הדמיה של מיאלינציה היא מטרה חשובה עבור חוקרים רבים החוקרים את מערכת העצבים. CARS היא טכניקה התואמת את האימונופלואורסצנציה שיכולה לדמות באופן טבעי שומנים בתוך רקמות כגון המוח המאיר מבנים מיוחדים כגון מיאלין.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
יישום ספקטרוסקופיית ראמן קוהרנטית נגד סטוקס (CARS) להדמיית מיאלינציה בפרוסות מוח
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
ספקטרוסקופיית ראמן קוהרנטית נגד סטוקס (CARS) היא טכניקה המשמשת באופן קלאסי על ידי כימאים ופיזיקאים כדי לייצר אות קוהרנטי של תנודות חתימה של מולקולות. עם זאת, חתימות רטט אלה אופייניות גם למולקולות בתוך רקמה אנטומית כמו המוח, מה שהופך אותו יותר ויותר שימושי וישים עבור יישומים במדעי המוח. לדוגמה, CARS יכולה למדוד שומנים על ידי קשרים כימיים מרגשים במיוחד בתוך מולקולות אלה, מה שמאפשר כימות של היבטים שונים של רקמות, כגון מיאלין המעורב בהעברה עצבית. בנוסף, בהשוואה לטכניקות אחרות המשמשות בדרך כלל לכימות מיאלין, ניתן גם להגדיר את CARS כך שיהיה תואם לטכניקות אימונופלואורסצנטיות, מה שמאפשר תיוג משותף עם סמנים אחרים כגון תעלות נתרן או רכיבים אחרים של העברה סינפטית. שינויים במיאלינציה הם מנגנון חשוב מטבעו במחלות דה-מיאלינציה כגון טרשת נפוצה או מצבים נוירולוגיים אחרים כגון תסמונת X שביר או הפרעות בספקטרום האוטיזם הוא תחום מחקר מתפתח. לסיכום, ניתן להשתמש ב-CARS בדרכים חדשניות כדי לענות על שאלות בוערות במדעי המוח ולספק ראיות למנגנונים בסיסיים הקשורים למצבים נוירולוגיים רבים ושונים.
מבוא
פוטנציאל פעולה הוא יחידת המידע הבסיסית במוח, ופוטנציאל פעולה המתפשט באמצעות אקסונים מהווה נדבך אחד של עיבוד מידע 1,2,3. תאי עצב בדרך כלל מקבלים קלטים ממספר תאי עצב אחרים ומשלבים את הקלטים האלה בחלון זמן צר נתון 4,5. לכן, מנגנוני הפעולה של התפשטות פוטנציאלית באקסונים קיבלו כמות משמעותית של תשומת לב מהחוקרים.
בעת התפשטות דרך אקסון, פוטנציאל פעולה מתחדש שוב ושוב לאורך האקסון כדי להבטיח התפשטות אמינה6. ברוב תאי העצב של בעלי חוליות לסתות (gnathostomes) אקסונים מוקפים בנדן....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים עמדו בכל החוקים החלים, הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות, ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קולורדו אנשוץ.
1. בעלי חיים
- השתמש בעכברי C57BL/6J (מלאי #000664) (Mus musculus ) שהתקבלו ממעבדת ג'קסון או גרבילים מונגולים (Meriones unguiculatus) שהתקבלו במקור מנהר צ'ארלס.
2. הכנת רקמות
- עבור זלוף שריר הלב, מנת יתר של מיני מכרסמים בעלי עניין עם פנטוברביטל (120 מ"ג/ק"ג משקל גוף) וטרנס-קרדית מחלחלים אליהם עם תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.76 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na2HPO 4....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אחד היתרונות הגדולים ביותר של מיקרוסקופיית CARS על פני טכניקות אחרות הוא התאימות עם הדמיה פלואורסצנטית23. איור 1 מראה את ספקטרום ה-CARS בהשוואה ל-Nissl המתויג עם סמן אימונופלואורסצנטי המציג חפיפה מועטה/ללא חפיפה בספקטרה. איור 2 ממחיש את מערך הלייזר עבור מכוניות בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. איור 3 מדגים שתי תמונות מייצגות, אחת כערימה בודדת ואחת כהקרנה מקסימלית של z-stack מגרביל ועכבר שניתן לקבל באמצעות הדמ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
גוף הולך וגדל של ספרות מדגיש את תפקידו של המיאלין בתפקוד המוח 13,16,21,28. יתר על כן, אנו יודעים כי עובי המיאלינציה ודפוס המיאלינציה יכולים להשתנות במספר מצבים נוירולוגיים כגון טרשת נפוצה (נבדק ב -29), הזדקנות (נבדק ב -30), אוטיזם20,31, ורבים אחרים. לכן אין זה מפתיע שיותר ויותר חוקרים צריכ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.
