מאמר שיטה

חתך עצמות טמפורליות אנושיות במהירות גבוהה להערכת פתולוגיה של האוזן התיכונה הקשורה ל-COVID-19

DOI:

10.3791/64012

⸱

18 במאי 2022

 ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology - Head & Neck Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 3Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר טכניקה לחתך מהיר של העצם הטמפורלית האנושית המשתמשת במיקרו-מסור עם להבי יהלום תאומים כדי ליצור פרוסות דקות לצורך טשטוש מהיר וניתוח של אימונוהיסטוכימיה של העצם הטמפורלית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח היסטופתולוגי של נתחי עצם טמפורליים אנושיים הוא טכניקה בסיסית לחקר פתולוגיה של האוזן הפנימית והתיכונה. מקטעי עצם טמפורליים מוכנים על ידי קציר עצם טמפורלית לאחר המוות, קיבוע, דקלסיפיקציה, הטבעה וצביעה. בשל הצפיפות של העצם הטמפורלית, decalcification הוא תהליך גוזל זמן ועתיר משאבים; הכנת רקמות מלאה עשויה להימשך 9-10 חודשים בממוצע. זה מאט את המחקר באוטופתולוגיה ומעכב מחקרים רגישים לזמן, כמו אלה הרלוונטיים למגפת COVID-19. מאמר זה מתאר טכניקה להכנה מהירה של נתחי עצם טמפורליים כדי להאיץ את עיבוד הרקמות.

עצמות טמפורליות נקטפו לאחר המוות בטכניקות סטנדרטיות והתקבעו ב-10% פורמלין. מיקרו-מסור מדויק עם שני להבי יהלום שימש לחיתוך כל מקטע לשלושה חלקים עבים. לאחר מכן, מקטעי עצם טמפורלית עבים הודבקו בתמיסה דקטלסית במשך 7-10 ימים לפני שהוטמעו בפרפין, נחתכו למקטעים דקים (10 מיקרומטר) באמצעות קריוטום, והורכבו על שקופיות לא טעונות. דגימות רקמות הוחרמו לאחר מכן והתייבשו מחדש לצורך צביעת נוגדנים (ACE2, TMPRSS2, Furin) והצטלמו. טכניקה זו הפחיתה את הזמן מהקציר לניתוח רקמות מ 9-10 חודשים ל 10-14 ימים. חיתוך עצם טמפורלית במהירות גבוהה עשוי להגביר את מהירות המחקר באוטופתולוגיה ולהפחית את המשאבים הדרושים להכנת רקמות, תוך הקלה על מחקרים רגישים לזמן כמו אלה הקשורים ל- COVID-19.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר העצם הטמפורלית האנושית מספק משאב שלא יסולא בפז לחקר הפתולוגיה והפתופיזיולוגיה של האוזן הפנימית והתיכונה. לפני המאה ה-19, מעט מאוד היה ידוע על מחלה אוטולוגית 1,2,3. כדי להבין טוב יותר את המחלה האוטולוגית ואת "ניתוחי ההצלה האוראליים מידיו של קוואקים", ג'וזף טוינבי (1815-1866) פיתח שיטות לחקר חלקים היסטולוגיים של העצם הטמפורלית האנושית3. עבודה זו קודמה על ידי אדם פוליצר (1835-1920) בווינה ואחרים ברחבי אירופה במהלך שארית המאה ה -19, שהשתמשו בקטעי עצם טמפורליים כדי לתאר את ההיסטופתולוגיה של מצבים נפוצים רבים המשפיעים על האוזן 2,3,4.

מעבדת העצם הרקתית האנושית הראשונה בארצות הברית נפתחה בשנת 1927 בבית החולים ג'ונס הופקינס, שם פיתחה סטייסי גילד (1890-1966) שיטות לחתך עצמות טמפורליות 5,6. השיטות שפותחו על ידי גילדה כללו תהליך של 9-10 חודשים שכלל קציר לאחר המוות, קיבוע, דקלסיפיקציה בחומצה חנקתית, התייבשות באתנול, הטבעת צלולואידין, חתך, צביעה והרכבה. שינויים בטכניקה זו נעשו מאוחר יותר על ידי הרולד שוקנכט (1917-1996)7; עם זאת, המרכיבים הבסיסיים של תהליך זה נותרו כמעט ללא שינוי.

