מאמר שיטה

בידוד וניתוח של שלפוחיות חוץ-תאיות ניתנות למעקב ומתפקדות מהפלזמה והרקמות המוצקות

DOI:

10.3791/63990

⸱

17 באוקטובר 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of VIP Dental Care, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 4School of Basic Medicine, The Fourth Military Medical University, 5College of Life Science, Northwest University, 6Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לחילוץ שלפוחיות חוץ-תאיות מהדם ההיקפי ומרקמות מוצקות עם פרופיל עוקב של אנטיגנים על פני השטח ומטעני חלבונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) במחזור הדם ושוכנות רקמות מייצגות מטרות מבטיחות כסמנים ביולוגיים תרנוסטיים חדשים, והן מתגלות כשחקנים חשובים בשמירה על הומאוסטזיס אורגניזם והתקדמות של קשת רחבה של מחלות. בעוד המחקר הנוכחי מתמקד באפיון של אקסוזומים אנדוגניים עם מקור אנדוזומלי, microvesicles blebbing מן קרום פלזמה זכו לתשומת לב גוברת בבריאות וחולי, אשר מתאפיינים על ידי שפע של מולקולות פני השטח לשחזר את חתימת הממברנה של תאי הורה. כאן מוצג הליך הניתן לשחזור המבוסס על צנטריפוגה דיפרנציאלית לחילוץ ואפיון כלי רכב חשמליים מהפלזמה ומרקמות מוצקות, כגון העצם. הפרוטוקול מתאר גם פרופיל עוקב של אנטיגנים על פני השטח ומטעני חלבונים של כלי רכב חשמליים, אשר ניתן לעקוב אחר נגזרותיהם ומזוהים עם רכיבים הקשורים לתפקוד פוטנציאלי. שיטה זו תהיה שימושית לניתוח קורלטיבי, פונקציונלי ומכניסטי של כלי רכב חשמליים במחקרים ביולוגיים, פיזיולוגיים ופתולוגיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הוצעו כדי להגדיר מבנים חוץ-תאיים מוקפים דו-שכבתיים של שומנים בתאים1, הממלאים תפקידים חשובים באירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים2. ניתן לחלק באופן כללי כלי רכב חשמליים המשוחררים על ידי תאים בריאים לשתי קטגוריות עיקריות: אקסוזומים (או כלי רכב חשמליים קטנים) הנוצרים באמצעות מסלול סחר אנדוציטי תוך-תאי3 ומיקרו-שלפוחיות (או EV גדולות) המתפתחות על ידי הניצנים החיצוניים של קרום הפלזמה של תא4. בעוד שמחקרים רבים מתמקדים בתפקוד של כלי רכב חשמליים שנאספו מתאים בתרבית במבחנה5, כלי רכב חשמליים שמקורם במחזור הדם או ברקמות מורכבים והטרוגניים יותר, שיש להם יתרון בכך שהם משקפים את המצב האמיתי של האורגניזם in vivo6. יתר על כן, כמעט כל סוגי הרקמות יכולים לייצר EVs in vivo , ורכבים חשמליים אלה יכולים לפעול כשליחים בתוך הרקמה או להיות מועברים על ידי נוזלי גוף שונים, במיוחד הדם ההיקפי, כדי להקל על תקשורת מערכתית7. כלי רכב חשמליים במחזור הדם וברקמות הם גם מטרות לאבחון מחלות ולטיפול בהן8.

בעוד האקסוזומים נחקרו באופן אינטנסיבי בשנים האחרונות, למיקרו-שלפוחיות יש גם תפקידים ביולוגיים חשובים, אותם ניתן לחלץ בקלות ללא אולטרה-צנטריפוגה, ובכך לקדם מחקר בסיסי וקליני9. יש לציין כי סוגיה קריטית בנוגע לרכבים חשמליים המבודדים ממחזור הדם ומהרקמות היא שהם נגזרים מסוגי תאים שונים10. מאחר שמיקרו-שלפוחיות מובלות מממברנת הפלזמה ומוצגות על ידי שפע של מולקולות פני התא9, שימוש בסמנים של קרום תא האב כדי לזהות את המקור התאי של כלי רכב חשמליים אלה הוא אפשרי. באופן ספציפי, ניתן ליישם את טכניקת ציטומטריית הזרימה (FC) כדי לזהות סמני ממברנה. יתר על כן, החוקרים יכולים לבודד את כלי הרכב החשמליים ולבצע ניתוחים נוספים המבוססים על המטענים הפונקציונליים.

