מאמר שיטה

מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות להפעלה מחדש של קולטנים סינפטיים אנושיים למחקרים פונקציונליים

DOI:

10.3791/64024

⸱

20 ביולי 2022

 ,  ,  , 
1The Mitchell Center for Neurodegenerative Diseases, Department of Neurology, University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מדגים כי על ידי ביצוע מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות לתוך ביציות קסנופוס לאוויס , ניתן לרשום תגובות עקביות ואמינות של α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-איזוקסזולפרופיונית וחומצה γ-אמינו-בוטירית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קולטנים יונוטרופיים מעוררים ומעכבים הם השערים העיקריים של שטפי יונים הקובעים את פעילות הסינפסות במהלך תקשורת עצבית פיזיולוגית. לכן, שינויים בשפע, בתפקודם ובקשריהם עם אלמנטים סינפטיים אחרים נצפו כמתאם עיקרי של שינויים בתפקוד המוח ופגיעה קוגניטיבית במחלות נוירודגנרטיביות והפרעות נפשיות. הבנת האופן שבו הפונקציה של קולטנים סינפטיים מעוררים ומעכבים משתנה על ידי מחלה היא בעלת חשיבות קריטית לפיתוח טיפולים יעילים. כדי לקבל מידע רלוונטי למחלה, חשוב לתעד את הפעילות החשמלית של קולטני נוירוטרנסמיטר שנותרים מתפקדים במוח האנושי החולה. עד כה זוהי הגישה הקרובה ביותר להערכת שינויים פתולוגיים בתפקוד הקולטנים. בעבודה זו מוצגת מתודולוגיה לביצוע מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות, המורכבת מהפעלה מחדש של ממברנות סינפטיות מרקמת מוח אנושית קפואה המכילה קולטנים אנושיים, על ידי הזרקתה ואיחוי אחורי לתוך הממברנה של ביציות Xenopus laevis . הפרוטוקול מספק גם את האסטרטגיה המתודולוגית להשגת תגובות עקביות ואמינות של α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-איזוקסזולפרופיונית (AMPA) וקולטני חומצה γ-אמינו-בוטירית (GABA), כמו גם שיטות מפורטות חדשניות המשמשות לנורמליזציה ולניתוח נתונים קפדני.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרעות נוירודגנרטיביות משפיעות על אחוז גדול מהאוכלוסייה. למרות שתוצאותיהם ההרסניות ידועות היטב, הקשר בין השינויים התפקודיים של קולטני נוירוטרנסמיטר, שהם קריטיים לתפקוד המוח, והסימפטומטולוגיה שלהם עדיין לא מובן היטב. שונות בין-אישית, האופי הכרוני של המחלה והתפרצות חתרנית של תסמינים הם רק חלק מהסיבות שעיכבו את ההבנה של הפרעות המוח הרבות שבהן חוסר האיזון הכימי מתועד היטב 1,2. מודלים של בעלי חיים יצרו מידע שלא יסולא בפז והרחיבו את הידע שלנו על המנגנונים העומדים בבסיס הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה במערכות משומרות אבולוציוניות; עם זאת, מספר הבדלים בין-מיניים בין מכרסמים לבני אדם מונעים אקסטרפולציה ישירה של תפקוד הקולטנים ממודלים של בעלי חיים למוח האנושי3. לפיכך, המאמצים הראשוניים לחקור קולטנים אנושיים מקומיים פותחו על ידי מעבדתו של ריקרדו מילדי באמצעות רקמות שהוסרו בניתוח ודגימות קפואות. ניסויים ראשוניים אלה השתמשו בממברנות שלמות הכוללות קולטנים סינפטיים עצביים וסינפטיים נוספים, כמו גם קולטני נוירוטרנסמיטר שאינם עצביים, ולמרות שהם מספקים מידע חשוב על מצבים חולים, קיים חשש שתמהיל הקולטנים מסבך את הפרשנות של נתונים 4,5,6,7. חשוב לציין, סינפסות הן המטרה העיקרית בהפרעות נוירודגנרטיביות רבות 8,9; לכן, מבחנים לבדיקת התכונות התפקודיות של סינפסות מושפעות הם בסיסיים כדי לקבל מידע על שינויים רלוונטיים למחלה המשפיעים על התקשורת הסינפטית. כאן מתואר שינוי של השיטה המקורית: מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות (MSM), המתמקדת באפיון פיזיולוגי של תכשירי חלבונים סינפטיים מועשרים ויושמה בהצלחה בחקר חולדות וסינפטוסומים אנושיים 10,11,12,13,14,15 . בעזרת מתודולוגיה זו, ניתן להשתיל קולטנים סינפטיים שפעם עבדו במוח האנושי, משובצים בשומנים המקומיים שלהם ועם קבוצת חלבונים נלווים משלהם. יתר על כן, מכיוון שנתוני MSM הם כמותיים, ניתן להשתמש בנתונים אלה כדי להשתלב עם מערכי נתונים פרוטאומיים או רצף גדולים10.