המשאבים המשמעותיים הנדרשים לתחזוקת מעבדת עצם טמפורלית הציבו אתגר למחקר עצם טמפורלית וככל הנראה תרמו לירידה בפופולריות שלה במהלך 30 השנים האחרונות 4,8. חלק ניכר ממשאבי המעבדה של העצם הרקתית חייבים להיות מוקדשים לתהליך של 9-10 חודשים של הכנת עצם טמפורלית. אחד הצעדים הגוזלים זמן רב ביותר בהכנה הוא decalcification של העצם הטמפורלית, שהיא העצם הצפופה ביותר בגוף האדם. דקלקציה מבוצעת בדרך כלל בחומצה חנקתית או בחומצה אתילנדיאמינט-אצטית (EDTA) ונמשכת שבועות עד חודשים תוך דרישה לשינוי תכוף של תמיסות 7,9. יתר על כן, מחקרים רגישים לזמן של האוזן האנושית, כמו אלה הקשורים למגפת COVID-19, עשויים להיות מעוכבים על ידי תהליך ההכנה האיטי הזה. מאמר זה מתאר טכניקה לחתך עצם טמפורלית במהירות גבוהה המשתמשת במיקרו-מסור יהלום כדי ליצור חתכים עבים המאפשרים טשטוש מהיר וניתוח רקמות תוך 10-14 יום מקצירת עצם טמפורלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה פותח באישור IRB (IRB00250002) ובהתאם למדיניות המוסדית לשימוש ברקמות אנושיות ובחומר זיהומי. כל תורם עצם זמני נתן הסכמה בכתב לפני המוות, או שההסכמה התקבלה לאחר מותו ממשפחתו של התורם. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הציוד והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. קציר עצמות זמני

  1. קבל את אישור מועצת הביקורת המוסדית המקומית (IRB), עיין במדיניות המוסדית לשימוש בחומרים אנושיים ומדבקים, וקבל הסכמה לתרומת רקמות לפני השימוש בפרוטוקול זה.
  2. יש לשים ציוד מגן אישי מתאים (PPE) לפני עבודה עם רקמות מתורמי עצם טמפורלית חיוביים ל-COVID-19. ודא שה-PPE מורכב ממכונת הנשמה N-95 ומגן פנים (או לחילופין מערכת טיהור אוויר בלחץ חיובי), חלוק ושני זוגות כפפות. סקור טכניקות להתאמה נכונה ו- doffing PPE לפני תחילת פרוטוקול זה10.
  3. קציר רקמת עצם טמפורלית תוך 12-24 שעות ממוות התורם. אם הגוף אינו מקורר, ודא כי הקציר מתרחש בתוך 8 שעות מהמוות.
    1. קציר עצמות טמפורליות במהלך נתיחה שלאחר המוות באמצעות שיטת ארבע החתכים, בלוק על ידי אוסטאוטום7.
      1. לאחר כריתת גולגולת, הסר את המוח וחלק את עצבי הגולגולת לתעלה השמיעתית הפנימית בחדות.
      2. הפוך את החתך הגרמי הראשון עם האוסטאוטום במקביל לחלק הקשקשי של העצם הטמפורלית ופשוט מדיאלי.
      3. בצע את החתך הגרמי השני במקביל לראשון בגבול המדיאלי של העצם הטמפורלית.
      4. לאחר מכן, הפוך את החתך השלישי 3-4 ס"מ קדמי ומקביל לרכס פטרוס.
      5. הפוך את החתך הרביעי בערך מקביל לשלישי, 2 ס"מ אחורי לרכס פטרוס.
        הערה: ודא שכל החתכים משתרעים דרך בסיס הגולגולת.
      6. לאחר מכן, הסר את העצם הטמפורלית באמצעות דיסקציה חדה כדי לשחרר את חיבור הרקמה הרכה לאורך הקצה הנחות של הדגימה. אם יש לבצע את החניטה לאחר קצירת עצם טמפורלית, קשרו את הגדם של עורק הצוואר.