הפרוטוקול הנוכחי מספק הליך יסודי לחילוץ ואפיון כלי רכב חשמליים מדגימות in vivo. כלי הרכב החשמליים מבודדים באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית, ואפיון כלי הרכב החשמליים כולל זיהוי מורפולוגי באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM), ניתוח מקור באמצעות FC וניתוח מטעני חלבונים באמצעות כתם מערבי. פלסמת הדם והעצם המקסימלית של עכברים משמשים כנציגים. חוקרים יכולים להתייחס לפרוטוקול זה עבור כלי רכב חשמליים ממקורות אחרים ולבצע שינויים מתאימים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית הצבאית הרביעית והנחיות ARRIVE. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי C57Bl/6 בני 8 שבועות (ללא העדפה לנקבות או לזכרים). השלבים הכרוכים בבידוד פלזמה ורקמות חשמליות מודגמות באיור 1. הפלזמה נלקחת כנציג כדי לתאר את הליך בידוד EV מנוזלי הגוף. העצם המקסילרית נלקחת כנציג כדי להסביר את הליך בידוד EV מהרקמות המוצקות.

1. הכנת הפלזמה ודגימות העצם המקסילריות

  1. הכינו את דגימות הפלזמה לפי השלבים הבאים.
    1. קבע את משקל הגוף של העכבר באמצעות איזון מעבדה סטנדרטי.
    2. מוסיפים 20 μL, 2 מ"ג/מ"ל הפרין לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ומשתמשים במכשיר המיקסר (ראו טבלת חומרים) כדי לאפשר להפרין להיצמד לדופן הצינור.
      הערה: צינורות נוגדי קרישה יכולים לשמש גם ישירות כדי לאסוף את הדם.
    3. להרדים את העכבר על ידי הזרקה intraperitoneal של 50 מ"ג / ק"ג של נתרן pentobarbital (ראה טבלה של חומרים). תפוס את צוואר העכבר עם האגודל והאצבע, ולאחר מכן תקן את הזנב ואת הרגל האחורית השמאלית עם האצבע הקטנה והזריק את נתרן pentobarbital עם מזרק הזרקת 1 מ"ל לאחר חשיפת הבטן.
    4. ודא כי העכבר מורדם כראוי בהתבסס על היעדר רפלקס הקרנית ותגובת הגפיים כאשר כרית כף הרגל צובטת.
    5. לגלח את השיער על הפנים ואת הריסים של העיניים עם מספריים מעוקלים.
    6. תפוס את עור הצוואר של העכבר ולחץ את העור סביב העיניים לחלק האחורי של הצוואר כך גלגל העין בולט. השתמש פינצטה אופתלמית במהירות להדק את גלגל העין, ולאסוף את זרימת הדם עם צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל מוכן בשלב 1.1.2. להקריב את העכבר על ידי נקע החוליה הצווארית.
      זהירות: היזהר עם השערות והריסים כי הם עלולים לגרום להמוליזה.
    7. הפוך בעדינות את הצינור מספר פעמים כדי למנוע קרישת דם.
      אזהרה: הפוך את הצינור בהקדם האפשרי.
    8. צנטריפוגה את דגימת הדם במשך 15 דקות ב 1,200 x גרם ב 4 ° C.
    9. העבירו בזהירות את הסופרנאטנט לצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל חדשים ונקיים, והשתמשו מיד בדגימת הפלזמה או אחסנו אותה בטמפרטורה של 4°C למשך מספר שעות.
    10. לדלל את supernatant עם נפח שווה של 1x פוספט-buffered מלוחים (PBS) ולערבב היטב.
      הערה: הפרוטוקול שסופק לעיל לאיסוף הפלזמה הוא קטלני. הדם יכול להיאסף גם דרך ניקוב ורידים subclavian11 מבלי להקריב את העכבר.
  2. הכינו את דגימות העצם המקסילריות לפי השלבים הבאים.
    1. בודדו את העצם המקסימלית עם פינצטה ומספריים ושטפו אותם עם PBS כדי להיפטר מרקמות רכות עם פינצטה.
    2. שים את העצם המקסילרית לתוך צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל לחתוך את העצם לחתיכות קטנות (גודל חייב להיות פחות מ 1 מ"מ קוטר) עם מספריים. הוסף כמות מסוימת של ליבראז (5 מיקרוגרם / מ"ל, ראה טבלת חומרים) כדי לכסות את הרקמה (בדרך כלל 1 מ"ל עבור דגימות עצם מעכבר בן 8 שבועות), ולאחר מכן לדגור במשך 30 דקות ב 37 ° C.
    3. צנטריפוגה את הדגימה ב 800 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
    4. מעבירים בזהירות את הסופרנאטנט עם פיפטה לצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל חדשים ונקיים.