חשוב לציין כי ניתוחים פרמקולוגיים וביופיזיים רבים של קולטנים סינפטיים נעשים על חלבונים רקומביננטיים16,17. בעוד שגישה זו מספקת תובנה טובה יותר לגבי יחסי מבנה-תפקוד של קולטנים, היא אינה יכולה לספק מידע על קומפלקסים מורכבים של קולטנים רב-מתכתיים המצויים בתאי עצב ועל השינויים שלהם במחלות. לכן, שילוב של חלבונים מקומיים ורקומביננטיים צריך לספק ניתוח מקיף יותר של קולטנים סינפטיים.

ישנן שיטות רבות להכנת סינפטוזומים 10,11,12,13,14,15 אשר ניתן להתאים לדרישות המעבדה. הפרוטוקול מתחיל בהנחה שתכשירים מועשרים סינפטוזומליים בודדו ומוכנים לעיבוד לניסויים במיקרו-טרנספלנטציה. במעבדה, נעשה שימוש בשיטת Syn-Per בהתאם להוראות היצרן. זה נעשה בגלל יכולת שכפול גבוהה בניסויים אלקטרופיזיולוגיים10,11. יש גם ספרות בשפע המסביר כיצד לבודד את ביציות קסנופוס 18,19, אשר ניתן לרכוש גם מוכן להזרקה20.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחקרים מבוצעים בהתאם להנחיות המוסדיות ומאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה אירווין (IACUC-1998-1388) והסניף הרפואי של אוניברסיטת טקסס (IACUC-1803024). קליפת המוח הטמפורלית ממוח שאינו מחלת אלצהיימר (AD) (נקבה, בת 74, מרווח לאחר המוות 2.8 שעות) ומוח AD (נקבה, בת 74, מרווח לאחר המוות 4.5 שעות) סופקו על ידי המרכז לחקר מחלת האלצהיימר של אוניברסיטת קליפורניה אירווין (UCI-ADRC). הסכמה מדעת לתרומת מוח הושגה על ידי UCI-ADRC.

הערה: יש להתייחס לרקמת מוח אנושית לא מרוסקת כמקור לפתוגנים הנישאים בדם (BBP). בהתאם לכך, יש צורך בהכשרת BBP לפני תחילת הניסויים. פרוטוקול זה מבוצע במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL2) תחת דרישות BSL2. ההנחיות ואמצעי הזהירות בתוך המעבדה כוללים: אין להכניס מזון או משקאות למעבדה, יש לעקוב אחר נוהלי מעבדה טובים, ציוד הגנה אישי (כפפות, חלוק, ללא נעליים פתוחות) נדרש, והדלת חייבת להיות סגורה בכל עת.

