הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקלה על תרבית אורגנואידית מוחית באמצעות תאורת אור רך לרוחב

2.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63989

⸱

6 ביוני 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Key Laboratory of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institutes, 3School of Biotechnology and Health Sciences, Wuyi University

במאמר זה

סיכום

אורגנואידים מוחיים מספקים הזדמנויות חסרות תקדים לחקר התפתחות איברים ופתולוגיה של מחלות אנושיות. למרות שהצלחה רבה הושגה עם מערכות תרבית אורגנואידיות מוחיות, עדיין ישנם קשיים תפעוליים ביישום טכנולוגיה זו. הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך אורגנואידי מוחי המאפשר שינוי בינוני והעברת אורגנואידים.

תקציר

נכון לעכשיו, טכנולוגיית תרבית אורגנואידית מוחית עדיין מסובכת לתפעול וקשה ליישום בקנה מידה גדול. יש צורך למצוא פתרון פשוט ומעשי. לכן, פרוטוקול אורגנואידים מוחי אפשרי יותר מוצע במחקר הנוכחי. כדי לפתור את אי הנוחות הבלתי נמנעת בשינוי בינוני והעברה אורגנואידית בשלב מוקדם, המחקר הנוכחי מייעל את טכנולוגיית הפעולה על ידי יישום העיקרון ההנדסי. מנורת אור רכה אומצה כדי להאיר לרוחב את דגימות הגוף העוברי (EB), מה שמאפשר לראות את ה-EBs בעין בלתי דרך אפקט ההשתקפות המפוזרת המשופרת. באמצעות העיקרון של זרימה משנית שנוצרת על ידי סיבוב, האורגנואידים מתאספים לכיוון מרכז הבאר, מה שמקל על פעולת השינוי הבינוני או העברת האורגנואידים. בהשוואה לתא המפוזר, הגוף העוברי מתיישב מהר יותר בפיפטה. באמצעות תופעה זו, ניתן להסיר ביעילות את רוב התאים החופשיים ואת שברי התאים המתים בצורה פשוטה, ולמנוע מ-EBs לגרום נזק מצנטריפוגה. מחקר זה מקל על הפעולה של תרבית אורגנואידים מוחית ומסייע לקדם את היישום של אורגנואידים במוח.

מבוא

בהשוואה למערכות תרביות דו-ממדיות (דו-ממדיות), למערכות תרביות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) יש מספר יתרונות, כולל שכפול אמיתי ושחזור יעיל של מבנים מורכבים של איברים מסוימים1. לכן, אורגנואידים מוחיים הם אחת משיטות העזר החשובות לתחומי המחקר של התפתחות המוח האנושי ומחלות2, בדיקת תרופות וטיפול בתאים.

גידול אורגנואידים מוחיים בשיטת ההשעיה המסתובבת תורם להתפתחותם ולהבשלתם3. למרות שמערכות תרביות אורגנואידיות מוחיות זכו להצלחה רבה, הן עדיין מתמודדות עם אתגרים קריטיים המגבילים את יישומן. לדוגמה, טיפוח ידני כרוך בשלבי מניפולציה מסובכים ומציג מכשולים להשגת יישומים בקנה מידה גדול. בנוסף, בכל שלב התפתחותי בתרבית האורגנואידים המוחיים, יש צורך בשינויים במדיה ובציטוקינים שונים4. עם זאת, בשלב המוקדם, האורגנואידים או ה- EBs הם בעלי גדלים זעירים (כ-200 מיקרומטר עד 300 מיקרומטר) והם כמעט בלתי נגישים מבחינה חזותית ללא מנגנון מתאים. באופן בלתי נמנע, כמות מסוימת של דגימות אורגנואידיות יקרות נשטפות כאשר המדיום משתנה. טכניקות רבות נחקרו כדי להתגבר על כך בסוגים אחרים של תרביות אורגנואידיות, וכמה דוגמאות כוללות טבילה של שבבי אורגנואידים שלמים במדיום תרבית למשך 3 ימים ללא התערבות5; הוספת מדיום טרי דרך הכיסוי לאחר שהמדיום הישן נספג באמצעות נייר סופג5; או החלת צינורות מיקרופלואידיים מורכבים להחלפת נוזלים 6,7,8. מכשול נוסף שנתקל בו בשלב המוקדם של גידול האורגנואידים הוא הקושי להשיג תצפיות ישירות בעין בלתי, מה שעלול לגרום לפעולות לקויות שמובילות לנזק ואובדן אורגנואידים במהלך שלבי העברת האורגנואידים. לכן, יש צורך להקים פרוטוקול ריאלי יותר המאפשר שינוי בינוני והעברת אורגנואידים כדי ליצור אורגנואידים.