2. חילוץ כלי רכב חשמליים

  1. צנטריפוגות הדגימות (שהוכנו בשלב 1.1.10 ושלב 1.2.4) למשך 15 דקות במהירות של 2,500 x גרם (4 מעלות צלזיוס) כדי להסיר פסולת תאים גדולים וטסיות דם שנותרו.
  2. העבירו בזהירות את הסופרנאטנטים לצינורות צנטריפוגות וצנטריפוגות 1.5 מ"ל חדשים ונקיים למשך 30 דקות במהירות של 16,800 x גרם (4°C).
    הערה: ניתן להגדיר את מהירות הצנטריפוגה ליותר מ-10,000 x גרם כדי לחלץ כלי רכב חשמליים12. ככל שמהירות הצנטריפוגה גבוהה יותר, כך ניתן להשיג כמות גדולה יותר של כלי רכב חשמליים. מכיוון שהמהירות המותרת של הצנטריפוגה בה השתמשנו היא 16,800 x גרם (ראה טבלת חומרים), בחרנו במהירות זו בפרוטוקול זה.
  3. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הכדוריות בכל צינור עם 1 מ"ל PBS. צנטריפוגה למשך 30 דקות במהירות של 16,800 x גרם (4°C).
  4. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הכדוריות בכל צינור עם 50 מיקרוליטר של PBS. אחסנו דגימות אלה בטמפרטורה של 4°C למשך פחות מ-24 שעות בלבד, או עדיף להשתמש בהן מיד לניתוחים הבאים (שלבים 3-5).
    זהירות: אחסון בטמפרטורה של -80°C אינו מקובל, מכיוון שהדבר יפחית את ריכוז כלי הרכב החשמליים ויגדיל את גודל החלקיקים של כלי רכב חשמליים13, ובכך ישפיע על הניתוח הבא של כלי רכב חשמליים.