1. הכנת מיקרו-ביציות של קסנופוס

  1. כדי לייצר מחטי הזרקה, משוך צינורות בורוסיליקט בגודל 3.5 אינץ ' באמצעות מושך מיקרופיפט. לאחר משיכת מחטי המיקרו-איניג'קציה, השתמשו במיקרוסקופ ובלהב גילוח כדי לחתוך מספיק מקצה המחט, כך שניתן יהיה לבצע מיקרו-איניג'ינג (בדרך כלל בין 2-3 מ"מ).
    הערה: אורך קצה המחט לחיתוך יכול להשתנות.
  2. הכן את הפתרון של 1x Barth על ידי הוספת 200 מ"ל של תמיסת הסטוק של Barth (5x) ל-800 מ"ל של מים מזוקקים. מלאו צלחת תרבית רקמה תחתונה שטוחה בעלת 24 בארות עם תמיסה של 18 מעלות צלזיוס 1x Barth.
    1. הכן את פתרון המניות של Barth 5x כדלקמן. ב-1 ליטר של מים מזוקקים, יש להוסיף 25.71 גרם של NaCl (נתרן כלורי), 0.372 גרם KCl (אשלגן כלורי), 0.301 גרם CaCl2 (סידן דיכלוריד), 0.389 גרם של Ca(NO3)2(4H2O) (סידן חנקתי טטרהידרט), 1.01 גרם של MgSO 4(7H 2 O) (מגנזיום גופרתי הפטהידרט), 1.008 גרם של NaHCO 3 (נתרן ביקרבונט), 1.008 גרם של NaHCO 3 (נתרן ביקרבונט), 1.01 גרם של MgSO4(7H2O) (מגנזיום גופרתי הפטהידרט), 1.008 גרם NaHCO 3 (נתרן ביקרבונט), 1.008 גרם של NaHCO3 (נתרן ביקרבונט), ו-11.91 גרם HEPES (4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-חומצה פיפרזין אתאנסולפונית).
  3. לבודד את ביציות Xenopus באמצעות הפרוטוקולים המתואריםב-18,19 ובאמצעות סטריאוסקופ מוגדל פי 2, תוך בחירת ביציות V-VI שנראות בריאות למראה. הניחו כ-10 ביציות לכל באר והשתמשו באחת הבארות כדי לשכן ביציות שאינן מוזרקות כדי שישמשו כתאי בקרה בעת ביצוע הקלטות.
  4. שלפו צלחת פטרי קטנה, גובהה 1 ס"מ וקוטרה 6 ס"מ, והניחו בתוכה את רשת הניילון כך שתכסה את תחתית המנה. לאחר מכן, לשפוך 15 מ"ל של 1x תמיסה של Barth כדי לשמש לביצוע microinjections של הביציות.
  5. הניחו ננו-איניג'קטור לאורך קו האמצע של פלטפורמת המיקרוסקופ. סובבו את המגנט למצב כבוי והזיזו באיטיות את הננו-גנרטור למיקום הרצוי תוך תמיכה זהירה בו. כאשר הננו-גנרטור ממוקם כראוי, סובבו את המגנט בחזרה למצב On מלא וודאו שהוא מאובטח.
  6. עבור גודל מדגם של 50.6 nL, השתמש בהגדרות הבאות בצד של הננו-איניג'קטור: 1 הוא D (למטה), 2 הוא D, 3 הוא U (למעלה), 4 הוא D, ו- 5 הוא U. מקם חתיכה של תרמופלסטית איטום עצמי, או מכסה שפופרת מיקרוצנטריפוגה, על מעמד המיקרוסקופ, ומיישר אותה עם מסלול הננו-איניג'קט.
    הערה: 50 nL הוא קרוב לכמות המרבית של חומר מוזרק כי ציטופלסמה יכול לעמוד21.
  7. מלאו מזרק אינסולין כמחצית מנפחו בשמן מינרלי (כ-0.5 מ"ל/סמ"ק). באמצעות מזרק זה, למלא את מחט microinjection בשמן מינרלי. ודא כי חרוז גלוי של שמן נראה בקצה המחט.
  8. חשוף את בוכנת הננו-איניג'קטור למינימום של 1-2 ס"מ. עשו זאת על ידי לחיצה ממושכת על כפתור ה-EMPTY עד שהבוכנה תהיה גלויה באורך הרצוי. לאחר חשיפת הבוכנה, הניחו באיטיות ובזהירות את מחט הזכוכית המיקרו-אינטגרטיבית הממולאת בשמן המינרלי על בוכנה הננו-איניג'קטורית, וודאו שהיא מתאימה היטב דרך טבעת ה-O של ההתנגדות השחורה ונעצרת בטבעת ההתנגדות הלבנה. הקפידו לא לכופף את בוכנת הננו-איניג'קטור בתהליך.
  9. לאחר שמחט הזכוכית הזעירה מאובטחת ובמקומה, לחץ על EMPTY כדי לבטל את בועות האוויר הפוטנציאליות. בעדינות, עם רקמת נייר, לנקות את עודף השמן המינרלי.

2. טעינת הדגימה

  1. הכינו תכשירים מועשרים סינפטוזומליים (דגימות) מאזור העניין במוח האנושי כמתואר ב-10,11,12,12,13,14,15, ואחסנו אותם באליקוטים של כ-5 מיקרו-ל', בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לרגע ההזרקה.
  2. לפני ההזרקה, מעבירים את האליקוט לקרח רטוב ושומרים אותו על קרח בכל עת למעט צלילה ושליפה. מספר וסוגי הדגימות ייקבעו על ידי התכנון הניסויי.
  3. נקו את הדגימות הנבחרות פי 3 באמבטיה עם קרח רטוב צף כדי למנוע חימום של הדגימה. השתמש 5 מחזורים s בכל פעם, מחכה דקה אחת על קרח רטוב בין מחזורים.
  4. מניחים 1 μL של דגימה על התרמופלסטי. בצע כניסה במשטח, במידת הצורך, לפני מיקום הדגימה כדי למנוע את תנועת הדגימה.
  5. השתמש בידיות של המניפולטור המחזיק את הננו-איניג'קטור כדי למקם את המחט ולהזיז אותה לעבר הדגימה למילוי. לאחר שקצה המחט נמצא בדגימה, לחץ והחזק את כפתור המילוי עד לקבלת דגימה מספקת. כ 0.5 μL נדרש עבור 10 ביציות. באמצעות הידיות, הזיזו את המחט של הננו-גנרטור בחזרה למיקום הגבוה ביותר.

3. הזרקת הביציות

הערה: ממברנות סינפטוזומליות סטנדרטיות של קליפת המוח של חולדה מוזרקות גם הן בכל הניסויים לתוך קבוצה של ביציות כדי למדוד שינויים ביכולת האיחוי בין קבוצות שונות של ביציות.

