מערכת העיכול היא אחד האיברים הרגישים ביותר לפגיעה בטיפולי סרטן רדיותרפיים. זוהי בו זמנית מערכת איברים עם אחת מיכולות ההתחדשות הגבוהות ביותר בעקבות עלבונות כאלה. הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה יעילה לחקר יכולת ההתחדשות של אפיתל המעי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
אפיתל המעי מורכב משכבה אחת של תאים אך מכיל סוגים רבים של תאים ממוינים סופניים, אשר נוצרים על ידי התפשטות פעילה של תאי גזע מעיים הממוקמים בתחתית crypts המעי. עם זאת, במהלך אירועים של פגיעה חריפה במעי, תאי גזע פעילים אלה עוברים מוות תאי. הקרנת גמא היא טיפול נפוץ בסרטן המעי הגס, אשר, בעוד יעיל מבחינה טיפולית, יש את תופעת הלוואי של דלדול מאגר תאי הגזע הפעיל. ואכן, חולים חווים לעתים קרובות תסמונת קרינה במערכת העיכול בזמן שהם עוברים הקרנות, בין היתר בשל דלדול תאי גזע פעילים. אובדן תאי גזע פעילים במעיים מפעיל מאגר של תאי גזע במעי שבדרך כלל נמצאים ברזרבה שקטה וגורם להתמיינות של תאים מבשרי הפרשה ואנטרוציט. אלמלא תאים אלה, אפיתל המעי היה חסר את היכולת להתאושש מהקרנות ופגיעות רקמה גדולות אחרות. פיתוחים חדשים בטכנולוגיות למעקב אחר שושלות מאפשרים מעקב אחר ההפעלה, ההתמיינות והנדידה של תאים במהלך רגנרציה, ושימשו בהצלחה לחקר זה במעיים. מחקר זה נועד לתאר שיטה לניתוח תאים בתוך אפיתל המעי של העכבר לאחר פגיעה בקרינה.
מבוא
אפיתל המעי האנושי יכסה בערך את פני השטח של חצי מגרש בדמינטון אם ימוקם שטוח לחלוטין1. במקום זאת, שכבת התא הבודדת הזו המפרידה בין בני אדם לתכולת המעיים שלהם נדחסת לסדרה של הקרנות דמויות אצבע, וילי ושקעים, קריפטות שממקסמות את שטח הפנים של המעיים. תאי האפיתל מתמיינים לאורך ציר קריפט-וילוס. הווילוס מורכב בעיקר מאנטרוציטים סופגי חומרים מזינים, תאי גביע מפרישי ריר ותאים אנטרואנדוקריניים מייצרי הורמונים, בעוד שהקריפטים מורכבים בעיקר מתאי פאנת מייצרי דפנסין, תאי גזע פעילים ומילואים, ותאי אב 2,3,4,5. יתר על כן, התקשורת הדו-כיוו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל העכברים שוכנו במחלקה למשאבי חיות מעבדה (DLAR) באוניברסיטת סטוני ברוק. הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת סטוני ברוק (IACUC) אישרה את כל המחקרים והנהלים המערבים נבדקים בבעלי חיים. ניסויים בבעלי חיים נערכו אך ורק בהתאם לפרוטוקול הטיפול בבעלי חיים המאושר (IACUC #245094).
הערה: זני עכברים B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) ו-B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) הושגו באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים) וחצו כדי להשיג Bmi1-Cre ER; Rosa26eYFP (Bmi1ctrl) עכברים, כפי שתואר ק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
השימוש בקרינה הכוללת של 12 Gy (TBI) בשילוב עם מעקב אחר שושלת גנטית של מורין מאפשר ניתוח מעמיק של ההשלכות של פגיעה בקרינה במעיים. כדי להתחיל, Bmi1-CreER; עכברי Rosa26eYFP קיבלו זריקת טמוקסיפן יחידה, הגורמת לביטוי משופר של חלבון פלואורסצנטי צהוב (EYFP) באוכלוסיית תאי גזע מסוג Bmi1+ . יומיים לאחר הזרקת הטמוקסיפן, עברו העכברים הקרנה או הקרנת דמה. שלוש שעות לפני המתת החסד הוזרקו לעכברים EdU. לאחר המתת חסד, דגימות המעי הדק נאספו לניתוח ב 0 שעות, 3 שעות, 6 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר מודל חזק וניתן לשחזור של פגיעות קרינה. זה מאפשר ניתוח מדויק של השינויים אפיתל המעי במהלך 7 ימים לאחר הפציעה. חשוב לציין כי נקודות הזמן שנבחרו משקפות שלבים מכריעים של פציעה ומאופיינות בשינויים מובהקים במעי (שלבי פציעה, אפופטוזיס, התחדשות ונורמליזציה)60. מודל זה של הקרנה נקבע והוערך בקפידה, ומדגים ביטוי מתאים של פגיעה לחיקוי שחווים חולים שעברו הקרנות61. יותר ממחצית החולים בסרטן המעי הגס והחלחולת ובסרטן הגינקולוגי עוברים הקרנות בטן 40,62,63.<.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים.