תודות
נתמך על ידי NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (קלוג), ו- NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 ו- FRAXA (מק'קולה). הדמיית CARS בוצעה בחלק הליבה של מיקרוסקופיית האור המתקדמת של המרכז לנוירוטכנולוגיה בקמפוס הרפואי של אוניברסיטת קולורדו אנשוץ, הנתמך בחלקו על ידי NIH P30 NS048154 ו-NIH P30 DK116073.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>הרדמה: < / חזק> | |||
| 1 מ"ל מזרק חד פעמי עם מחט 27 GA x 0.5 אינץ' | Exel int | 260040 | |
| קטלני + | Vortech | ||
| <חזק>ניתוח: < / מספריים חזקים> | |||
| קפיצים - 8 מ"מ | כלי מדע עדינים | 15024-10 | |
| פינצטה סטנדרטית | כלי מדע עדינים | 11027-12 | |
| <חזק>זלוף: | |||
| 4% פרפורמלדהיד | פישר כימיקל | SF994 (CS) | |
| מספריים עדינים - Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Kelly hemostats | Fine Science Tools | 13019-14 | |
| Millipore H2קצה מחט O | |||
| , 23 GA x 1 אינץ' | BD דיוק גלישה | 305193 | |
| פוספט חוצץ מלח (PBS): | |||
| אשלגן כלורי | Sigma | P9333 | |
| אשלגן פוספט מונו-בסיס | משאבת Sigma | P5655 | |
| עם זרימה משתנה או שווה ערך | |||
| נתרן כלורי | פישר כימיקל | s271-1 | |
| סודיום פוספט דו-בסיסי | סיגמא | S7907 | |
| <חזק>דיסקציה: בקבוקון | |||
| 50 מ"ל עם 4% PFA | |||
| Bochem Chemical Spoon 180 מ"מ | Bochem | 230331000 | |
| מספריים עדינים - Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Noyes מספריים אביביים | כלי מדע עדינים | 15011-12 | |
| זוג פינצטה עדינה (Graefe) | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| מגש זכוכית או פלסטיק רדוד, כ-10 אינץ' x 10 אינץ' | |||
| פינצטה | סטנדרטית Fine Science Tools | 11027-12 | |
| מספריים כירורגיים - מדע משובח קהה | כלים | 14000-20 | |
| <חזק>חיתוך: | |||
| אגר, צמח | RPI | 9002-18-0 | |
| Vibratome | Leica | VT1000s | |
| צלחת באר | Alkali Sci. | TPN1048-NT | |
| חזק>מכתים: < / חזק> | |||
| AB מדיה: | 1n 1,000 מ"ל של Millipore H2< / sub>O | ||
| פוספט חוצץ (PB): | |||
| אשלגן פוספט מונובסיס | סיגמא | P5655 | |
| נתרן פוסוהאט דו-בסיסי | סיגמא | S7907 | |
| BSA (אלבומין בסרום בקר) | סיגמא מדעי החיים | A2153-100 גרם | |
| נתרן כלורי | פישר כימיקל | s271-1 | |
| טריטון X-100 | סיגמא - אולדריץ' | x100-500 מ"ל | |
| ניסל 435/455 | Invitrogen | N21479 | |
| <חזק>מכוניות: | |||
| APE לייזר פיקואמרלד | Angewandte Physik & אלקטרוניק מסנן פס פס GmbH | ||
| (420-520 ננומטר) | Chroma Technology | HQ470/100m-2P | |
| מסנן פס פס (500-530 ננומטר) | Chroma Technology | HQ515/30m-2P | |
| מסנני פס פס (640-680 ננומטר) | Chroma Technology | HQ660/40m-2P | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | אולימפוס | FV1000 | |
| חתוך העברת פישר | 13-711-7M | ||
| מעבר ארוך דיכרואי 565 ננומטר | טכנולוגיית Chroma | 565dcxr | |
| מעבר ארוך דיכרואי 585 ננומטר | טכנולוגיית Chroma | 585dcxr | |
| מעבר קצר דיכרואי 750 ננומטר | Chroma Technology | T750spxrxt | |
| צלחת תרבות תחתונה זכוכית | MatTek | P35G-0-10-C | |
| משקל זכוכית (10 מ"מ x 10 מ"מ מוט בורו) | אלן סיינטיפיק זכוכית בע"מ | ||
| מסנן פליטת קצר מולטיפוטון 680 ננומטר | Chroma Technology | ET680sp-2p8 | |
| PBS |
מקורות
- Cole, K., Curtis, H. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
- Cole, K. S., Curtis, H. J. Membrane potential of the squid giant axon during current flow. Journal of General P....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