3. זיהוי מורפולוגי של כלי רכב חשמליים

  1. ביצוע ניתוח נת"ע.
    1. על פי כמות EVs (נשפט בערך על ידי גודל של כדורים, החלקיקים של פלזמה 50 μL הם המינימום), להעביר 5-50 μL של השעיה (שלב 2.4), לדלל 10 מ"ל של פתרון חיץ (PBS מסונן עם מסנן 0.22 מיקרומטר), ולערבב עם 1 מ"ל מיקרו פיפטור קצוות מספיק. השתמש בתרחיף סופי זה למדידת חלקיקים.
    2. השתמש מזרק סטרילי 1 מ"ל כדי להזריק לפחות 5 מ"ל של מים מזוקקים במהירות מתונה וקבועה עד שמספר החלקיקים המוצגים בממשק הזיהוי קטן מחמישה.
      הערה: לאחר הזרקת 1 מ"ל מים מזוקקים דרך כל התעלה, מספר החלקיקים מוצג ישירות בממשק האיתור. אם המספר עדיין מעל חמישה, המשיכו להזריק 1 מ"ל מים מזוקקים עד לעמידה בקריטריונים.
    3. צור מחדש 1 μL של תמיסת כיול ב 1 מ"ל של מים מזוקקים כדי ליצור תמיסה ראשונית, ולאחר מכן לקחת 100 μL של התמיסה הראשונית ל 25 מ"ל של מים מזוקקים כדי להכין פתרון מלאי סטנדרטי (1:250,000). אחסן מגיב עובד זה ב 4 °C למשך שבוע אחד.
    4. כיול מכשיר נת"ע עם פתרון המלאי הסטנדרטי (שלב 3.1.3). הזריקו 1-5 מ"ל של תמיסת כיול העבודה עם מזרק סטרילי של 1 מ"ל כדי לשטוף את תעלת המכונה עד שמספר החלקיקים המוצגים בממשק הגילוי הוא בין 50-400 (רצוי בסביבות 300). הפעל את תוכנית הכיול.
    5. חזור על שלב 3.1.2 כדי לשטוף את ערוץ ההתקן לפני כל מדידת דגימה.
    6. השתמש במזרק סטרילי של 1 מ"ל כדי להזריק לפחות 2 מ"ל של תמיסת חיץ כדי לשטוף את תעלת המכונה במהירות קבועה עד שמספר החלקיקים המוצגים בממשק הזיהוי קטן מ- 10.
    7. הזריקו 1 מ"ל של דגימת EV שהוכנה בשלב 3.1.1 במהירות בינונית וקבועה (המהירות המומלצת היא 0.5-1 מ"ל/שנייה).
      הערה: ריכוז החלקיקים האופטימלי הוא שמספר החלקיקים המוצגים בממשק הגילוי נע בין 50-400, רצוי בסביבות 300. אם מספר החלקיקים גבוה מדי, חזור על שלב 3.1.2 כדי לשטוף את תעלת המכונה באופן מיידי כדי למנוע שימור חלקיקים בדופן התעלה וכוונן את ריכוז דגימת הרכב החשמלי בשלב 3.1.1, ולאחר מכן חזור על שלב 3.1.5.
    8. לבצע את ניתוח החלקיקים ולהפיק את דוחות הניתוח בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
    9. אם הדגימה יקרה, שאבו בחזרה את דגימת הרכב החשמלי עם מזרק 1 מ"ל ואספו אותם בצינורות צנטריפוגות של 1.5 מ"ל. חזור על שלב 2.2 כדי לחלץ את כלי הרכב החשמליים.
    10. לאחר איתור כל הדגימות, הזריקו לפחות 2 מ"ל של תמיסת חיץ לתעלת המכונה ולאחר מכן הזריקו לפחות 5 מ"ל מים מזוקקים עד שמספר החלקיקים המוצגים בממשק הגילוי קטן מחמישה.
    11. השתמש מזרק סטרילי 5 מ"ל כדי להזריק לפחות 10 מ"ל אוויר במהירות קבועה (המהירות המומלצת היא 1 מ"ל / שנייה) כדי להסיר את המים בתעלה.
  2. בצע ניתוח TEM.
    הערה: בצע את השלבים הבאים עם מתלים חדשים של EV. לרשת מיקרוסקופ אלקטרונים מצופה פחמן יש שני צדדים, כאשר צד העבודה זוהר ברשתות המרכזיות. הנפח המינימלי של פלזמה כדי לחלץ את EVs עבור ההליך להלן הוא 50 μL.
    1. ערבבו את דגימת הרכב החשמלי (שלב 2.4) עם נפח שווה של 4% פרפורמלדהיד (PFA). יש להפקיד 4 מיקרוליטר של כלי הרכב החשמליים ברשת אחת ולדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    2. שים ארבע טיפות של PBS (טיפה אחת שווה ל 50 μL) על גיליון של סרט פוליאתילן (ראה טבלה של חומרים). העבירו את הרשתות בפינצטה מיקרוסקופית נקייה ושטפו את צד העבודה של הרשת ב-PBS מטיפה אחת לאחרת.
    3. השתמש בניירות סינון כדי להסיר PBS מיותרים שנותרו ברשתות.
    4. דגור על צד העבודה של הרשת לתוך חומצה פוספוטונגסטית 1% (ראה טבלת חומרים) במשך 2 דקות ולאחר מכן חזור על שלב 3.2.2.
      זהירות: מכיוון שחומצה פוספוטונגסטית היא רעילה, יש להפעיל הליך זה במכסה האדים, וחומצה פוספוטונגסטית עודפת צריכה להיות ממוחזרת באופן ספציפי ולא להשליך אותה ישירות.
    5. הניחו את הרשתות עם הפנים כלפי מעלה בכלי בקוטר 10 ס"מ מכוסה בניירות פילטר. ניתן לאחסן את הרשתות ב- RT למשך מספר שנים.
    6. התבונן ברשתות תחת מיקרוסקופ אלקטרונים בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
      הערה: כדי להבטיח שהחלקיקים הבודדים נצפים, יש לכוונן את ריכוז כלי הרכב החשמליים, והמתלים צריכים להיות ברורים ללא עכירות ברורה. לפני השחרור, המדגם צריך להיות מעורב היטב. הניתוחים המייצגים של TEM ונת"ע מוצגים באיור 2.