תודות
המחברים מבקשים להודות לליבת המחקר ההיסטולוגיה של מרכז סטוני ברוק לסרטן על סיוע מומחה בהכנת דגימות רקמה ולמחלקה למשאבי חיות מעבדה באוניברסיטת סטוני ברוק על סיוע בטיפול וטיפול בבעלי חיים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות DK124342 שהוענקו לאגניישקה ב. ביאלקובסקה ו- DK052230 לד"ר וינסנט ו. יאנג.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מזרק 1 מ"ל | BD | ||
| 309659-16G לשימוש חוזר מחטי האכלה לבעלי חיים קטנים: ישר | VWR | 20068-630-27G | |
| x 1/2 אינץ' מחט | BD | ||
| 305109-28G x 1/2 אינץ' מונוject 1 מ"ל מזרק אינסולין | Covidien | ||
| ′-deoxyuridine (EdU) | Santa Cruz Biotechnology | sc284628A | 10 מ"ג/מ"ל ב-DMSO סטרילי: מים (1:4 v/v), יש לאחסן ב-20° סי |
| עזר סיינטיפיק 10% ניטרלי חוצץ פורמלין | פישר סיינטיפיק | 22-026-213-B6.129X1-GT | |
| (ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | זן מעבדת ג'קסון | #:006148 | |
| B6; 129-BMI1TM1(cre/ERT)Mrc/J | זן מעבדת ג'קסון | #:010531 | |
| סרום בקר אלבומין שבר V, הלם חום | Millipore-Sigma | 3116956001 | |
| עוף אנטי-GFP | Aves | GFP-1020 | |
| Click-IT בתוספת ערכת הדמיה EdU Alexa Fluor 555, Invitrogen | Thermo Fisher | Scientific C10638-שמן | |
| תירס | Millipore-Sigma | C8267-Decloaking | |
| Chamber | Biocare Medical | DC2012-דימתיל | |
| סולפוקסיד (DMSO) | פישר ביו-ריאגנטים | BP231-100 | |
| פרוטאינאז ללא DNase | Invitrogen | C10618H מדולל פי 25 ב-DPBS | |
| חמור נגד עוף AF647 | Jackson ImmunoResearch | 703-605-155 | |
| DPBS | פישר מדעי | 21-031-CV-Eosin | |
| Fisher Scientific | S176 | ||
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי Nikon Eclipse 90i אור בהיר וזורם, עם מטרות: 10X, 20X | Nikon | ||
| Fluoromount הרכבה מימית בינונית | Millipore-Sigma | F4680-25ML | |
| תא גמא 40 Exactor | Best Theratronics Ltd. | - | 0.759 Gy min-1goat |
| נגד ארנב AF488 | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| תמיסת המטוקסילין, זימים מס' 3 | Millipore-Sigma | GHS332 | |
| HM 325 מיקרוטום סיבובי מבית Thermo Scientific | Fisher Scientific | 23-900-668 | |
| Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) | Thermo Fisher Scientific | דילול H3569 | 1:1000 |
| תמיסת מי חמצן, ACS, 29-32%, ספקטרום כימי | פישר סיינטיפיק | 18-603-252-ערכת | |
| זיהוי מוות של תאים באתר, פלואורסצאין (Roche) | Millipore-Sigma | 11684795910 חוסם | |
| נוזלים Super PAP PEN, מיני | פישר מדעי | DAI-PAP-S-M | |
| ליתיום קרבונט (אבקה/ACS מוסמך), פישר כימיקל | פישר סיינטיפיק | L119-500 | 0.5 גרם/1 ליטר dH2O |
| Luer-Lok מזרק סטרילי, לשימוש חד פעמי, 10 מ"ל | VWR | 89215-218-מתנול | |
| VWR | BDH1135-4LP | ||
| מוצרי פארמקו אלכוהול אתילי, 200 הוכחה | פישר סיינטיפיק | ||
| 281000ACSCSLT חומצה אצטית ACS כיתה | קפיטול מדעי | AAP-281000ACSCSLT-ארנב | |
| אנטי-Ki67 | BioCare רפואי | CRM325 | |
| ריצ'רד-אלן סיינטיפיק ציטוסיל XYL הרכבה בינונית | פישר סיינטיפיק | 22-050-262 | |
| חממת Scientific Industries-Genie לאפיית שקופיות ב-65 מעלות | Fisher Scientific | 50-728-103 | |
| נתרן ציטראט דיהידראט | פישר סיינטיפיק | S279-500 | |
| ערכת חיתוך נירוסטה | VWR | 25640-002 | |
| Superfrost Plus מיקרו שקופיות [גודל: 25 x 75 x 1 מ"מ] | VWR | 48311-703 | |
| טמוקסיפן | Millipore-Sigma | T5648 | 30 מ"ג/מ"ל בשמן תירס סטרילי, רצוי לאחסון טרי או קצר טווח ב-20° C, |
| מחזיקי Tissue-Tek 24-Slide רגישים לאור עם ידית ניתנת להסרה | Sakura | 4465 | |
| Tissue-Tek אקו-אדג' להבים בפרופיל נמוך | Sakura | 4689 | |
| Tissue-Tek סט צביעת שקופיות ידני | Sakura | 4451 | |
| צלחת מכתים Tissue-Tek, ירוק עם מכסה | Sakura | 4456 | |
| Tissue-Tek צלחת מכתים, לבן עם מכסה | Sakura | 4457 | |
| Tween 20 | Millipore-Sigma | P7949 | |
| קלטות עיבוד Unisette | VWR | 87002-292-VWR | |
| מיקרו כיסוי משקפיים | VWR | 48393-081 | |
| קסילן | פישר סיינטיפיק | X5P-1GAL |
מקורות
- Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
- vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithel....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