פעולה מותאמת המתאימה המבוססת על עקרונות הנדסיים מוצעת כדי להתגבר על בעיות אלה, אשר באופן משמעותי ונוח מקל על הליכים אורגנואידים רבים. בטבע, כאשר השמש זורחת לתוך בית דרך מרווח חלון, העין הבלתי יכולה לראות את האבק רוקד בקרן האור. בשל ההשתקפות המפוזרת של אור השמש על האבק, חלק מהאור נשבר לתוך גלגל העין כדי לייצר תמונה חזותית. בהשראת העיקרון של תופעה זו 9,10, מחקר זה יצר מנורת אור רכה והאיר את ה- EBs לרוחב. נמצא כי EBs יכולים להיות ברורים מבחינה ויזואלית מבלי להשפיע על היקף הצפייה. זרימה משנית המצביעה על המרכז נוצרת בנוזל על ידי סיבוב צלחת התרבית עקב זרמי אדי11. EBs מפוזרים במקור מצטברים במרכז הצלחת. בהתבסס על זה, ועל התופעה כי מהירות השקיעה של אורגנואידים היא מהירה יותר מזו של תאים, מוצעת שיטת פעולה קלה של שינוי בינוני והעברה אורגנואידית ללא צנטריפוגה. האורגנואידים במדיום התרבית יכולים להיות מופרדים ביעילות מתאים חופשיים ושברי תאים מתים באמצעות פעולת העברה זו.

כאן, פרוטוקול קל לתפעול מוצע כדי ליצור אורגנואידים מוחיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. טכנולוגיית הפעולה עברה אופטימיזציה על ידי יישום העיקרון ההנדסי, מה שהופך את הפעולות בתרבות התלת-ממדית לפשוטות וישימות כמו אלה שבתרבות הדו-ממדית. שיטת החלפת הנוזלים המשופרת ופעולת העברת האורגנואידים מועילות גם לסוגים אחרים של תרבית אורגנואידים ולתכנון של מכונות תרבית אוטומטיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול נערך בעקבות הצהרת הלסינקי. האישור ניתן על ידי ועדת האתיקה של בית החולים המסונף השלישי של האוניברסיטה הרפואית של גואנגג'ואו (סקירה רפואית ואתית [2021] מס '022). לפני הניסוי, כל מדיום הוכן על פי הנוסחה12 של יורגן א. קנובליך (טבלאות משלימות 1-4), או שנעשה שימוש בערכת אורגנואידים מוחית זמינה מסחרית (ראו טבלת חומרים). ה-iPSCs ששימשו במחקר זה הוקמו בעבר על ידי המעבדה שלנו וקיבלו פטור מושכל. ה-SCA3-iPSCs נוצרו מנקבה בת 31 של נקבת אטקסיה ספינוקרבלרית מסוג אטקסיה מסוג 3 (SCA3) שעברה גנוטיפ של נקבה בעלת 26/78 חזרות CAG בגן ATXN313 (איור משלים 1A). ה-iPSCs האנושיים הרגילים שהוזכרו במאמר קודם נבחרו כ-NC-iPSCs14, והגן ATXN3 זוהה כבעל חזרות CAG של 14/14 (איור משלים 1B).