4. ניתוח מקור של כלי רכב חשמליים

הערה: זיהוי המקור התאי של כלי רכב חשמליים דורש שימוש בנוגדנים לסמנים טיפוסיים של קרום התא. נפח הפלזמה המינימלי לחילוץ כלי הרכב החשמליים בהליך הבא הוא 300 μL. בהתבסס על המבנים הדו-שכבתיים השומניים של כלי רכב חשמליים, ניתן להשתמש בצבע הממברנה כדי לסמן אותם. עבור דגימות פלסמה בדם, CD18 עבור לימפוציטים14 נבחר לייצוג. עבור דגימות עצם מקסילריות, קולטן הקשור לאוסטאוקלסטים (OSCAR) עבור אוסטאוקלסטים15 נבחר כדוגמה. לפני FC, ודא שציטומטר הזרימה מותאם למדידה של EVs16, מכיוון שמגבלת הגודל הנמוכה שונה במידה רבה בין ציטומטרים שונים של זרימה.

  1. השהה מחדש דגימות (שלב 2.4) עם 500 μL של PBS והעבר 50 μL לתוך צינור צנטריפוגה חדש ונקי 1.5 מ"ל כבקרה ריקה (צינור A) ועוד 50 μL לתוך צינור צנטריפוגה חדש ונקי 1.5 מ"ל כצינור צביעה פשוט עבור FITC (צינור B). הוסף 0.5 μL של צבע ממברנה לצינור הראשי לצביעת הממברנה. לדגור במשך 5 דקות ב RT.
  2. צנטריפוגה הצינור הראשי למשך 30 דקות ב 16,800 x גרם (4 ° C). השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הכדוריות עם 200 מיקרוליטר של PBS.
  3. חלק כל דגימה של 50 μL לארבע צינורות צנטריפוגות של 1.5 מ"ל עבור צינורות צביעה פשוטים עבור PE (צינור C), צביעת סמן פני השטח (צינור D) ובקרות נוגדנים משניות בלבד (צינור E).
  4. הוסף את הנוגדן העיקרי של OSCAR בדגימות עצם EV וכן נוגדן CD18 בדגימות פלזמה EV (ראה טבלת חומרים) לצינור B (שלב 4.1) ולצינור D (שלב 4.3) בנפרד (מדולל ב-1:100). לדגור במשך 1 שעה ב 4 °C.
  5. צנטריפוגה את הצינורות במשך 30 דקות ב 16,800 x גרם (4 ° C). השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הכדוריות עם 500 מיקרוליטר של PBS, ואז צנטריפוגה שוב למשך 30 דקות בטמפרטורה של 16,800 x גרם (4 מעלות צלזיוס) כדי להסיר את הנוגדנים הראשוניים הנוספים.
  6. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הכדוריות עם 50 μL של PBS, ולאחר מכן להוסיף נוגדנים משניים מצומדים FITC (ראה טבלת חומרים), בהתאמה (מדולל ב 1:200) (צינור E). הוסף את אותם נוגדנים משניים לצינור B (שלב 4.1) ולצינור D (שלב 4.3). לדגור על כל הצינורות במשך 1 שעות, ב 4 ° C בחושך.
    הערה: ניתן להשתמש בנוגדני תיוג מצומדים פלואורסצנטיים ישירים גם כדי לעבד את זיהוי FC עם בקרות איזוטיפ מתאימות.
  7. דללו טיפה אחת של חרוזים בגודל 0.2, 0.5 ו-1 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) בהתאמה ל-1 מ"ל של PBS, והריצו תחילה כל גודל חרוזים כדי לוודא את השער שנבחר לרכבים חשמליים. הגדר את סף ציטומטר הזרימה כדי לחפש את אוכלוסיית החרוזים והרכב החשמלי באמצעות פיזור קדמי מתאים (FSC) ופיזור צדדי (SSC).
    1. הגדר את המצב הסופי כחישוב 100,000 חלקיקים צבועים בקרום. נתח את הדגימה באמצעות ציטומטר זרימה לפי הוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). התוצאות המייצגות מוצגות באיור 3.
      הערה: ציוד נת"ע עם תעלות פלואורסצנטיות יכול לשמש גם לניתוח מקור, והכנת הדגימה זהה ל- FC.