2. קיבוע רקמות, דקלסיפיקציה וחיתוך

  1. מיד למקם את הרקמה ב 200-300 מ"ל של 10% פורמלין buffered (פורמלדהיד) כך שהרקמה שקועה במלואה. השאירו את הרקמה בפורמלדהיד למשך 72 שעות לפחות בטמפרטורת החדר, והחליפו את התמיסות מדי יום. אחסנו את הרקמה במיכל אטום לאוויר ובצעו שינויי תמיסה מתחת למכסה אדים תוך שימוש ב-PPE מתאים למניעת התפשטות הנגיף.
    הערה: לאחר תקופת הקיבוע של 72 שעות, הדגימות כבר לא צריכות להיחשב כמדבקות.
  2. השתמש במיקרו-מסור מדויק עם שני להבי יהלום כדי לחתוך כל דגימה לשלושה חלקים "עבים" כדי לאפשר טשטוש מהיר יותר של רקמות. הגדר את להבי היהלום התאומים למרחק של 5 מ"מ, כך שהחלק המרכזי של העצם הטמפורלית יהיה בעובי של 5 מ"מ. ודא כי קטעי הרקמה משני הקצוות הם בעובי 3-5 מ"מ.
  3. מניחים את החלקים העבים ב-200-300 מ"ל של 23% w/w תמיסת מדבקות חומצה פורמית למשך 7-10 ימים בטמפרטורת החדר, עד שהרקמה תהיה רכה מספיק להטבעת פרפין. שנה את הפתרונות מדי יום. בדוק אם יש תיקון רקמות הולם על ידי מישוש הדגימה, שאמורה להרגיש רכה.
    הערה: ניתן לאמת את ההפחתה גם על-ידי צילום רנטגן.
  4. שטפו את הדגימות במי ברז זורמים במשך 24 שעות על ידי הנחתן בכוס גדולה מתחת לברז רץ.
  5. לייבש את הרקמה בסדרה של אלכוהולים של ריכוז עולה7. הטביע את הרקמה ב-100-200 מ"ל של 70% אתנול למשך 1.5 שעות, ולאחר מכן שלוש שטיפות ב-95% ו-100% אתנול למשך 1.5 שעות כל אחת, בהתאמה. לאחר מכן, לשטוף את הרקמה 3 x 1.5 שעות ב Xylene.
  6. הטמיעו את החלקים העבים בפרפין, עם ארבעה טיפולים של 45 דקות כל אחד.
  7. השתמש בקריוטום כדי לחתוך מקטעים דקים (10 מיקרומטר). מקם את הרקמה כך שהרקמה נחתכה במישור הצירי. חתכו קטעים עבים יותר (20 מיקרומטר) אם רוצים.