  1. מניחים את הביציות הנבחרות על צלחת הפטרי הקטנה שיש לה את רשת הניילון המותאמת ואת התמיסה של בארת (כ-10 ביציות). לסדר ביציות כך שהן לא יהיו זו על גבי זו; זה יעזור במהלך תהליך ההזרקה.
  2. באמצעות הידיות על המניפולטור המחזיק את הננו-איניג'קטור, הזיזו את המחט לכיוון הביציות. לאחר שהמחט שקועה בתמיסה של ה-Barth, השתמשו בדוושת הרגל של הננו-איניג'קטור כדי לוודא שהמחט של המיקרו-איניג'קציה משחררת דגימה. אם הדגימה משתחררת היא תיראה מתצוגת המיקרוסקופ.
  3. לאחר שנקבע בביטחון כי הדגימה משתחררת, עברו למיקרו-אינץ' של הביצית. אם הדגימה אינה משתחררת, חזור על תהליך מילוי המחט.
  4. חודרים לביצית ממש מתחת לפני השטח עם המחט, לא עמוק יותר, ומשתמשים בדוושת כף הרגל כדי להזריק את הדגימה. דוושת כף הרגל תשמיע צליל צפצוף כאשר הדגימה תשוחרר. המתן בערך 2-3 שניות. אם ההזרקה הייתה מוצלחת, התא יתרחב. ברגע שזה קורה, השתמש בידיות על המניפולטור כדי לצאת מהתא.
    הערה: היתוך של ממברנות בביצה הוא תהליך מקוטב; לכן, יש להזריק את הביצית בצד החייתי של התא, רצוי מעל קו המשווה, עם זווית המחט לכיוון צד החיה כדי למקסם את היתוך הממברנה.
  5. הזיזו את צלחת הפטרי כך שהביצית הבאה תתיישר עם המחט ותחזרו על התהליך עד שכל הביציות בצלחת הוזרקו. חזור על תהליך זה עד להזרקת מספר הביציות הרצוי. וודאו כי באר אחת של ביציות נותרת ללא הזרקה כדי לשמש כבקרה.
  6. לאחר שכל הביציות הוזרקו, החזירו את הננו-איניג'קטור למקומו המקורי והסירו את המחט.