5. ניתוח תכולת חלבון של כלי רכב חשמליים

הערה: ניתוח תכולת החלבון בתוך כלי רכב חשמליים מתבצע באמצעות כתם מערבי. לדוגמה, הפלזמה והעצם נבחרו לנתח 6-phosphogluconate dehydrogenase (PGD) ו pyruvate kinase M2 (PKM2) עבור מצב מטבולי. Golgin84 (אברון גולג'י) שימש כבקרה שלילית, ו-Flotillin (חלבון ממברנה), Caveolin (חלבון אינטגרלי של caveolae) ו-β-actin (השלד הציטושל)17 שימשו כבקרה חיובית ברכבים חשמליים בהשוואה לדגימות תאים. מיטופילין ו-α-Actinin-4 נבחרו כסמנים גדולים של EV, בעוד CD9 ו-CD81 נבחרו כסמנים קטנים של EV כדי להדגים את תת-אוכלוסיות הרכב החשמלי18. Apoa1 נבחר כסמן חלקיקי פלזמה19. לקבלת פרטי המגיב המתאים, ראה טבלת חומרים.

  1. יש להשהות מחדש את הכדוריות (שלב 2.4) ב-50 מיקרוליטר של חיץ RIPA lysis, ולדגור במשך 30 דקות על קרח.
  2. כמת את ריכוזי החלבון של כל הדגימות במיקרו-צלחת של 96 בארות על ידי בדיקת חלבון BCA בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
    1. לדלל את 2 מ"ג / מ"ל של אלבומין בסרום בקר (BSA) עם 0.9% של מלוחים נורמליים (NS) (המכיל 0.9% (w / v) של נתרן כלורי) לתוך 0.5 מ"ג / מ"ל. הוסף את 0.5 מ"ג/מ"ל של BSA ו-0.9% של NS לשלוש בארות משוכפלות עם נפחים מסוימים, כפי שמוצג בטבלה 1.
    2. זרוק 2 μL של הדגימות (שלב 5.1) והוסף 18 μL של NS לשלוש בארות משוכפלות בנפרד.
    3. הכן פתרון עבודה על-ידי ערבוב מגיב BCA A עם מגיב B (מגיב 50:1 A:B). הוסף 200 μL של תמיסת העבודה לכל באר ונער בעדינות במשך 30 שניות.
    4. לדגור את microplate 96-באר במשך 20-25 דקות ב 37 ° C.
    5. מדוד את OD ב- 596 ננומטר באמצעות הספקטרופוטומטר (ראה טבלת חומרים).
    6. יצא את הנתונים.
    7. ציירו עקומה סטנדרטית וחשבו את ריכוז החלבון של הדגימות.
  3. על פי התוצאות, דללו את הדגימות ל-1 מיקרוגרם/μL עם 0.9% NS ומאגר טעינה 5x SDS-PAGE (250 mM Tris· HCl, pH 6.8, 10% SDS, 30% (v/v) גליצרול, 10 mM DTT, 0.05% (עם v) Bromophenol כחול, ראה טבלה של חומרים). אטמו את הצינורות בסרט בחוזקה וחממו למשך 5 דקות ב-100°C.
  4. יש להעמיס את הדגימות ואת סולם החלבונים לריכוז מדורג של 4%-20% ג'ל Hepes-Tris (ראו טבלת חומרים).
    הערה: בחר את אחוז הג'ל בהתאם למשקל המולקולרי של החלבונים המעניינים.
  5. הפעל את הג'ל במאגר הריצה ב 80 V עד שהחלבונים יוצרים קו, ולאחר מכן עבור ל 120 V למשך שעה אחת עד שצבע ההעמסה נמצא בתחתית הג'ל.
    הערה: זמן הפעולה עשוי להשתנות בהתאם לציוד המשמש או לסוג וריכוז הג'ל.
  6. מעבירים את הג'ל לקרום הפוליווינילידן פלואוריד (PVDF) (ראו טבלת חומרים), מודגר מראש במתיל אלכוהול למשך 20 שניות. השתמש במערכת העברה רטובה כדי להעביר במשך שעה אחת ב 200 mA.
    התראה: ודא שאין בועה בתוך מערכת ההעברה ושמור על קרום PVDF רטוב.
    הערה: זמן ההעברה עשוי להשתנות בהתאם למשקל המולקולרי של חלבון היעד; 1 KD בדרך כלל צריך 1 דקה.
  7. הכן חיץ חוסם BSA של 5% על-ידי הוספת 2.5 גרם BSA (ראה טבלת חומרים) ב-50 מ"ל של תמיסת מלח-טווין חוצצת טריס (TBST) (2 מ"ל של טווין שנוסף ב-2 ליטר של תמיסת PBS) לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. יש להתסיס עד להמסת האבקה. חסום את הממברנות במאגר זה למשך שעתיים ב- RT עם תסיסה.
  8. לדגור על הממברנות עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים המדוללים ב-TBST לריכוז תקין (מיטופילין, 1:1000; α-Actinin-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; גולגין84, 1:1000; פלוטילין-1, 1:1000; Caveolin-1, 1:1000; PGD, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-אקטין 1:3000) לילה ב 4 °C (75 °F).
  9. שטפו את הקרומים במאגר הכביסה (2 מ"ל של טווין שנוספו ב-2 ליטר של תמיסת PBS) ארבע פעמים (15 דקות בכל פעם), ודגרו על הקרומים עם הנוגדנים המשניים המתאימים בשעה 1:4000 למשך שעה אחת ב-RT עם תסיסה.