1. הכנת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs)

  1. לאסוף 3 מ"ל של דם היקפי על ידי venipuncture עם הסכמה מדעת של מתנדבים וחולים.
  2. לבודד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי על פי שיטת Ficoll-Paque15.
  3. קבעו iPSCs בהתאם לפרוטוקול של ערכת התכנות מחדש של סנדאי (ראו טבלת חומרים).
    1. תרבית את ה-iPSCs עם תווך mTeSR1 בצלחות פטרי 35 מ"מ המכוסות במטריגל (מטריצת קרום מרתף, ראו טבלת חומרים). לשנות את המדיום כל יום. צפיפות הצמיחה של iPSC לא תעלה על 75%.
    2. לעכל את התאים עם תמיסת דיסוציאציה של PSC (ראה טבלת חומרים) ולחלק אותם בתת-תרבות ביחס של 1:5 כל 3-5 ימים.
      אזהרה: וירוס סנדאי משמש כאן. יש להפעיל אותה בארון הבטיחות הביולוגית, ולנקוט באמצעי הגנה עצמית. זה צריך להיות ברור אם זה יכול לשמש באופן חוקי במדינה המקומית. יש להקפיד על החוקים והתקנות המקומיים בתחום הבטיחות הביולוגית בעת השימוש בהם.

2. הכנת EB (ימים 0-1)

  1. הסר את מדיום mTeSR1 מה- iPSCs עם פיפטה ושטף אותו 2x עם 1 מ"ל של 1x PBS.
  2. הסר את ה- PBS עם פיפטה, והוסף 300 μL של תמיסת ניתוק תאים (ראה טבלת חומרים) כדי לעכל את ה- iPSCs לתאים בודדים למשך 3-4 דקות ב- 37 ° C.
  3. בצעו החייאה של התאים ב-2 מ"ל של מדיום היווצרות EB (טבלה משלימה 1) ולאחר מכן עשו צנטריפוגה על הדגימה למשך 5 דקות ב-300 x גרם (טמפרטורת החדר).
  4. תכננו מראש את צלחת 24 הקידוחים המיוחדת עם תמיסת שטיפה נגד הדבקות (500 μL/well) למשך 5 דקות (ראו טבלת חומרים).
    הערה: תמיסת שטיפה נגד דבקות חיונית להיווצרות אופטימלית של EB וספרואידים.
  5. בצעו החייאה של התאים במדיום היווצרות EB המכיל Y-27632 (ריכוז סופי, 10 μM, ראו טבלת חומרים), עם צפיפות תאים של 1.5 x 106 תאים/מ"ל.
  6. הסירו את תמיסת השטיפה נגד הדבקות, ושטפו כל באר ב-2 מ"ל של מדיום ליצירת EB.
  7. הוסיפו את התאים ללוחות המיוחדים של 24 בארות בצפיפות של 3 x 106 תאים/באר (איור 1A, משמאל).
    הערה: בדרך כלל, ניתן להכין 300 EBs בכל באר. שיטה זו יכולה להכין כמויות גדולות של EBs באותו גודל.
  8. צנטריפוגה הצלחת ב 100 x g במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. פזרו באופן אחיד את התאים בכל תא בתחתית הצלחת (איור 1A, מימין).
    הערה: אם אין צנטריפוגה מתאימה, ניתן גם למקם את הצלחת ישירות לתוך האינקובטור לתרבית סטטית, אך זמן ההיווצרות של כדור ה- EB יהיה מספר שעות מאוחר יותר מזה תחת צנטריפוגה רגילה.
  9. דגירה של הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 24 שעות. אם צנטריפוגה לא שימשה בשלב הקודם, דגירה במשך 36 שעות. שמור על המדגם יציב, ואל תוציא אותו מהאינקובטור בתקופה זו.

3. הכנת מנורת האור הרכה (יום 1)

  1. יש להשתמש בלוח אקריליק שקוף בעובי של 0.3-0.5 ס"מ בגודל של נייר A5. הדבק רפידות לבנות בחלק הקדמי והאחורי של הצלחת האקרילית.
    1. התקינו שורה של נורות LED לבנות על קצה הצלחת, כך שהפנסים יוכלו להיכנס מהצד של הלוחית האקרילית ואז לירות החוצה במקביל (איור משלים 2A-F, איור 1B).
      הערה: מכיוון שקטריהם של EBs בשלב המוקדם הם כ-200 מיקרומטר עד 300 מיקרומטר, קשה לצפות בהם בבירור בעין בלתי מתחת למנורה הפלואורסצנטית של ספסלים נקיים. לעומת זאת, הודות לשיפור ההשתקפות המפוזרת, אנו יכולים לזהות את ה-EBs בבירור על-ידי שימוש באור רך המואר לרוחב (איור 1B, C). צלחת של 6 בארות מומלצת לתרביות EB בניסויים הבאים. עם זאת, כדי להראות טוב יותר את האפקט החזותי של אור רך, כלים משמשים לעתים לצילום תמונות וסרטונים במחקר זה במקום צלחות, אז אנא אל תבינו לא נכון. מנורת התאורה הרכה המוארת לרוחב יכולה לשמש גם לצלחת בעלת 6 הבארות.

