איתור וכימות של ננו-צינוריות מנהור באמצעות תמונות תצוגת נפח תלת-ממדית

Summary

ננו-צינוריות מנהור (TNTs) הן בעיקר ננו-צינוריות ממברנת F-actin פתוחות המחברות בין תאים שכנים, ומקלות על תקשורת בין-תאית. המאפיין הבולט המבדיל בין TNTs לבין בליטות תאים אחרות הוא האופי המרחף של הננו-צינוריות בין התאים. כאן, אנו מאפיינים TNTs על ידי בניית תצוגת נפח תלת-ממדית של תמונות z-stack קונפוקליות.

Abstract

תגליות אחרונות גילו כי תאים מבצעים העברה בין-תאית ישירה, ארוכת טווח, באמצעות צינורות אקטין-ממברנה בקנה מידה ננומטרי, כלומר "מנהור ננו-צינוריות" (TNTs). TNTs מוגדרים כהרחבות ממברנה דו-שכבתיות פתוחות ומקיפות שומנים, המתווכות המשכיות בין תאים שכנים בקטרים הנעים בין 50 ננומטר ל-1 מיקרומטר. TNTs הודגמו בתחילה בתאי עצב, אך מחקרים עוקבים חשפו את קיומם של TNTs במספר סוגי תאים ומחלות, כגון מחלות נוירודגנרטיביות, זיהומים ויראליים וסרטן. מספר מחקרים התייחסו לננו-מבנים של ממברנות מצומדות חשמלית בין תאים שכנים כאל מבנים דמויי TNT או TNT.

ההבהרה של אולטרה-מבנה במונחים של המשכיות הממברנה בנקודת הקצה היא מאתגרת מבחינה טכנית. בנוסף, מחקרים על תקשורת בין תאים מאתגרים מבחינת אפיון TNTs בשיטות קונבנציונליות בשל היעדר סמנים ספציפיים. TNTs מוגדרים בעיקר כבליטות ממברנה פתוחות מבוססות F-actin. עם זאת, מגבלה מרכזית אחת היא ש-F-אקטין קיים בכל סוגי הבליטות, מה שמקשה על הבחנה בין TNTs לבליטות אחרות. אחד המאפיינים הבולטים של TNTs מבוססי F-actin הוא שמבנים אלה מרחפים בין שני תאים מבלי לגעת בתת-הסטרטום. לכן, ניתן להבחין בנוחות בין TNTs מוכתמים ב-F-actin לבין בליטות אחרות כגון פילופודיה ונויריטים בהתבסס על ריחופין בין תאים.

לאחרונה הראינו כי הפנמה של עמילואיד-β אוליגומרי 1-42 (oAβ) באמצעות אנדוציטוזה תלוית אקטין מעוררת קינאז-1 מופעל p21 (PAK1), אשר מתווך את היווצרותם של TNTs המכילים F-אקטין יחד עם phospho-PAK1 בין תאי עצב_SH-SY5Y. פרוטוקול זה מתווה שיטת ניתוח נפח תלת-ממדית לזיהוי ואפיון TNTs מתמונות z-stack שנלכדו של בליטות ממברנה מוכתמות ב-F-actin ו-phospho-PAK1-immunostained בתאי עצב שטופלו ב-oAβ. יתר על כן, TNTs נבדלים מפיתוח נויריטים וצמיחה עצבית המבוססת על צינורות ממברנה עם F-אקטין ו-β-III טובולין-אימונוסטי.

Introduction

ננו-צינוריות מנהור (TNTs) הן צינורות ממברנה פתוחים מבוססי F-actin, וממלאים תפקיד חיוני בהעברה בין-תאית של מטען ואברונים¹. המאפיין הייחודי של TNTs הוא שהם מחברים תאים שכנים ללא כל מגע עם הסובסטרטום; אורכם מעל 10-300 מיקרומטר וקוטרם נע בין 50 ננומטר ל-1 מיקרומטר ^2,3. TNTs הם מבנים חולפים, ואורך חייהם נמשך בין מספר דקות למספר שעות. TNTs הודגמו לראשונה בתאי עצב PC12¹; מאוחר יותר, מחקרים רבים הראו את קיומם במספר סוגי תאים במבחנה וב- in vivo ^4,5. מספר מחקרים חשפו את המשמעות הפתולוגית של TNTs ב....

Protocol

הערה: תאי SH-SY5Y שגודלו בתרבית במדיית DMEM/F-12 התמינו בחומצה רטינואית של 10 μM במשך 7 ימים וטופלו באוליגומרים של 1 μM oAβ במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (5% CO₂). לאחר הטיפול, התאים תוקנו עם התמיסה המקובעת של קרנובסקי והוכתמו פעמיים בנוגדן פוספו-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) ופלואידין קושר F-אקטין. מאוחר יותר, תמונות z-stack קונפוקליות צולמו באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. ה-TNTs כומתו על-ידי ספירה ידנית והובלטו בין נוריטים/בליטות תאים אחרות על-ידי בניית תמונות של תצוגת נפח תלת-ממדית וזיהוי המבנים מהמאפיין שלהם של ריחוף בין שני תאים מבלי לגעת בסובסטרטום (איור 1).

1. תרבית תאים....