  10. שטפו את הקרומים במאגר הכביסה ארבע פעמים (15 דקות בכל פעם), ודלמו את הממברנות באמצעות ערכת Chemiluminescence ומערכת דימות ג'ל (ראו טבלת חומרים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהתאם לתהליך העבודה הניסיוני, ניתן לחלץ כלי רכב חשמליים מהדם ההיקפי ומהרקמות המוצקות (איור 1). העצם המקסימלית של עכבר בגיל 8 שבועות היא כ 0.1 ± 0.05 גרם, וכ 300 μL של פלזמה ניתן לאסוף מהעכבר. בעקבות שלבי הפרוטוקול, ניתן לאסוף 0.3 מ"ג ו-3 מיקרוגרם של כלי רכב חשמליים, בהתאמה. כפי שנותחו על-ידי TEM ו-NTA, המאפיינים המורפולוגיים האופייניים של כלי רכב חשמליים הם שלפוחיות קרום עגולות בצורת גביע בקוטר שנע בין 50 ל-300 ננומטר (איור 2). FC יכול לזהות את כלי הרכב החשמליים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאשר בוחנים את התכונות, הגורל והתפקוד של כלי רכב חשמליים, חיוני לבודד כלי רכב חשמליים עם תפוקה גבוהה וזיהום נמוך. קיימות שיטות שונות לחילוץ כלי רכב חשמליים, כגון צנטריפוגת שיפוע צפיפות (DGC), כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) ומבחני לכידת חיסון 4,20. כאן נעשה שימוש באחת השיטות הנפוצות ביותר, צנטריפוגה דיפרנציאלית; היתרונות של זה הם שזה לא לוקח זמן, זה מייצר תפוקה גבוהה של כלי רכב חשמליים עם בידוד קל מדגימות מוגבלות, ואת היכולת לשנות את השיטה על בסיס מקור הדגימה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32000974, 81870796, 82170988 ו- 81930025) והקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (2019M663986 ו- BX20190380). אנו אסירי תודה על הסיוע של המרכז הלאומי להדגמת הוראה ניסויית לרפואה בסיסית (AMFU).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4% פרפורמלדהיד ביושארפ143174מיקרוסקופ אלקטרונים שידור
אלקסה פלואור 488 נוגדן משני נגד עזיםYeason34306ES60ציטומטריית זרימה
אלקסה פלואור 488 נוגדן משני נגד ארנבInvitrogenA11008זרימה ציטומטריה
אנטי-CD18 נוגדןAbcamab131044זרימה ציטומטריה
אנטי-CD81 נוגדןAbcamab109201כתם מערבי
נגד CD9HuabioET1601-9כתם מערבי
נוגדן נגד מיטופיליןAbcamab110329כתם מערבי
APOA1 ארנב pAbAbcloneA14211כתם מערבי
BCA ערכת בדיקת חלבוןTIANGENPA115כתם מערבי
BLUeye סולם חלבון צבוע מראשSigma-Aldrich94964-500ULכתם מערבי
אלבומין סרום בקר MPביו-רפואי218072801כתם מערבי
נוגדן Caveolin-1 SantaCruz Biotechnologysc-53564כתם מערבי
CellMask כתם קרום פלזמה כתוםInvitrogenC10045זרימה ציטומטריה
כימילומינסנציהAmersham BiosciencesN/Aכתם
מערבימספריים ניתוחים מעוקליםJZ מכשיר כירורגיJ21040בידוד EV איזון
אלקטרוניZhi KeZK-DSTEV בידוד
עידן ספקטרופוטומטרBioTekN/Aכתם מערבי
צינורות אפנדורףEppendorf3810XEV בידוד
פלוטילין-1 נוגדןPTM BIOPTM-5369כתם
מערבימערכת הדמיית ג'לTanon4600כתם מערבי
Golgin84Novusnbp1-83352כתם
מערבי - Formvar/מצופה פחמן - נחושת 200 רשתPolysciences24915מיקרוסקופ אלקטרונים שידור
תמיסת הפריןStemCell 7980EV בידוד
Liberase מחקר כיתהסיגמא-אולדריץ'5401127001EV בידוד
פינצטה מיקרוסקופיתJZ מכשיר כירורגיJD1020בידוד EV
ציטומטר זרימה NovoCyteACEAN/A זרימה ציטומטריה
Omni-PAGE Hepes-Tris ג'לים Hepes 4 ~ 20%, 10 בארותEpizymeLK206כתם מערבי
OSCAR( D-19) נוגדןסנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-34235זרימה ציטומטריה
PBS (2x)ZHHCPW013כתם מערבי
נתרן פנטוברביטלסיגמא-אולדריץ'57-33-0הרדמה
פרוקסידאז AffiniPure Goat אנטי-עכבר IgG (H+L)Jacson115-035-003כתם מערבי
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jacson111-035-003כתם מערבי
חומצה פוספוטונגסטיתRHAWN12501-23-4מיקרוסקופ אלקטרונים שידור
PKM2(d78a4) xp ארנב  mab איתות תאים4053tכתם מערבי
סרט פוליאתילן (PE) Xiangyi200150055מיקרוסקופ אלקטרונים שידור
ממברנות פלואוריד פוליווינילידן Roche3010040001כתם מערבי