4. הקלטה של זרמי יונים באמצעות מהדק מתח שתי אלקטרודות

  1. כדי ליצור שתי מחטי אלקטרודה של מהדק מתח אלקטרודה (TEVC), משכו צינורות זכוכית בורוסיליקט מלוטשים באורך 15 ס"מ על ידי שימוש במשיכת המיקרופיפט. לאחר השלמת המשיכה, יש למלא ב-3 M KCl באמצעות מחטים נימיות ארוכות, או לחילופין, להטביע ולהרתיח את המחטים בתמיסת 3 M KCl למשך 15 דקות תחת ואקום רציף. הטמפרטורה הגבוהה מסייעת במילוי האלקטרודות ובהסרת בועות האוויר.
    1. הכינו תמיסת מילוי אלקטרודות של 3 M KCl על ידי שימוש ב-KCl בצורה גבישית ובמים שעברו דה-יוניזציה, ופעלו לפי שלבים אלה בזהירות כדי שפוטנציאל הייחוס של האלקטרודות לא ישתנה. מייבשים את ה-KCl בזהירות בתנור למשך 2-3 שעות. באמצעות איזון אנליטי, שקלו בזהירות 223.68 גרם KCl. העבירו את ה-KCl לבקבוק זכוכית בנפח 1 ליטר. השתמש בתמיסה זו כדי לכלור חוטי אלקטרודות כסף.
      הערה: למשיכת אלקטרודות זכוכית, ניתן להוריד את ספר הבישול פיפטה כאן: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf.
  2. הפעל את כל הציוד המשמש לרישום זרמי יונים: מערכות עיקריות, שסתומי תמיסה, אור מיקרוסקופ, מערכות שסתומים, מהדק ביציות ומערכת ואקום. הפעל את המחשב השולחני, היכנס ל- WinEDR V3.9.1., וודא שהתוכנית פועלת וכי ערכי ההתקנה נכונים באופן הבא: הקלט לדיסק, הגדר את משך ההקלטה ונקה את אפשרות הסימולטור.
    1. ספק את ערכי ההתקנה הראשוניים הבאים עבור המגבר: עבור מקטע אלקטרודת מתח (Vm), כבה את פיצוי הקיבולת השלילית (-C); עבור מקטע אלקטרודות אמבטיה (Im), הגדר את מתג בורר הרווח (טווח מ- 0.1 עד 10) ב- 10, ואת מתג המתג בעל שלושת המיקומים הבוחר את מכפיל הרווח (x0.1, x1.0 ו- x10), ב- x1.0. נורות ה-LED יציינו את בחירת מכפיל הרווח; עבור מקטע מהדק, כבה את בורר מצבי המהדק, הגדר את בקרת הרווח של DC ל- IN, ואת בקרת ההשגה ברוחב פס מלא של לולאה פתוחה (טווח 0 עד 2000) לסביבות 1200; עבור פקודות, הגדר ב- 40mV והגדר את מכפיל ההחזקה השלילי ואת מכפיל קנה המידה להיות ב- x2; עבור האלקטרודה הנוכחית, השתמש בהיסט Ve כדי ליצור ייחוס אפס לפני ההטלה של הביצית.
    2. כדי להקליט, פתח את תוכנת WinEDR V3.9.1, עבור לתפריט העליון ובחר קובץ > פתח קובץ חדש. צור תיקיה משלך ושמור את הקובץ.
    3. לאחר מכן, בתפריט הראשי בחר הקלט > להקליט לדיסק. כאשר שתי האלקטרודות נמצאות בתוך האוקטיט, הפעילו את הצלצול בבקר השסתומים VC-8, והפכו את המהדק לאיטי במגבר OC-725C. לאחר מכן, חזור לתוכנת WinEDR ובחר הקלט בפינה השמאלית העליונה של המסך.
    4. בתרשים הסימנים בפינה השמאלית התחתונה, רשמו את פוטנציאל הממברנה הראשונית ולחצו על Enter. ככל שהניסוי ממשיך, אתה יכול לרשום את שם התרופות שבהן נעשה שימוש. לאחר סיום הניסוי, בחר עצור בפינה השמאלית העליונה של המסך.
      הערה: אנו משתמשים בתוכנת WinEDR או WinWCP כדי לבצע TEVC מכיוון שהן חופשיות ומתאימות היטב לניסויים, אך ניתן להשתמש בכל תוכנה אחרת הזמינה.
  3. המציאו את כל פתרונות התרופה הדרושים לביצוע הניסוי (למשל, GABA, Kainate) ואשרו כי שסתומי התמיסה פועלים כראוי על ידי הפעלתם וכיבוים וצפייה בתזוזה של שסתומי הצביטה.
  4. מלאו את הצינורות על ידי שפיכת התמיסה המתאימה על כלי הקיבול של המזרק המחובר לצינור ותייגו את בקר השסתום כך שיתאים לצינורות התמיסה. ודא שזרימת הפתרון יציבה, אין בועות ושמערכת הוואקום פועלת כראוי.
  5. הגדר את המיקרוסקופ ואת אזור תא ההקלטה. מקם את גשרי האגר (ראה להלן) בחורים העגולים המתאימים מאחורי תא ההקלטה (דיסטלי מאזור הטיפול), ומחבר את הבארות עבור האלקטרודות המשמשות כייחוס הקרקע ותא ההקלטה. הוסף את תמיסת העבודה של Ringer (1x) לתא ההקלטה ולבארות האלקטרודה הייחוס הקרקעיות.
