הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד תאי שושלת מונוציטים-מקרופאגים מעצמות חולדות בשיטת הדבקות משנית

3.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64053

⸱

13 ביולי 2022

 ,  ,  ,  , 
1School of Medical Technology and Information Engineering, Zhejiang Chinese Medical University, 2School of Basic Medical Sciences, Fudan University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של BMMs מחולדות SD, הנקרא שיטת ההדבקה המשנית.

תקציר

עם ירידה בצפיפות המינרלים בעצמות, העצמות נוטות יותר להישבר, ובכך משפיעות לרעה על איכות החיים של המטופל. הצמיחה וההתפתחות של העצמות מוסדרות בעיקר על ידי אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים. מקובל לחשוב כי אוסטאוקלסטים מופקים מתאי מונוציטים-מקרופאגים של מח עצם (BMMs). BMMs ותאי גזע המטופויאטיים אחרים ממוקמים בחלל מח העצם. לכן, בידוד BMMs יציבים בודדים מאוכלוסיות תאים שונות והטרוגניות הוא אתגר עצום. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של BMMs מחולדות SD, הנקרא שיטת ההדבקה המשנית. נאספו תאים דביקים בתרבית של 24-48 שעות בתרבית ראשונית. ניתוח ציטומטרי של זרימה הראה כי כ-37.94% מהתאים היו CD11b/c+ (אנטיגן פני השטח של מונוציטים-מקרופאג'). צביעת חומצה פוספטאז (TRAP) עמידה בפני טרטרט וניתוח כתמים מערביים הראו כי BMMs יכולים להבדיל לאוסטיאוקלסטים במבחנה. הממצאים הנ"ל הציעו כי תאי ההדבקה המשניים יכולים להיחשב כמודל תאי מתאים לחקר התמיינות אוסטאוקלסט.

מבוא

דווח כי תאי שושלת מונוציטים-מקרופאגים הקיימים במח העצם יכולים להתמיין למונוציטים בדם ומקרופאגיםשל רקמות 1,2. התאים הנ"ל, שיכולים להתמיין לאוסטיאוקלסטים כדי לאזן את צמיחת העצם והתפתחותה, משמשים בדרך כלל כמודל תאי להשראת אוסטאוקלסטים in vivo 3,4. מח עצם הוא רקמה מיוחדת המכילה מספר סוגים שונים של תאים, הכוללים אך אינם מוגבלים רק לתאי גזע מזנכימליים של מח עצם, תאי מונוציטים-מקרופאג' של מח עצם (BMMs), תאי גזע המטופויאטיים, תאי אנדותל ותאי מערכת החיסון. למעשה, מספר מחקרים קודמים הציעו כי תאים דביקים שמיהרו לצאת מחל מח העצם של העצם הארוכה יכולים להתמיין לאוסטאובלסטים, אוסטאוקלסטים, כונדרוציטים או אדיפוציטים 5,6,7,8. למרות ששיטות בידוד ותרבית שונות שימשו ליצירת אוכלוסיות תאים הומוגניות שונות, עדיין ישנם אתגרים גדולים בבידוד ובגידול BMMs ממגוון סוגי תאים שונים.

מספר שיטות פותחו כדי לחלץ מקרופאגים חד-גרעיניים של מח עצם (BMSCs). עם זאת, רוב השיטות הללו מורכבות 9,10,11. לדוגמה, צנטריפוגת שיפוע צפיפות דורשת ערכה מיוחדת והפעולה גוזלת זמן ומסורבלת. שיטה זו מתאימה לבידוד של BMMs מדגימות דם בנפח גבוה, אך לא מדגימות מח עצם 9,12,13. בנוסף, חילוץ דגימות רקמה באמצעות עיכול קולגן הוא הליך מורכב וגוזל זמן; שיטה זו אינה מומלצת לבידוד של BMMs מדגימות מח עצם14,15. בנוסף, למרות שהפרדת זרימה יכולה לגרום לאוכלוסיות מונוציטים/מקרופאגים מטוהרות מאוד, היא דורשת גודלי מדגם גדולים מאוד ודרישות גבוהות של מכשירים וציוד10,16. בנוסף, שיטת העשרת החיידקים יקרה ביותר ואינה אפשרית במעבדה כללית17.