4. העברת EB והחלפה בינונית (ימים 2-5)

  1. הכינו צלחת הידבקות נמוכה חדשה בת 6 בארות, והוסיפו 2 מ"ל של מדיום היווצרות EB לכל באר.
  2. הסר את ה- EBs יחד עם המדיום עם קצה פיפטה רחב של 1000 μL (ראה טבלת חומרים) והעביר אותם ללוחית הידבקות נמוכה של 6 בארות (כ-100 EBs/well).
    הערה: תהליך הפעולה מאמץ מנורת אור רכה (המוזכרת בשלב 3.) כדי להפוך את ה- EBs לקלים יותר לצפייה. כבה מקורות אור פנימיים אחרים כדי לשפר את האפקט החזותי של האור הרך.
  3. החלף באותו נפח של מדיום טרי ליצירת EB בכל יום. השתמש בזרימה המשנית כדי לאסוף את ה- EBs למרכז ולשנות את המדיום.
    1. שאפו את המדיום הישן על ידי צנרת לקצה הבאר באיטיות. אל תמצוץ חזק מדי; אחרת, ה- EBs יוסרו יחד. לאחר מכן, הוסיפו מדיום רענן להחייאת ה-EBs.
      הערה: הזרימה המשנית העיקרית (איור 1D). לגרום לזרימת מערבולת על ידי סיבוב המנה לאורך מסלול מעגלי. בשל זרימת המערבולת, זרימה משנית מושרית המופנית לכיוון המרכז. ה- EBs או האורגנואידים מתכנסים למרכז הבאר בשל הזרימה המשנית הנוצרת באמצעות סיבוב, ולאחר מכן ניתן לבצע שינוי בינוני או העברה עוברית בקלות.

5. בדיקת פלוריפוטנטיות על ידי תיוג עם סמן פלוריפוטנטיות OCT4 (יום 4)

הערה: כאשר הקוטר של ה- EBs גדול מ- 300 מיקרומטר, קח מספר EBs עבור צביעת סמן OCT4 immunofluorescence כדי לזהות את הפלוריפוטנטיות שלהם.

  1. תקן את ה- EBs ב- 4% paraformaldehyde ב- 4 ° C למשך 30 דקות, ולאחר מכן שטיפה ב 1x PBS 3x במשך 10 דקות בכל פעם.
  2. העבר את ה- EBs ל- PBS בטמפרטורת החדר המכיל 0.3% Triton X-100 ו- 3% BSA למשך 2 שעות, ולאחר מכן שטיפה ב- PBS 3x למשך 10 דקות בכל פעם.
    הערה: לאחר טיפול ב-Triton X-100, ה- EBs צפים על פני השטח הנוזליים וניתן לשאוב אותם בקלות עם הנוזל במהלך הניקוי. מומלץ לפעול תחת סטריאומיקרוסקופ.
  3. דיללו את הנוגדן הראשוני OCT4 (ראו טבלת חומרים) עם 1 מ"ל של 1x PBS המכיל 1% BSA ביחס של 1:200 והוסיפו ל-EBs לדגירה ב-4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה, ואז שטפו ב-PBS 3x למשך 10 דקות בכל פעם.
  4. דיללו את הנוגדן המשני המתאים (ראו טבלת חומרים) עם 1x PBS בשעה 1:500 והוסיפו 1 מ"ל ל-EBs.
  5. לאחר דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות, לשטוף את התאים ב 1x PBS 3x במשך 10 דקות בכל פעם.
  6. הסר את ה- PBS, הוסף 2 מ"ל של תמיסת PBS 1x המכילה 1 מיקרוגרם / מ"ל DAPI, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף ב- PBS 3x למשך 10 דקות בכל פעם.
  7. הזיזו את ה-EB המכיל כמות קטנה של נוזל על המגלשה, אטמו את המגלשה בזכוכית כיסוי המצופה בג'לי נפט זמין מסחרית (ראו טבלת חומרים) בקצה, ולאחר מכן צפו ואספו את התמונה תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי הקונפוקלי.
    הערה: ביטוי OCT4 מייצג EB pluripotency12. כאשר הביטוי של OCT4 הוא פחות מ -90%, יש להשליך את ה- EBs, ויש להכין את ה- EBs שוב.