    1. גשרי אגר הם צינורות בורוסיליקט בצורת U, באורך 2-3 ס"מ, מלאים באגר של 3% בתמיסה של רינגר. הכינו צינורות בצורת U על ידי חיתוך צינורות באורך 15 ס"מ, כיפוף אותם על הלהבה הפתוחה, ולאחר מכן מילוים באגר חם של 3% באמצעות מזרק אינסולין. אחסנו גשרי אגר מלאים בתמיסה של רינגר במקרר עד לשימוש.
    2. הפוך את תמיסת המלאי של 20x Ringer באופן הבא: ב- 1 L של מים מזוקקים, הוסף 134.4 גרם של NaCl, 2.982 גרם של KCl, 5.29 גרם של CaCl2, ו- 23.83 גרם של HEPES (4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-piperazineethanesulfonic חומצה). עבור תמיסת העבודה של 1x Ringer, בבקבוקון נפחי, הוסף 200 מ"ל של תמיסת המלאי של רינגר (20x) ל-3,800 מ"ל של מים מזוקקים.
  6. הכן אלקטרודות כסף עם כלור לפני כל ניסוי על ידי אלקטרוליזה על ידי הצבת חוטי כסף בתמיסת 3 M KCl וחיבור האלקטרודה הכסופה לטרמינל החיובי של סוללת 9 V. לאחר כ -3 דקות שכבה חומה מוצקה של AgCl מושקעת באלקטרודה. מניחים את חוטי האלקטרודה הכסופים הכלוריים לתוך בית האלקטרודה.
    הערה: ייחוס קרקעי ורישום אלקטרודות עם כלור הן אלקטרודות כסף/כסף כלוריד (Ag/AgCl).
  7. הסר את מחטי הבורוסיליקאט מתמיסת KCl. השתמש במזרק כדי לחלץ כמות קטנה של תמיסת KCl מהקצה הפתוח של מחט האלקטרודה ולהחליף את תמיסת KCl בשמן מינרלי; זה ימנע אידוי מים ושינויים בריכוז KCl בתוך המחט. החליקו את מחט הזכוכית על חוט האלקטרודה הכסוף עם הכלור והידקו אותם למקומם.
  8. באמצעות המניפולטורים הימניים והשמאליים המחזיקים את האלקטרודות, מכוונים את מחטי האלקטרודות לתוך תא ההקלטה המלא בתמיסת רינגר.
  9. בדוק את ההתנגדות של כל אלקטרודה על ידי אפס ידיות היסט Vm ו- Ve ולאחר מכן לחיצה על כפתורי בדיקת האלקטרודה . ההתנגדות צריכה להיות בין 0.5-3 MΩ (נקרא ישירות כמו 5-30 mV במסך). אם ההתנגדות היא מחוץ לטווח, החלף באמצעות מיקרו-אלקטרוניקה חדשה.
  10. מלאו את תא ההקלטות בפתרון טרי של רינגר. באמצעות פיפטה מזכוכית, מניחים במרכז תא ההקלטה ביצית שאינה מוזרקת או מיקרו-טרנספלנית. ודא שהביצית נראית בבירור מתחת למיקרוסקופ, עם צד החיה למעלה (ראה הערה בשלב 3.4).
  11. הנחה את האלקטרודה לתוך תמיסת הרינגר עד שהם נוגעים בקרום הביציות. חודרים בעדינות את קרום הביציות בצד החיה (ראו הערה בשלב 3.4) עם שתי האלקטרודות ותעדו את פוטנציאל קרום המנוחה. הפעל את זרימת הפתרון של הצלצול.
  12. באמצעות מגבר מהדק הביציות, שנה את המצב למהדק מתח והגדר את מתח ההחזקה של -80 mV. הזרם על הצג צריך להיות שלילי, בדרך כלל בין 0 ל 0.4 microamperes.
  13. צור קובץ חדש לשמירת ההקלטה כקובץ > > חדש שמור את ההקלטה בתוכנה. התחל להקליט, לחץ על הקלט > הקלט לדיסק. הוסף מידע רלוונטי לקובץ באמצעות תיבת הדו-שיח של תיבת הסימון (שם הבדיקה, התרופות שבהן נעשה שימוש וכו ').
  14. יש למרוח אגוניסטים (למשל, GABA, גלוטמט או קאינאט) על גירוי כימי על ידי פתיחת השסתומים והכנסתם לתא ההקלטה במשך 15 שניות. בדרך כלל, השתמש ברווח של פי 10 כדי להתוות את מספר הנקודות המרבי ולשחזר את התגובה. אם הזרמים קטנים מאוד, הגדל את ההגברה, או הרווח, על מנת שהם יוערכו ויראויים. שים לב תמיד לשינויים אלה.
    הערה: משך הזלוף תלוי בפרדיגמה הניסיונית. אם המטרה העיקרית היא למדוד משרעת מקסימלית, 15 שניות יספיקו כדי להגיע לשיא עבור GABA או הרמה עבור kainate.
  15. נטר תמיד את רמות הפתרון. הפתרון של Ringer יצטרך להתמלא מחדש לעתים קרובות מכיוון שהוא משמש בין כל השימושים בפתרונות. לאחר השלמת ההקלטה, סובבו את מהדק המתח למצב כבוי וכבו את שסתום התמיסה של הרינג'ר. הסר את הביצית. הפסק להקליט ושמור את הקובץ. חזור על שלבים אלה עבור כל הביציות המוזרקות.