לכן, במחקר הנוכחי הוצעה שיטה נוחה, מהירה וזולה לבידוד מקרופאגים חד-גרעיניים ממח העצם. תאי מח עצם שנדבקו במשך נקודות זמן שונות שימשו לבידוד BMMs בשיטת הדבקה משנית. BMMs שחולצו בשיטה הנ"ל יכולים לגרום להיווצרות של אוסטאוקלסטים במבחנה, ובכך לספק מודל תאים פשוט ונוח למחקר עתידי של אוסטאופורוזיס במבחנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים במחקר זה נערכו בהתאם להנחיות הניסויים בבעלי חיים של המרכז לחקר בעלי חיים במעבדה של האוניברסיטה הרפואית הסינית בג'ה-ג'יאנג (מספר אישור: IACUC-20181029-11).

1. מיצוי תאים

  1. שים את חולדות ספראג-דאולי (חולדות SD, בנות 1-10 ימים, זכר או נקבה) בכלובי המתת חסד מלאים ב- CO2 בקצב מאוזן של 30%-70% נפח מיכל לדקה. לאחר שהחולדות מאבדות את הכרתן (20-60 דקות), המתות את החולדה על ידי נקע צוואר הרחם כדי להבטיח מוות ללא כאבים.
  2. לטבול את החולדות ב 75% אלכוהול במשך 10 דקות לחיטוי.
  3. בזהירות להסיר את כל הגפיים של החולדה עם מספריים ומלקחיים, לשאוף עם PBS באמצעות פיפטה לשטוף את הדם הידבקות לגפיים.
  4. מוסיפים 5 מ"ל של תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין ל-500 מ"ל של DMEM ומערבבים היטב. קח צינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל, הוסף 5 מ"ל של FBS ו-45 מ"ל של מדיום DMEM, וערבב ביסודיות כדי לקבל 10% FBS DMEM המכיל תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין של 1%. הוסף 2 מ"ל של מדיום התרבית הנ"ל לתוך צינור 5 מ"ל.
  5. מעבירים את עצמות הגפיים לצינור 5 מ"ל. השתמשו במספריים כדי לחתוך את עצמות הגפיים בצינור לחתיכות קטנות (1-3 מ"מ) וערבבו את ההומוגנאט כדי להשעות מחדש את תאי מח העצם לתוך מדיום התרבית. יש לעמוד במשך 5 דקות עד ששברי הרקמה התיישבו לתחתית הצינור.
  6. הוסיפו 10 מ"ל של 10% FBS DMEM לתבשיל תרבית של 100 מ"מ, ולאחר מכן העבירו את ה-supernatant למנת התרבית. כאשר שואפים לסופרנאטנט, הימנעו מהעברת פסולת הרקמה לתוך צלחת התרבית.
  7. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך כ-24 שעות. לאחר זמן הדגירה הזה, רוב תאי הגזע המזנכימליים ידבקו בדופן התרבית ויגדלו לאט, בעוד שרוב תאי ה-BMM עדיין יושעו במדיום התרבית.
  8. מעבירים את תרחיף התאים בצלחת תרבית 100 מ"מ לבקבוקון חדש של25 ס"מ 2 וממשיכים לטפח את התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 24 שעות נוספות. הסר את המדיום הישן בזהירות והחלף במדיום טרי לאחר ש- BMMs נדבקו לקיר הבקבוקון.
  9. תת-תרבית כאשר התאים בבקבוק הגיעו ל-80%-90% מפגש.
    הערה: כל התאים עברו תרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. במהלך התרבית, המורפולוגיה של התא אוחדה בהדרגה. התאים היו גדולים, בעלי צורה לא סדירה, גדלו באופן רדיאלי והתחברו לבקבוקון בצורה של דיסק, שם ניתן היה להבחין במספר גרעינים.