6. אינדוקציה עצבית (ימים 5-7)

  1. הכינו צלחת חדשה בת 6 בארות עם הידבקות נמוכה, והוסיפו 3 מ"ל של מדיום אינדוקציה עצבי (טבלה משלימה 2) לכל באר.
  2. הפעילו את האור הרך לרוחב (המוזכר בשלב 3)וכבו מקורות אור פנימיים אחרים.
  3. העבר את ה- EBs ללוח 6 הבארות עם תוספת של מדיום אינדוקציה עצבית (~ 100 EBs / באר). הוסף כמה שפחות מהמדיום המקורי לבאר החדשה.
    הערה: הצג מיומנויות פשוטות של העברת אורגניזם. באופן טבעי, תחת כוח הכבידה ועם צפיפות גבוהה יחסית מהתווך, ה-EBs המחודשים ישקעו בהדרגה על ידי יישום הפעולה המוצגת באיור 1E. לפיכך, ניתן להעביר את ה- EBs בנוחות. מאחר שבהשוואה ל-EBs, תאים חופשיים ושברי תאים מתים שוקעים לאט יותר, ניתן להסיר את רוב התאים החופשיים ואת שברי התאים המתים באמצעות שיטת שקיעה זו (איור 1F).
  4. דגירה של הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 24 שעות.
    הערה: תחת המיקרוסקופ, הקוטר של ה- EBs היה בערך 500 מיקרומטר, והקצה היה שקוף, מה שמעיד על כך שנוצרה שכבה נוירואפיתליאלית.
  5. המשך לשלב הבא.

7. הטמעה במטריצת קרום המרתף (ימים 7-10)

  1. מקם את מטריצת הממברנה במקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות מראש כדי להתמוסס. חשב את כמות המטריצה הנדרשת מראש. כ-100 EBs הוטמעו ב-1.5 מ"ל של מטריצת הממברנה.
  2. הדליקו את האור הרך לרוחב וכבו את מקור האור בחלק העליון של הקונסולה.
  3. שמור את מטריצת הממברנה על קרח כדי למנוע התמצקות.
  4. מעבירים כמות קטנה של EBs למנה של 60 מ"מ המכילה מדיום הרחבה טרי (טבלה משלימה 3) בכל פעם. הקטן את מספר ה- EBs כדי להקל על הסרת EB יחיד.
  5. לאחר מכן, השתמש בצלחת הידבקות נמוכה חדשה של 6 בארות. מוצצים EB יחיד (המכיל כ-10 μL בינוני) עם קצה פיפטה רחב של 200 μL (ראו טבלת חומרים) בכל פעם, ולאחר מכן מוסיפים אותו לתחתית הצלחת בעלת 6 הבארות כדי ליצור טיפות. השתמש בחמש טיפות לכל באר.
    הערה: המפתח הוא להתאים את הטווח של אקדח הפיפטה ל-50 μL ולמצוץ EB, ולאחר מכן להתייחס לפעולה של איור 1E. כאשר ה-EB מתיישב לבור של קצה הפיפטה, הקצה נוגע במהירות בתחתית הבאר של הצלחת ודוחף החוצה כ-10 מיקרול של נוזל כדי ליצור טיפה.
  6. הוסף 15 μL של מטריצת הממברנה לכל טיפה המכילה EB וערבב אותה במהירות. הטמיעו את כדור ה-EB במרכז הטיפה.
    הערה: אסור לשאוף ל-EBs עם קצה פיפטה סטנדרטי, מה שפוגע ב-EB. יש להשתמש במקום זאת בקצה הפיפטה בעל הקידוח הרחב של 200 μL.
  7. ממקמים את צלחת 6 הקידוחים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, וממצקים את טיפות מטריצת הממברנה המכילות EBs.
  8. הוסף 3 מ"ל של מדיום ההרחבה לכל באר ופוצץ בעדינות את ה- EBs המוטבעים במטריצה כדי להשעות אותם.
  9. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 3 ימים.
    הערה: אם נצפה ניצנים על פני השטח של EB, זה אומר שנוצר נוירו-פיתליום מורחב16.