Results

כאן, אנו מזהים ומאפיינים TNTs המושרים על-ידי oAβ בתאי עצב SH-SY5Y על-ידי בניית תצוגות נפח תלת-ממדיות מתמונות z-stack קונפוקליות (איור 1). התאים קיבלו כתם חיסוני כפול עם F-אקטין ופוספו-PAK1. תמונות z-stack קונפוקליות של תאים מדוכאי חיסון נותחו כדי לזהות TNTs (איור 2). יתר על כן, תמונות DIC נותחו כדי לאמת שמבני TNT המוכתמים ב-F-actin וב-phospho-PAK1 היו צינורות ממברנה בין תאים (איור 3). יתר על כן, התאים קיבלו כתם חיסוני כפול עם F-אקטי.......

Discussion

מספר חוקרים בשני העשורים האחרונים ניסו להבין ולאפיין את המבנה של TNTs¹⁸. היעדר סמנים ספציפיים מעכב את ההתקדמות, ויש דרישה גוברת לשיטה נוחה וסטנדרטית שניתן להשתמש בה כדי לזהות, לאפיין ולכמת TNTs. TNTs מוגדרים כצינורות ממברנה מבוססי F-actin המרחפים בין שני תאים. מחקרים הראו כי נויריטים β-טובולין חיוביים, קרובים, מתפתחים, מרחפים בין שני תאים מרוחקים ודומים למבנים דמויי TNT^12,13. לכן, TNTs מזוהים ומובחנים מנויריטים ומבנים אחרים דמויי TNT בהתבס.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
צלחת 35 מ"מ בגודל באר 14 מ"מ עשויה תלוש כיסוי #1.5	Cellvis	D35-14-1.5-N	צלחת הדמיה המשמשת לזרעי תאים לניסויי צביעה
Aβ (1-42) 1 מ"ג	AnaSpec	#64129	אוליגומרים של עמילואיד בטא לטיפול בתאים
קמח אלקסה 488 עז נגד ארנב IgG (H+L)	Invitrogen	A11070	נוגדן משני לפוספו-PAK1
ארון בטיחות ביולוגי	Thermo Scientific (MSC Advantage)	51025411	לספק תנאים אספטיים דוירנג תרבית תאים
CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)51026556		לגידול תאים בטמפרטורת הגוף או בסמוך לה
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי	ZEISS (Carl Zeiss)	LSM 880	מסוגל ליצור תמונות תלת מימדיות של דגימה גדולה ברזולוציה
גבוהה DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]	Merck	8034560100	מגיב נגד הלבנה
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Sigma	D9542-1MG	Neuclear stainer
DMEM media	Gibco	11965092	משמש להכנת 100uM של Aβ (1-42)
DMEM/F12 (תערובת 1:1 של DMEM ו-Ham' s F12)	Gibco	12500062	מדיה לתרבית תאים SH-SY5Y
DMSO (דימתיל סולפיד) דרגת תרבית תאים	Cryopur	CP-100	דרגת תרבית תאים המשמשת כחומר ממיס לחומצה רטינואית
DMSO (דימתיל סולפיד) בדרגה מולקולרית	Himedia	MB058	משמש כאחד החומרים הממיסים עבור A&Beta הליופילי; (1-42)
סרום בקר עוברי	Gibco	16000044	תוסף עיקרי למדיית תרבית (ממקור ארה"ב)
פורמלין מקבע (ניטרלי חוצץ 10%)	סיגמא אולדריץ'	HT5014-120ML	רכיב בתמיסת הקיבוע של קרנובסקי
גלוטרלדהיד (דרגה I, 25% ב-H2O)	רכיב Sigma	G5882	בתמיסת הקיבוע
HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol) TCI		H024	משמש להמסת Aβ (1-42)
תוכנת עיבוד / ניתוח תמונה של 1 מ"ג: FIJI (ImageJ)	המכון הלאומי לבריאות (NIH)		משמש לעיבוד/ניתוח התמונות ולהבדיל בין TNTs לנויריטים באמצעות התוסף שלו בשם "מציג נפח".
ליופילייזר	כרייסט, אלפא	2.4 LDplus	0.05 מ"ג של Aβ (1-42) ניתן לאחסן ב-20 ו-deg; C לאחר ליופיליזציה רק
תערובת פניצילין-סטרפטומיצין-ניאומיצין תרמו	פישר תערובת אנטיביוטיקה מדעית	15640055
פלואידין-iFlor 555	Abcam	ab176756	כתם קשירת F-אקטין
Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [ארנב]	CST	#2601	נוגדן
ראשוני נוגדן פוליקלונלי לטובולין בטא 3 (TUBb3)	שיבוט	ענןPAE711Hu01	נוגדן ראשוני
חומצה רטינואית	סיגמא-אולדריץ'	R2625-50MG	מגיב מבדיל
Saponin	Merck	8047-15-2	חומר ניקוי המשמש במאגר הדגירה בצביעת חיסון
סוניקטור אמבט מים (קווארט, מחמם שסתום ניקוז)	מנקה אולטרסאונד	3.0 ליטר/3.2	סוניקטור המשמש להמסת AΒ (1-42) מלאי, לאחר DMSO שהוסיף לו במהלך הכנת 100 ומיקרו; M Aβ (1-42)
תוכנת ZEN Microscopy	ZEISS (Carl Zeiss)		תוכנת הדמיה לרכישת תמונות מיקרוסקופיה קונפוקליות עם אוטומציה חכמה