2. צביעת FACS של התא

  1. טריפסין מעכלים באמצעות 1-2 מ"ל של טריפסין מסחרי ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 5 דקות וסופרים תאים דביקים משניים כדי להבטיח ספירת תאים סופית של 100,000/דגימה (ספירת תאים עם המוציטומטר של נויבאואר).
  2. חלק את התאים לשלוש קבוצות (500 μL של PBS מכיל 100,000 תאים): (1) קבוצת הביקורת הריקה המכילה תאים לא מוכתמים; (2) קבוצת הביקורת האיזוטיפית; ו-(3) קבוצת הניסוי (צביעת CD11b/c).
  3. הדגירה של נוגדנים ראשוניים (ללא נוגדן לקבוצת הביקורת הריקה; בקרת איזוטיפ אנטי-CD11 לקבוצת הביקורת האיזוטיפית, 0.6 μL של נוגדן/דגימה, 1 מיקרוגרם/דגימה; אנטי CD11b/c לקבוצת הניסוי, 1 μL של נוגדן/דגימה, 1 מיקרוגרם/דגימה) על קרח למשך 30 דקות.
  4. צנטריפוגה ב 300-350 x g במשך 5 דקות, להשליך את supernatant, ולהחיות את התאים עם 500 μL של PBS. חזור על ההליך לעיל פעם אחת כדי להבטיח שהנוגדנים הראשוניים הלא מאוגדים נשטפים.
  5. הדגירה של הנוגדן המשני המתאים (ללא נוגדן לקבוצת הביקורת הריקה; IgG נגד ארנב עזים לבקרת האיזוטיפ ולקבוצות הניסוי, 0.25 μL נוגדנים/דגימה, 1:2,000) על קרח בחושך למשך 30 דקות.
  6. צנטריפוגה ב 300-350 x g במשך 5 דקות, להשליך את supernatant, ולהחיות את התאים עם 500 μL של PBS. חזור על ההליך הנ"ל פעם אחת כדי להבטיח שהנוגדנים השניים הלא מאוגדים נשטפים.
  7. זהה את התאים החיוביים CD11b/c על ידי ציטומטריית זרימה (10,000 תאים/דגימה) ונתח את הנתונים לפי תוכנה (לדוגמה, FlowJo 7.5).
    הערה: כדי לקבל את האחוז הסופי של תאי CD11b/c+, נעשה שימוש בנוסחה הבאה: אחוז תאי CD11b / c + בקבוצת הניסוי - אחוז תאי CD11 + בקבוצת הביקורת האיזוטיפית.

3. רייט-גימסה מכתים

  1. זרעו את התאים המשניים הדביקים שהועברו שלוש פעמים על יריעות טיפוס של 35 מ"מ2 תאים (1 × 106 תאים/באר) ותרבית ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 24 שעות.
  2. יש להשליך את מדיום התרבות ולשטוף שלוש פעמים עם PBS.
  3. הוסף את תמיסת הצבע Wright-Giemsa (0.5 מ"ל-0.8 מ"ל) ליריעת טיפוס התאים למשך דקה אחת.
  4. מערבבים את הצבע עם מים מזוקקים (0.5 מ"ל-0.8 מ"ל) עם צמר גפן, ועומדים על 10 דקות.
  5. לשטוף את תמיסת הצבע עם מים מזוקקים, ולאחר מכן יבש במשך 1-3 דקות. התבונן תחת מיקרוסקופ.

4. צביעת מלכודת

  1. זרעו את התאים המשניים הדביקים שהועברו שלוש פעמים על יריעות טיפוס של 35 מ"מ2 תאים (1 × 106 תאים/באר) ותרבית ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 24 שעות.
  2. החלף את המדיום הישן ב- 10% FBS DMEM או מדיום אינדוקציה אוסטאוקלסט בתוספת מפעיל קולטן 50 ננוגרם / מ"ל של ליגנד פקטור גרעיני - κB (RANKL) ו- 30 ng / mL של גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF), ותרבית ב - 37 ° C ו - 5% CO2 למשך 7 ימים נוספים.
  3. הכתימו את התאים בערכת ההכתמה TRAP על פי פרוטוקול היצרן והתבוננו תחת מיקרוסקופ.
    הערה: תאים חיוביים ל-TRAP הוגדרו כאוסטאוקלסטים, שהיו סגולים תחת מיקרוסקופ אור. מספר התאים החיוביים ל-TRAP נמדד באמצעות תוכנת ImageJ.

