כליות שלמות כתמים תלת מימדיים עם CUBIC

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטת ניקוי רקמות והכתמה אימונופלואורסצנטית שלמה להדמיית כליות תלת-ממדית (3D). טכניקה זו יכולה להציע פרספקטיבות מקרוסקופיות בפתולוגיה של הכליות, מה שמוביל לתגליות ביולוגיות חדשות.

תקציר

למרות שהפתולוגיה הקונבנציונלית סיפקה מידע רב על מיקרו-מבנה הכליות, היה קשה לדעת את המבנה המדויק של כלי דם, צינוריות פרוקסימליות, צינורות איסוף, גלומרולי ועצבים סימפתטיים בכליה בשל היעדר מידע תלת מימדי (3D). סליקה אופטית היא אסטרטגיה טובה להתגבר על המשוכה הגדולה הזו. ניתן לנתח תאים מרובים באיבר שלם ברזולוציה של תא בודד על ידי שילוב של ניקוי רקמות וטכניקת הדמיה תלת-ממדית. עם זאת, שיטות תיוג תאים להדמיית איברים שלמים עדיין אינן מפותחות. בפרט, צביעת איברים שלמים היא מאתגרת בגלל הקושי בחדירת נוגדנים. הפרוטוקול הנוכחי פיתח כתמי כליה של עכברים שלמים להדמיה תלת-ממדית בשיטת ניקוי הרקמות CUBIC (קוקטיילים ברורים ללא הפרעה להדמיית מוח/גוף ואנליזה חישובית). הפרוטוקול איפשר לדמיין ניתוק עצבים סימפתטי כלייתי לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה וגלומרולאומגהליה בשלב מוקדם של מחלת כליות סוכרתית מנקודת מבט מקיפה. לפיכך, טכניקה זו יכולה להוביל לתגליות חדשות בחקר הכליות על ידי מתן פרספקטיבה מקרוסקופית.

מבוא

הכליה מורכבת מאוכלוסיות תאים שונות. למרות שהפתולוגיה הקונבנציונלית נותנת לנו מידע רב על המיקרו-סביבה של הכליות, יש צורך בהדמיה תלת-ממדית (3D) כדי להבין במדויק את ההצלבה הבין-תאית במהלך התקדמות מחלת הכליות. בעבר, היה צורך לבצע מספר עצום של חתכים סדרתיים ושחזור תמונה עבור הדמיה תלת-ממדית של איבר שלם¹. עם זאת, שיטה זו דרשה מאמץ רב מדי והיו לה בעיות מבחינת יכולת השכפול.

סליקה אופטית היא אסטרטגיה טובה להתגבר על מכשול^{זה 2,3.} אטימות הרקמות נובעת בעיקר מפיזור וספיגת אור מכיוון שכל איבר מורכב מחומרים שונים, כולל מים, חלבון ושומנים. לפיכך, האסטרטגיה הבסיסית של ניקוי רק....

פרוטוקול

כל הניסויים אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת טוקיו. כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות. עכברי C57BL/6NJcl זכרים, בני 8 שבועות, שימשו למחקר הנוכחי. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).

1. הכנת בעלי חיים וקיבוע כליות

1. בצע קיבוע פרפוזיה לפי השלבים הבאים.
   1. הרדמת העכבר על ידי שאיפת איזופלורן (3%, 2.0 ליטר/דקה) ומתן תוך-צפקי של מדטומידין הידרוכלוריד (0.3 מ"ג/ק"ג), בוטורפנול טרטרט (5 מ"ג/ק"ג) ומידזולם (4 מ"ג/ק"ג) (ראו טבלת חומרים).
   2. יש ליטול את החיה עם 20 מ"ל של PBS (pH 7.4) ו-30 מ"ל של 4% PFA בחיץ פוספט (PB) דרך ....

תוצאות

באמצעות שיטת הכתמים הזו,^הודגמו עצבים סימפתטיים [נוגדן אנטי-טירוזין הידרוקסילאז (TH)] ועורקים [נוגדן אקטין נגד α שריר חלק (αSMA)] בכליה שלמה (איור 4A,B ווידאו 1). עצבים סימפתטיים כלייתיים חריגים הודגמו גם לאחר פגיעה באיסכמיה/רפרפוזיה (IRI)^9,10 (איור 4C). יתר על כן, הדמיה של עצבים סימפתטיים בכל הטחול¹³ הושגה באמצעות פרוטוקול .......

דיון

הפרוטוקול הנוכחי איפשר הדמיה תלת-ממדית של כליות שלמות של מבנים שונים כגון עצבים סימפתטיים, צינורות איסוף, עורקים, צינוריות פרוקסימליות וגלומרולי 9,10,11^. שיטת צביעה זו הציעה תצפית מקרוסקופית והובילה לתגליות ביולוגיות חדשות, על ידי הדמיה של השינוי בעצבים הסימפתטיים הכלייתיים לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה ^9,10 וגלומרולאומגהליה בשלב הראשוני של מחלת כליות סוכרתית ¹¹.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
14 מ"ל תחתית עגולה בהירות גבוהה PP מבחנה	פלקון	352059	ניקוי רקמות, צביעה, שטיפה
2,3-דימתיל-1-פניל-5-פיראזולון/אנטיפירין	טוקיו תעשייה כימית	D1876	CUBIC-R+
37%-תמיסת פורמלדהיד	נקלאי טסק	16223-55	לאחר קיבוע
4%-פרפורמלדהיד תמיסת חיץ פוספט	נקלאי טסק	09154-85	קיבוע כליות
קמח אלקסה 555 חמור מצומד נגד כבשים נוגדן IgG	Invitrogen	A-21436	נוגדן משני (1:100)
קמח אלקסה 647 חמור מצומד נגד ארנב נוגדן IgG	Invitrogen	A-31573	נוגדן משני (1:200)
נוגדן נגד אקוופורין 2 (AQP2) Abcam		ab199975	נוגדן ראשוני (1:100)
נוגדן נגד פודוצין	Sigma-Aldrich	P0372	נוגדן ראשוני (1:100)
נוגדן אנטי נתרן גלוקוז קוטרנספורטר 2 (SGLT2) נוגדן	Abcam	ab85626	נוגדן ראשוני (1:100)
נוגדן אנטי טירוזין הידרוקסילאז (TH)	Abcam	ab113	נוגדן ראשוני (1:100)
נוגדן אנטי &אלפא שריר חלק אקטין (α-SMA)	Abcam	ab5694	נוגדן ראשוני (1:200)
חוסם קזאין ב-PBS	Thermo Fisher Scientific	37528	מאגר מכתים
Butorphanol Tartrate	Meiji	005526	הרדמה
C57BL/6NJcl	Nippon Bio-Supp.Center	N/A	זן עכבר
Imaris	Bitplane	N/A	תוכנת ניתוח הדמיה
מיקרוסקופ זום	מאקרו OLYMPUS	MVX10	יחידת התצפית של המיקרוסקופ שנבנה בהתאמה אישית
Medetomidine Hydrochloride	Kyoritsu-Seiyaku	008656	הרדמה
מידזולם	SANDOZ
27803229 שמן מינרלי	Sigma-Aldrich	M8410	שמן טבילה
N-buthyldiethanolamine	Tokyo Chemical Industry	B0725	CUBIC-L, CUBIC-R+
Nicotinamide	Tokyo תעשייה כימית	N0078	CUBIC-R+
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45	CUBIC-L, PBST
שמן סיליקון HIVAC-F4	Shin-Etsu	שמן טבילה	50449832
נתרן אזיד	Wako	195-11092	מאגר מכתים

הרדמה כימי