8. התבגרות אורגנואידית (ימים 10-40)

  1. הסר בעדינות את המדיום המקורי, והוסף 3 מ"ל של מדיום הבשלה (טבלה משלימה 4) לכל באר.
  2. הניחו את הצלחת האורגנואידית על שייקר אופקי באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
  3. המשך לסובב את התרבות אופקית. הגדר את השייקר למהירות המתאימה.
    הערה: בעת גידול אורגנואידים מוחיים על צלחת של 6 בארות, כוח צנטריפוגלי יחסי (RCF) של 0.11808 x g מתאים יותר, על פי היצרן של השייקר האופקי (ראה טבלת חומרים). על פי ההמרה בין הכוח הצנטריפוגלי היחסי למהירות הסיבוב17,18, RCF = 1.118 x 10−5 × R × סל"ד2, כאשר RCF = כוח צנטריפוגלי יחסי (g), סל"ד = סיבובים לדקה (r/min), ו- R = רדיוס סיבוב (cm), הידוע גם בשם זריקת טלטולים. הפרמטרים של זריקת הרעידות של שייקרים שונים עשויים להיות שונים. לכן, ניתן להעריך כי מהירות הסיבוב היא סל"ד = 299 x (RCF / R) 1/2.
  4. שנה את מדיום ההתבגרות הטרי כל 2-3 ימים.
  5. לאחר 20-30 יום, בהדרגה תרבית את האורגנואידים המוחיים לבגרות.
    הערה: במהלך תקופה זו, ניתן להשתמש באורגנואידים לניסויים וזיהוי, כגון זיהוי סמנים עצביים וריצוף תעתיק 19,20,21.

9. מקטעים קפואים ואימונופלואורסצנציה של אורגנואידים מוחיים

  1. תקן את האורגנואידים ב 4% paraformaldehyde ב 4 ° C במשך 16 שעות ולאחר מכן לשטוף אותם 3x עם 1x PBS במשך 10 דקות בכל פעם.
  2. הסר את ה- PBS, וטבול את האורגנואידים ב 30% סוכרוז ב 4 ° C לילה.
  3. הטמיעו את האורגנואידים ב-10%/7.5% ג'לטין/סוכרוז ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת ולאחר מכן העבירו אותם במהירות לתבנית ההטבעה.
  4. הוסיפו קרח יבש ל-100% אתנול כדי להכין קרח יבש/אתנול, והניחו בו את הדגימות האורגנואידיות להקפאה מהירה.
  5. אחסן את הדגימות הקפואות במקפיא של −80 מעלות צלזיוס. בעת הצורך, לעשות חלקים קפואים בעובי של 20 מיקרומטר.
  6. עיין בשלבים 5.3.-5.5. עבור אימונופלואורסצנציה. השתמש בנוגדן PAX6 כדי לסמן תאי אב אפיקליים, בנוגדן TUJ1 (ראה טבלת חומרים) כדי לתייג תאים עצביים 22,23,24, וב-DAPI עבור צביעת DNA גרעינית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