5. כתם מערבי

  1. זרעו את התאים המשניים הדבקים שהועברו שלוש פעמים על יריעות טיפוס של 35 מ"מ מ"מ2 תאים (1 × 106 תאים/באר) ותרבית במשך 24 שעות.
  2. החלף את המדיום הישן ב-10% FBS DMEM או מדיום אינדוקציה אוסטאוקלסט (50 ננוגרם/מ"ל של RANKL ו-30 ננוגרם/מ"ל של M-CSF) ותרבית למשך 7 ימים נוספים ב-37°C ו-5% CO2.
  3. יש לחלץ את סך החלבונים התאיים עם מאגר RIPA, בנפרד ב-10% SDS-PAGE, ולהעביר לקרומי פלואוריד פוליווינילידן18,19.
  4. יש לחסום עם 5% אבקת סקימילק (25 מ"ל) למשך שעתיים ולשטוף שלוש פעמים, למשך 10 דקות בכל פעם, עם TBS-Tween 20 (TBST).
  5. הדגירה של נוגדנים ראשוניים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה (נוגדת β-אקטין, אנטי-טראפ ואנטי-קתפסין K; כל הנוגדנים הראשוניים היו מדוללים ב-1:1,000, 10 מ"ל נוגדנים/פסים מדוללים, ושטפו שלוש פעמים עם TBST.
  6. דגירה של הנוגדן המשני (IgG נגד ארנב עזים, 1:2,000 דילול, 10 מ"ל נוגדן מדולל/ פס) בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות, ושטוף שלוש פעמים עם TBST. דמיינו את רצועות החלבון באמצעות תמיסה מתפתחת.
    הערה: רמות הביטוי של החלבונים הנ"ל היו מנורמלות β-אקטין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אוכלוסיית התאים החסידיים המשניים הייתה יציבה ואחידה. עם התפשטות התאים המתמשכת, רוב התאים נעשו גדולים יותר, בעלי צורה לא סדירה וגדלו לדיסק דבק רדיאלי (איור 2C,D). ציטומטריית זרימה הראתה שאחוז התאים המבטאים CD11b/c, סמן מולקולרי על פני השטח של תאי שושלת מונוציטים-מקרופאגים, היה כ-37.94% (איור 2A,B). כדי לוודא עוד יותר שהתאים החיוביים ל-CD11b/c היו תאי שושלת מונוציטים-מקרופאגים, הושרה התמיינות של תא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אוסטאוקלסטים הם אחד מסוגי התאים המשמעותיים ביותר המעורבים בהתרחשות ובהתפתחות של מחלות עצם, כמו גם אחד האובייקטים העיקריים של מחקר מחלות עצם20. מונוציטים/מקרופאגים יכולים להבדיל לאוסטיאוקלסטים. מאחר שמקרופאגים מונו-גרעיניים (תאי RAW264.7) יקרים מדי לרכישה ומופעלים בקלות במהלך תרבית, קשה לבצע ניסויי התמיינות חוץ גופית באמצעות קו תאים זה. למרות שפותחו מספר שיטות לחילוץ מונוציטים/מקרופאגים ממח העצם, כולל צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, עיכול קולגןאז, העשרת מיקרוספרה וציטומטריית זרימה (טב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג (מענק מס' LY19H060001) ופרויקט תוכנית המדע והטכנולוגיה של הרפואה הסינית המסורתית בג'ה-ג'יאנג (מס' 2022ZB093).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
35 מ"מ2 פרוסות טיפוס תאיםNEST ביוטכנולוגיה80102
אנטי קטפסין KAbcamab190271:1,000
בקרת איזוטיפ אנטי-CD11Abcamab1727301 μ גרם/בדיקה, 1.675 מ"ג/מ"ל
אנטי-CD11b/cאבסיןabs124232  1μ גרם/בדיקה, 1 מ"ג/מ"ל
Anti-TRAPAbcamab1914061:1,000
אנטי-&בטא;-אקטיןביוטיים  AF50031:1,000
פרוסות טיפוס תאיםNEST ביוטכנולוגיה80102
צלחת תרבית תאים430167
קורנלינגבקבוק תרבית תאים430168
מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM)GibcoC11995500BT
סרום בקר עוברי (FBS)Gibco10099141C
עז נגד ארנב IgGAbcamab150077עבור IF, 1:2,000
עז אנטי ארנב IgGAbcamab6721עבור WB, 1:2,000
M-CSFPepro tech400-28
PBSBiosharpBL302A
RANKLPepro tech400-30
SD חולדהשנחאי SLAC מעבדה בעלי חיים ושות', בע"מ1-10 ימים
SDS-PAGE ג'ל הכנת ערכתSolarbioP1200
TRAP/ALP מכתיםערכת Wako294-67001
Trypsin-EDTA פתרוןBiosharpBL512A
רייט-Giemsa פתרוןKeygen BiotechKGA225-1

מקורות

  1. Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).
  2. Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity. Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).
  3. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  4. Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
  5. Zhou, X., et al. Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells. Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).
  6. Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).
  7. Li, Z., MacDougald, O. A. Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity. Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).
  8. Horowitz, M. C., et al. marrow adipocytes. Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).
  9. Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice. Journal of Visualized Experiments. (131), e56750(2018).
  10. Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).
  11. Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).
  12. Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).
  13. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).
  14. Yu, Y. R., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).
  15. Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes. Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).
  16. Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).
  17. Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
  18. Higashi, S. L., et al. Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology. Journal of Visualized Experiments. (163), e61657(2020).
  19. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759(2008).
  20. Yin, Z., et al. Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways. European Journal of Pharmocology. 859, 172550(2019).
  21. Liu, F., et al. LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss. Redox Biology. , (2021).
  22. Jin, X., et al. Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TRAP
בידוד תאי שושלת מונוציטים-מקרופאגים מעצמות חולדות בשיטת הדבקות משנית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.