5. ניתוח הקלטות TEVC

  1. שמור עותק של ההקלטות בכונן USB. משם, פתח את הקובץ הרצוי לניתוח. בקובץ שנפתח, ניתן להציג, לסמן ולמדוד את ההקלטה. הניתוח הנפוץ ביותר כולל מדידה של משרעת מקסימלית, זמן הפעלה, דה-סנסיטיזציה וסקירה של יישומים חוזרים.
  2. מדוד את התגובה המקסימלית של AMPA ואת תגובת השיא של GABA. כדי להשיג מדידות אלה, תחילה קבע רמת אפס או קו בסיס על-ידי מציאת הקו האדום עם הסמן וגרירתו לזרם שנוצר על-ידי יישום או קו הבסיס של Ringer.
  3. לאחר קביעת רמת האפס, קבע את מדידות התגובה על-ידי שימוש בעכבר כדי לגרור את סמן הקריאה האנכי הירוק לחלק הרצוי של מעקב הגרפים. אם תרצה, ייצא את העקבות לניתוח בכל תוכנה מועדפת אחרת
    הערה: אם לא ניתן להגדיר את רמת האפס או שיש יותר מדי רעש המצוין במעקב, ייצא את קובץ WinEDR לתוכנה אנליטית לא מקוונת, שתאפשר שינויים כדי לספק בסיס רמה והוספת מסננים על מנת להפחית את הרעש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוך מספר שעות לאחר ההזרקה, הממברנות הסינפטיות, הנושאות את קולטני הנוירוטרנסמיטר ותעלות היונים שלהן, מתחילות להתמזג עם קרום פלזמת הביציות. איור 1 מראה הקלטות של קולטני AMPA ו-GABAA שהוזרמו במיקרו-טרנסנטים לביציות קסנופוס. במשך רוב הניתוח נמדדו התגובות של שתיים או שלוש ביציות לכל דגימה, באמצעות שתיים או שלוש קבוצות של ביציות מצפרדעים שונות, בסך הכל שש עד תשע ביציות לכל דגימה. זה נעשה עבור קבוצה גדולה של נבדקים אנושיים כדי לבחון הבדלים קבוצתיים. הניתוח פשוט ומודד משרעת של תג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח של קומפלקסים חלבוניים מקומיים ממוחות אנושיים נחוץ כדי להבין תהליכים הומאוסטטיים ופתולוגיים בהפרעות מוחיות ולפתח אסטרטגיות טיפוליות למניעה או לטיפול במחלות. לפיכך, בנקי מוח המכילים דגימות קפואות הצמדה הם מקור שלא יסולא בפז לעושר גדול ובעיקר לא מנוצל של מידע פיזיולוגי29,30. דאגה ראשונית לשימוש ברקמה לאחר המוות היא האפשרות הברורה של mRNA או פירוק חלבונים שעלולים לבלבל את הפרשנות של נתונים. לדוגמה, ה- pH של המוח מראה באופן עקבי מתאם חיובי עם כימות של mRNA על יד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIA/NIH R01AG070255 ו-R01AG073133 ל-AL. אנו מודים גם למרכז לחקר מחלת האלצהיימר של אוניברסיטת קליפורניה אירווין (UCI-ADRC) על שסיפק את הרקמה האנושית המוצגת בכתב יד זה. UCI-ADRC ממומן על ידי מענק NIH / NIA P30 AG066519.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>למיקרו-הזרקה
3.5 אינץ' נימי זכוכיתDrummond3-000-203-G/X
24 באר, תחתית שטוחה צלחת תרביתרקמות ThermofisherFB012929
חולץ מיקרופיפטה מסוג בוער/חוםSutterP-1000
הזרקת צלחתThermofisher08-772B
צינורות מיקרוצנטריפוגהThermofisher02-682-002
שמן מינרליThermofisherO121-1
Nanoject IIDrummond3-000-204
רשת ניילוןרשת תעשייתיתWN0800
ParafilmThermofisherS37440
סטריאוסקופפישר סיינטיפיק03-000-037
מזרקThermofisher14-841-31
אמבט ניקוי אולטרסאונדThermofisherFS20D
Xenopus laevis צפרדעיםXenopus 14217
<חזק>לשני אלקטרודות מהדק מתח
15 ס"מ באורך אש מלוטש בורוסיליקט זכוכית נימי סאטרB200-116-15
כל מחשב מחשב או מחשב נייד
מסנן בסל מעביר נמוךוורנר אינסטרומנטסLPF-8
סטריאוסקופפישר סיינטיפיק03-000-037
תחנת עבודה מהדק מתח שתי אלקטרודותוורנר אינסטרומנטסTEV-700
ValveLink 8.2 בקר זלוףאוטומציה מק"ט מדעי:01-18
WInEDR תוכנה חופשיתאוניברסיטת סטרצ'קלייד גלזגוhttps://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X סדרה רב תכליתית DAQNational InstrumentsNI USB-6341
<חזק>ריאגנטים
סידן דיכלורידThermofisherC79
סידן חנקת טטרה-הידרטThermofisherC109
קולגנאזסיגמא-אולדריץ'C0130
GABAסיגמא-אולדריץ'A2129
HEPES (4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפראזין-חומצה סולפונית)ThermofisherBP310
חומצה קאיניתTocris0222
מגנזיום סולפט הפטהידראטThermofisherM63
אשלגן כלוריThermofisherP217
נתרן ביקרבונטThermofisherS233
נתרן כלוריThermofisherS271-1
Ultrafree-0.1 ומיקרו; מסנן MC מ',אמיקון