המחקר הנוכחי גרם ל-iPSCs (איור 2B) לתוך אורגנואידים מוחיים (איור 2C). ה-EBs שטופחו בשלב המוקדם ביטאו את סמן OCT4 (איור 2A), שהצביע על פלוריפוטנטיות טובה. בשלב מאוחר יותר, ה-EBs התפתחו לאורגנואידים מוחיים בוגרים (איור 2D). המחקר טיפח iPSCs מאנשים בריאים רגילים ומחולי SCA3 לאורגנואידים מוחיים (איור 3A). SCA3, הידועה גם בשם מחלת מצ'אדו-ג'וזף (MJD), היא הפרעה נוירודגנרטיבית הנג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אורגנואידים מוחיים פותחים אפיקים חדשים למחקר רפואי. יישומים שימושיים רבים של טכנולוגיה זו מתחילים להיחקר רק28. מחקר זה מצא כי תוצאות ריצוף השעתוק של אורגנואידים מוחיים חולים גנטית ואורגנואידים מוחיים רגילים יכולות לשקף את ההבדלים בין מחלה לבריאות. לדוגמה, תוצאות ניתוח הנתונים של RNA-seq (איור 3B) עולות בקנה אחד עם מחקרים רבים שדווחו על מחלות SCA3 29,30,31,32.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (מענק מס ' 2020A0505100062), פרויקט נושאי מפתח למדע וטכנולוגיה של העיר גואנגג'ואו (מענק מס '201904020025), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס '31872800, 32070582, 82101937), ופרויקט מענק המחקר הפוסט-דוקטורט של העיר גואנגג'ואו (לבנגז'ו צ'ן).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.2 μ m מסנןNEST ביוטכנולוגיה, סין331001
1000 μ קצה פיפטה רחב נשא LThermo Fisher Scientific, ארה"ב9405163
200 μ L קצה פיפטה רחב נשאתרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב9405020
2-MercaptoethanolMerck, גרמניה8057400005
4% ParaformaldehydeServicebio, סיןG1101
צלחת הידבקות נמוכה 6 בארותNEST ביוטכנולוגיה, סין703011הוא משמש לתרביות השעיה EBs
תמיסת ניתוק תאים AaccuteSTEMCELL טכנולוגיות, קנדה07920הוא משמש לעיכול iPSC לתאים בודדים.
AggreWell800 24 בארותSTEMCELL Technologies, קנדה34811צלחת תרבית מיקרופורית להכנת EBs.
פתרון שטיפה נגד היצמדותSTEMCELL Technologies, קנדה07010פתרון שטיפה לכלי תרבית למניעת הידבקות תאים
B27-vit. תוסףתרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב12587010
bFGFPeprotech, ארה"בGMP100-18B
BSABeyotime Biotechnology, סיןST025
צנטריפוגהאפנדורף, גרמניה5810 Rניתן להשתמש בו לצנטריפוגה של סוגים שונים של צינורות צנטריפוגה, בקבוקי ריאגנטים וצלחות עבודה.
כיסוי זכוכיתShitai ציוד מעבדה, סין10212020C
DAPIBeyotime Biotechnology, סיןC1002משמש לצביעה גרעינית. לאחר שילוב DAPI עם DNA דו-גדילי, אורך גל העירור המרבי היה 364 ננומטר ואורך גל הפליטה המרבי היה 454 ננומטר.
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific, ארה"ב11330032
איכות ESFBS Thermo Fisher Scientific, ארה"ב10270106
חברת Ficoll PaqueGeneral Electric, ארה"ב17-5442-02לבודד את התאים החד-גרעיניים בדם ההיקפיים לפי שיטת Ficoll-Paque.
ג'לטיןסנגון ביוטיאק, סיןA609764
תוסף גלוטמקסתרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב35050061
תוסף גלוטמקסתרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב17504044
עיזים נגד עוף IgY  נוגדן משניAbcam, בריטניהab150171עיזים נגד עוף IgG. צימוד: אלכסה פלואור 647. לדוגמה: 652 ננומטר, Em: 668 ננומטר. יש להשתמש בדילול של 1:500.
עז נגד עכבר IgG נוגדן משניAbcam, בריטניהab150120עז נגד עכבר IgG. צימוד: אלכסה פלואור 594. לדוגמה: 590 ננומטר, Em: 617 ננומטר. יש להשתמש בדילול של 1:500.
עז נגד ארנב IgG נוגדן משניAbcam, בריטניהab150077עז נגד ארנב IgG. צימוד: אלכסה פלואור 488. לדוגמה: 495 ננומטר, אם: 519 ננומטר. יש להשתמש בדילול של 1:500.
HeparinMerck, גרמניהH3149
שייקר אופקיServicebio, סיןDS-H200כוח צנטריפוגלי יחסי (RCF) של 0.11808 x g מתאים יותר, על פי היצרן INFORS HT (שוויץ).
אינסוליןMerck, גרמניהI9278-5ML
KOSRThermo Fisher Scientific, ארה"ב10828028
MatrigelCorning, ארה"354277Matrigel יתמצק בסביבה גבוהה מ-4 מעלות; C, ולכן יש לארוז אותו בטמפרטורה נמוכה.
MEM-NEAAThermo Fisher Scientific, ארה"ב11140050
mTeSR1STEMCELL Technologies, קנדה85850iPSC תרבית
מדיום N2 תוסף תרמופישר סיינטיפיק, ארה"ב17502048
NeurobasalThermo Fisher Scientific, ארה"ב21103049
OCT4 נוגדן ראשוניAbcam, בריטניהab19857מנחה: ארנב. יש להמיס עם 500 μ L PBS. יש להשתמש בדילול של 1:200.
פורס קפוא פתולוגיLeica, גרמניהLeica CM1860
PAX6 נוגדן ראשוניAbcam, בריטניהab78545מארח: עכבר. יש להשתמש בדילול של 1:100.
PBSSTEMCELL Technologies, קנדה37350
פניצילין-סטרפטומיציןתרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב15140122
פתרון דיסוציאציה PSCבייג'ינג סייביי ביוטכנולוגיה, סיןCA3001500ניתן להשתמש בתמיסת דיסוציאציה ללא אנזימים לעיכול ומעבר iPSC.
ערכת תכנות מחדש של סנדאיThermo Fisher Scientific, ארה"בA16518הקמת iPSC על פי הפרוטוקול של ערכת התכנות מחדש של סנדאי.
Shitai זכוכית שקופיות, סין188105W
מנורת אור רכהNUT NUTמכשיר פשוט מתוצרת עצמית, עיין באיור משלים 2 להכנה.
ערכת אורגנואיד מוחי STEMdiff STEMCELLTechnologies, קנדה8570מכילה: 1. מדיום היווצרות EB; 2. מדיום אינדוקציה; 3. מדיום הרחבה; 4. מדיום התבגרות.
ערכת התבגרות אורגנואיד מוחי STEMdiffSTEMCELL Technologies, קנדה8571התבגרות בינונית
סוכרוזSangon Bioteach, סיןA502792
Triton X-100Merck, גרמניהX100
TUJ1 נוגדן ראשוניAbcam, UKab41489מארח: עוף. יש להשתמש בדילול של 1:1000.
וזליןסנגון ביוטיץ', סיןA510146
Y-27632STEMCELL Technologies, קנדה72302הכן תמיסת מלאי של 5 מ"מ ב-PBS, השהה 1 מ"ג ב-624 ומיקרו; L של PBS.
Weblink
Raw נתוני ריצוףארכיון רצף גנום (גנומיקה, פרוטאומיקה & ביואינפורמטיקה 2021) במרכז הנתונים הלאומי לגנומיקה (חומצות גרעין Res 2022), המרכז הלאומי של סין למידע ביולוגי / המכון לגנומיקה של בייג'ינג, האקדמיה הסינית למדעיםGSA-אנושי: HRA002430https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/
ב ציוד מעבדה