3. אימונוהיסטוכימיה והדמיה

  1. אם רוצים צביעת המטוקסילין ואאוזין מסורתית (לא מתוארת כאן), יש לבצע צביעה לפני הרכבת החלקים על שקופיות זכוכית7.
  2. הרכיבו את החלקים על מגלשות זכוכית טעונות חיובית.
  3. אופים את המגלשות על צלחת חמה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  4. מניחים את השקופיות במחזיק ומטביעים אותן בתמיסת טיפול מקדים מסחרית המכילה ממס אורגני (דיאתנולמין במקרה זה) ואתנול כדי לנטרל, לייבש מחדש ולחשוף את הרקמה.
    הערה: שלב זה נחוץ כדי להשיג תוצאות משביעות רצון עם אימונוהיסטוכימיה עבור רקמות קבועות פורמלין ומוטבעות פרפין.
  5. מחממים את המגלשות בסיר לחץ בלחץ גבוה במשך 20 דקות.
  6. מניחים את השקופיות בתא לח וחוסמים את הרקמה באמצעות תמיסת חסימה מסחרית.
  7. בדקו את מקטעי הרקמה עם הנוגדן העיקרי נגד אנזים ממיר אנגיוטנסין 2 (ACE2; 1:50), פרוטאז סרין טרנס-ממברנה 2 (TMPRSS2, 1:1,000), ופרוטאז פורין (1:250).
    הערה: הנוגדנים ACE2, TMPRSS2 ו-Furin משמשים מכיוון שלפי ההערכות חלבונים אלה ממלאים תפקיד בהדבקת SARS-CoV-2 11,12, ופרוטוקול זה ביקש לחקור את המנגנונים האפשריים שבאמצעותם SARS-CoV-2 עלול להדביק את האוזן התיכונה13.
  8. טפלו בנוגדן משני נגד ארנב מצומד HRP (ACE2, Furin; דילול 1:100) או בנוגדן משני נגד עזים (TMPRSS2, 1:100 דילול).
  9. נגד המגלשות עם 70% המטוקסילין במים.
  10. רכשו תמונות במיקרוסקופ אור באמצעות מצלמה דיגיטלית מותקנת. קבל תמונות של רירית האוזן התיכונה והצינור האוסטכי בהגדלה של פי 20 ו-10x, בהתאמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צביעת המטוקסילין ואאוזין ברירית האוזן התיכונה ובצינור האוסטכי הראתה שימור של רירית האוזן התיכונה ושל רקמת האוזן התת-קרקעית התת-קרקעית לאחר העיבוד (איור 1). תמונות אימונוהיסטוכימיות הראו ביטוי של חלבוני ACE2, TMPRSS2 ופורין בתוך רירית האוזן התיכונה והצינור האוסטכימי (איור 1). נוכחותם של חלבונים אלה בתוך האוזן התיכונה מספקת מסלול אפשרי שבאמצעותו SARS-CoV-2 עלול להדביק את האפיתל הנשימתי בתוך האוזן התיכונה 11,12,13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר עצמות טמפורליות אנושיות הוא קריטי לחקר הפתולוגיה של האוזן הפנימית והתיכונה, אך הוא נותר מאמץ עתיר זמן ומשאבים. מאמר זה מתאר טכניקה המשתמשת במיקרו-מסור יהלום כדי ליצור מקטעי עצם טמפורליים עבים שניתן לנטרל במהירות לפני חתך נוסף, כך שניתן יהיה להפחית את הזמן מקצירת הרקמות למחקר מ-9-10 חודשים ל-10-14 ימים. טכניקה זו עשויה להפחית את המשאבים הדרושים לעיבוד עצם טמפורלית ולהקל על מחקרים רגישים לזמן, כגון אלה הקשורים לפתולוגיה של COVID-19 באוזן התיכונה והפנימית13, שהייתה המוטיבציה לפיתוח פרוטוקול זה. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למוחמד להאר על עזרתו בפרויקט זה. עבודה זו נתמכה באופן חלקי על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (T32DC000027, NSA).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן נגד ACE-2 (דילול מיושם של 1:50)Novus BiologicalsSN0754
נוגדן נגד פורין (דילול 1:250)AbcamEPR 14674
נוגדן נגד TMPRSS2 (דילול 1:1,000)Novus BiologicalsNBP1-20984
BX43 מיקרוסקופ מערכת ידניאולימפוס פתרונות
CBN/יהלום פרוסות היברידיות BladePace TechnologiesWB-007GP
קולין מאלט - 8''Surgical MartSM1517
DS-Fi3 מצלמת מיקרוסקופNikon
Dual Endogenous Enzyme Block (תמיסת חסימה מסחרית)DakoS2003
Eaosin StainSigma-Aldrich548-24-3
תמיסת פורמלין, ניטרלי חוצץ 10%Sigma-AldrichHT501128
Formical-4 Decalcifier (תמיסה להסרת אבדן של חומצה פורמית)StatLab1214-1 GAL
Hematoxylin StainSigma-AldrichH9627
נוגדן משני מצומד HRP נגד ארנב (דילול 1:100)Leica BiosystemsPV6119
ImmPRESS HRP ערכת זיהוי igG נגד עיזים, פרוקסידאז (1:100 דילול)Vector LaboratoriesMP-7405
Lambotte OsteotomeSurgical MartSM1553
מטאלוגרפי PICO 155P מסור דיוקPace TechnologiesPICO 155Pמיקרו-מסור
NIS Elements תוכנה גרסה 4.6Nikon
Paraplast PlusSigma-AldrichP3683פרפין
שקופיות מיקרוסקופ טעון חיובי עם קצה חלבי לבןמוצרי וולטר1140B15
תרמו שנדון Crytome FSE Cryostat MicrotomeNew Life Scientific Inc.A78900104קריוטום
טריולוגיה טיפול מקדים פתרון (פתרון מסחרי לטיפול מקדים)סיגמא-אולדריץ'920P-05
קסילןסיגמא-אולדריץ'920P-05
מדעי החיים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
  2. Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).
  3. Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
  4. Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
  5. Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480(1934).
  6. Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
  7. Schuknecht, H. Pathology of the Ear. , Lea and Febiger. Philadelphia, PA. (1993).
  8. Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science--and art--of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
  9. Nager, G. T. Pathology of the Ear and Temporal Bone. , Williams and Wilkins. Baltimore, MD. (1993).
  10. COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE). , Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022).
  11. Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822(2022).
  12. Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
  13. Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
  14. Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
  15. Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113(2021).
  16. McCall, A. A., et al. Extralabyrinthine manifestations of DFNA9. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).
  17. Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
  18. Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
  19. Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

COVID 19ACE2

מאמרים קשורים