוקסילאז (TH)Abcamab113נוגדן ראשוני (1:100)
נוגדן אנטי &אלפא שריר חלק אקטין (α-SMA)Abcamab5694נוגדן ראשוני (1:200)
חוסם קזאין ב-PBSThermo Fisher Scientific37528מאגר מכתים
Butorphanol TartrateMeiji005526הרדמה
C57BL/6NJclNippon Bio-Supp.CenterN/Aזן עכבר
ImarisBitplaneN/Aתוכנת ניתוח הדמיה
מיקרוסקופ זוםמאקרו OLYMPUSMVX10יחידת התצפית של המיקרוסקופ שנבנה בהתאמה אישית
Medetomidine HydrochlorideKyoritsu-Seiyaku008656הרדמה
מידזולםSANDOZ
27803229 שמן מינרליSigma-AldrichM8410שמן טבילה
N-buthyldiethanolamineTokyo Chemical IndustryB0725CUBIC-L, CUBIC-R+
NicotinamideTokyo תעשייה כימיתN0078CUBIC-R+
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100Nacalai Tesque12967-45CUBIC-L, PBST
שמן סיליקון HIVAC-F4Shin-Etsuשמן טבילה50449832
נתרן אזידWako195-11092מאגר מכתים
הרדמה כימי

מקורות

  1. Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
  2. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  3. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  4. Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
  5. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  6. Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
  7. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  8. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  9. Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
  10. Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
  11. Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  13. Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
  14. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  15. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  16. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
  17. Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CUBIC

מאמרים קשורים