מעכבי פרוטאזRoche4693132001כתם מערבי
רקומביננטי נוגדן נגד PGDAbcamab129199כתם מערבי
RIPA מאגר ליזהBeyotimeP0013כתם מערבי
SDS-PAGE טעינת מאגר (5x)CwbioCW0027Sכתם מערבי
חרוזיםבגודלInvitrogenF13839זרימה ציטומטריה
שולחנית במהירות גבוהה מיקרו צנטריפוגותהיטאצ'יCT15EEV בידוד
מיקרוסקופ אלקטרונים שידורHITACHIH-7650מיקרוסקופ אלקטרונים שידור
Tween-20MP ביו-רפואי19472כתם מערבי
מערבולת מערבולת מערבל GenieScientific IndustriesSI0425EV בידוד
ZetaView BASIC NTA - מיקרוסקופ וידאו למעקב אחר ננו-חלקיקים PMX-120Particle MetrixN/Aניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים
&אלפא;-אקטינין-4 ארנבmAb AbcloneA3379כתם מערבי
&בטא;-אקטיןCwbioCW0096Mכתם מערבי
נוגדן רשתות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  3. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  4. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).
  5. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63(2018).
  6. Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
  7. Xia, W., et al. Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors. Nature Communications. 12 (1), 6043(2021).
  8. In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. Tumor-educated pletelets. Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).
  9. Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation. Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).
  10. Brahmer, A., et al. endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820(2019).
  11. Yang, H., et al. Blood collection through subclavian vein puncture in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59556(2019).
  12. Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59(2019).
  13. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162(2022).
  14. Forsyth, C. B., Mathews, H. L. Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans. Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).
  15. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685(2020).
  16. Welsh, J. A., et al. MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526(2020).
  17. Durcin, M., et al. Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677(2017).
  18. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  19. Noren Hooten, N., et al. Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality. Scientific Reports. 9 (1), 17582(2019).
  20. Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466(2020).
  21. Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).
  22. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  23. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  24. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).
  25. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  26. Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238(2020).
  27. Maroto, R., et al. Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478(2017).
  28. Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109(2021).
  29. Liu, D., et al. Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors. Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).
  30. Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).
  31. Dawson, G. Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes). Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).
  32. Zhang, G., et al. Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030(2020).
  33. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

EVsWestern Blot

מאמרים קשורים