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Furcila, D., Defelipe, J., Alonso-Nanclares, L. A study of amyloid-β and phosphotau in plaques and neurons in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Journal of Alzheimer's Disease. 64 (2), 417-435 (2018).
  2. Varol, E., Sotiras, A., Davatzikos, C. HYDRA: revealing Heterogeneity of imaging and genetic patterns through a multiple max-margin discriminative analysis framework. Neuroimaje. 145, 346-364 (2017).
  3. Hodge, R. vD., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
  4. Wu, J., et al. GABAA receptor-mediated excitation in dissociated neurons from human hypothalamic hamartomas. Experimental Neurology. 213 (2), 397-404 (2008).
  5. Miledi, R., Eusebi, F., Martínez-Torres, A., Palma, E., Trettel, F. Expression of functional neurotransmitter receptors in Xenopus oocytes after injection of human brain membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 13238-13242 (2002).
  6. Zwart, R., Mazzo, F., Sher, E. Microtransplantation of human brain receptors into oocytes to tackle key questions in drug discovery. Drug Discovery Today. 24 (2), 533-543 (2019).
  7. Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Miledi, R. Microtransplantation of neurotransmitter receptors from postmortem autistic brains to Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10973-10977 (2008).
  8. Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
  9. Taoufik, E., Kouroupi, G., Zygogianni, O., Matsas, R. Synaptic dysfunction in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases: An overview of induced pluripotent stem-cell-based disease models. Open Biology. 8 (9), 180138(2018).
  10. Zeppillo, T., et al. Functional impairment of cortical AMPA receptors in schizophrenia. Schizophrenia Research. , (2020).
  11. Lauterborn, J. C., et al. Increased excitatory to inhibitory synaptic ratio in parietal cortex samples from individuals with Alzheimer's disease. Nature Communications. 12 (1), 2603(2021).
  12. Mazzo, F., et al. Reconstitution of synaptic Ion channels from rodent and human brain in Xenopus oocytes: a biochemical and electrophysiological characterization. Journal of Neurochemistry. 138 (3), 384-396 (2016).
  13. Sanna, E., et al. Expression of native GABA(A) receptors in Xenopus oocytes injected with rat brain synaptosomes. Journal of Neurochemistry. 67 (5), 2212-2214 (1996).
  14. Sanna, E., et al. Functional changes in rat nigral GABA(A) receptors induced by degeneration of the striatonigral GABAergic pathway: An electrophysiological study of receptors incorporated into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 70 (6), 2539-2544 (1998).
  15. Sandoval, M., et al. Antagonistic effects of TrkB and p75NTR on NMDA receptor currents in post-synaptic densities transplanted into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 101 (6), 1672-1684 (2007).
  16. Perrais, D., Pinheiro, P. S., Jane, D. E., Mulle, C. Antagonism of recombinant and native GluK3-containing kainate receptors. Neuropharmacology. 56 (1), 131-140 (2009).
  17. Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364 (6438), 355-362 (2019).
  18. Bröer, S. Xenopus laevis Oocytes. Membrane Transporters in Drug Discovery and Development: Methods and Protocols. , 295-310 (2010).
  19. Newman, K., Aguero, T., King, M. Lou Isolation of xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (2), 86-91 (2018).
  20. Lin-Moshier, Y., Marchant, J. S. The Xenopus oocyte: A single-cell model for studying Ca2+ signaling. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (3), 185-191 (2013).
  21. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Microinjection of Xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
  22. Eusebi, F., Palma, E., Amici, M., Miledi, R. Microtransplantation of ligand-gated receptor-channels from fresh or frozen nervous tissue into Xenopus oocytes: A potent tool for expanding functional information. Progress in Neurobiology. 88 (1), 32-40 (2009).
  23. Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 5224-5228 (1995).
  24. Cutting, G. R., et al. Cloning of the γ-aminobutyric acid (GABA) ρ1 cDNA: A GABA receptor subunit highly expressed in the retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (7), 2673-2677 (1991).
  25. Calvo, D. J., Vazquez, A. E., Miledi, R. Cationic modulation of ρ1-type γ-aminobutyrate receptors expressed in Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 12725-12729 (1994).
  26. Martínez-Torres, A., Miledi, R. Expression of γ-aminobutyric acid ρ1 and ρ1Δ450 as gene fusions with the green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 1947-1951 (2001).
  27. Ochoa-De La Paz, L. D., Estrada-Mondragón, A., Limón, A., Miledi, R., Martínez-Torres, A. Dopamine and serotonin modulate human GABAρ1 receptors expressed in Xenopus laevis oocytes. ACS Chemical Neuroscience. 3 (2), 96-104 (2012).
  28. Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Eusebi, F., Miledi, R. Properties of GluR3 receptors tagged with GFP at the amino or carboxyl terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (39), 15526-15530 (2007).
  29. C, S. N. A Rosetta stone for analysis of human membrane protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10641-10642 (2008).
  30. Eleonora, P., et al. GABAA-current rundown of temporal lobe epilepsy is associated with repetitive activation of GABAA "phasic" receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (52), 20944-20948 (2007).
  31. Bond, B. C., et al. The quantification of gene expression in an animal model of brain ischaemia using TaqManTM real-time RT-PCR. Molecular Brain Research. 106 (1-2), 101-116 (2002).
  32. Preece, P., Cairns, N. J. Quantifying mRNA in postmortem human brain: influence of gender, age at death, postmortem interval, brain pH, agonal state and inter-lobe mRNA variance. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 60-71 (2003).
  33. Preece, P., et al. An optimistic view for quantifying mRNA in post-mortem human brain. Molecular Brain Research. 116 (1-2), 7-16 (2003).
  34. Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: What quality markers matter. Brain Research. 1123 (1), 1-11 (2006).
  35. Scaduto, P., Sequeira, A., Vawter, M. P., Bunney, W., Limon, A. Preservation of global synaptic excitatory to inhibitory ratio during long postmortem intervals. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  36. Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (11), 5224-5228 (1995).
  37. Le Mauff, A., et al. Nicotinic acetylcholine receptors in the synganglion of the tick Ixodes ricinus: Functional characterization using membrane microtransplantation. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 14, 144-151 (2020).
  38. Crespin, L., Legros, C., List, O., Tricoire-Leignel, H., Mattei, C. Injection of insect membrane in Xenopus oocyte: An original method for the pharmacological characterization of neonicotinoid insecticides. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 77, 10-16 (2016).
  39. Soualah, Z., et al. GABAA Receptor Subunit Composition Drives Its Sensitivity to the Insecticide Fipronil. Frontiers in Neuroscience. 15, 1-13 (2021).
  40. Symington, S. B., Murenzi, E., Toltin, A. C., Lansky, D., Clark, J. M. Realizing the potential: improving a microtransplantation assay based on neurolemma-injected Xenopus oocytes: an ex vivo approach to study ion channels in their native state. ACS Symposium Series. 1264, 53-73 (2017).
  41. Palma, E., et al. Microtransplantation of membranes from cultured cells to Xenopus oocytes: A method to study neurotransmitter receptors embedded in native lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2896-2900 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

XenopusAMPAGABA

מאמרים קשורים