מקורות

  1. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
  2. Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  5. Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581(2021).
  6. Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
  7. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
  8. Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876(2018).
  9. Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268(2021).
  10. Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
  11. Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827(2020).
  12. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  13. Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
  14. Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288(2020).
  15. Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Chapter 7, Unit 7.1 (2001).
  16. Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549(2018).
  17. Rieder, H. L., Smithwick, R. W. RPM or RCF. The American Review of Respiratory Disease. 132 (6), 1371(1985).
  18. Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
  19. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  20. Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
  21. Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
  22. Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  23. Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
  24. Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763(2021).
  25. Costa, M., Paulson, H. L. Toward understanding Machado-Joseph disease. Progress in Neurobiology. 97 (2), 239-257 (2012).
  26. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
  27. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550(2014).
  28. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  29. Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
  30. Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
  31. Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, Pt 11 3221-3237 (2015).
  32. Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
  33. Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985(2021).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Camp, J. G., Treutlein, B. Human development: Advances in mini-brain technology. Nature. 545 (7652), 39-40 (2017).
  36. Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
  37. Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
  38. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  39. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

יצירת גופי עוברהעברת אורגנואידיםהחלפת מצעהשראה עצביתמטריקס של קרום הבסיססמני פלוריפוטנטיותהבשלת אורגנואידיםזרימה משנית
הקלה על תרבית אורגנואידית מוחית באמצעות תאורת אור רך לרוחב
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.