מאמר שיטה

הכנת חלקיקי ליבה נוקלאוזומים מורכבים עם גורמי תיקון DNA לקביעת מבנה במיקרוסקופ קריו-אלקטרונים

DOI:

10.3791/64061

⸱

17 באוגוסט 2022

 ,  ,  ,  , 
1Genome Integrity and Structural Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את הכנת קומפלקסים נוקלאוזומליים באמצעות שתי שיטות להכנת דגימה להקפאת רשתות TEM.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיקון DNA בהקשר של כרומטין אינו מובן היטב. מחקרים ביוכימיים המשתמשים בחלקיקי ליבה נוקלאוזומים, היחידה החוזרת הבסיסית של כרומטין, מראים שרוב אנזימי תיקון הדנ"א מסירים נזק לדנ"א בקצב מופחת בהשוואה לדנ"א חופשי. הפרטים המולקולריים על האופן שבו אנזימים לתיקון כריתת בסיס (BER) מזהים ומסירים נזק לדנ"א בנוקלאוזומים לא הובהרו. עם זאת, נתוני BER ביוכימיים של סובסטרטים נוקלאוזומליים מצביעים על כך שהנוקלאוזומים מציגים מחסומים מבניים שונים התלויים במיקום נגע הדנ"א והאנזים. הדבר מצביע על כך שהמנגנונים שבהם משתמשים אנזימים אלה כדי להסיר נזק לדנ"א בדנ"א חופשי עשויים להיות שונים מאלה המופעלים בנוקלאוזומים. בהתחשב בכך שרוב הדנ"א הגנומי מורכב לנוקלאוזומים, יש צורך במידע מבני של קומפלקסים אלה. נכון להיום, הקהילה המדעית חסרה פרוטוקולים מפורטים לביצוע מחקרים מבניים אפשריים מבחינה טכנית של קומפלקסים אלה. כאן, אנו מספקים שתי שיטות להכנת קומפלקס של שני אנזימי BER מאוחים גנטית (פולימראז β ואנדונוקלאז AP1) הקשורים לפער נוקלאוטיד יחיד ליד הכניסה והיציאה של הנוקלאוזום, לצורך קביעה מבנית של מיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים (cryo-EM). שתי שיטות הכנת הדגימה תואמות לזיגוג רשתות איכותיות באמצעות הקפאת צלילה. פרוטוקול זה יכול לשמש כנקודת מוצא להכנת קומפלקסים נוקלאוזומליים אחרים עם גורמי BER שונים, גורמי שעתוק חלוציים ואנזימים משנים כרומטין.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דנ"א אאוקריוטי מאורגן ודחוס על ידי חלבוני היסטון, היוצרים כרומטין. חלקיק הליבה הנוקלאוזומי (NCP) מהווה את היחידה החוזרת הבסיסית של הכרומטין המווסתת את הנגישות לחלבונים קושרי DNA לצורך תיקון, שעתוק ושכפול DNA1. למרות שהמבנה הגבישי הראשון של קרני רנטגן של NCP נפתר לראשונה לפני יותר משני עשורים2 ומבנים רבים נוספים של NCP פורסמו מאז 3,4,5,6, מנגנוני תיקון DNA במצעים נוקלאוזומליים עדיין לא הוגדרו. חשיפת הפרטים המולקולריים העומדים בבסיס תיקון הדנ"א בכרומטין תדרוש אפיון מבני של המרכיבים המשתתפים כדי להבין כיצד תכונות מבניות מקומיות של NCP מווסתות את פעילויות תיקון הדנ"א. זה חשוב במיוחד בהקשר של תיקון כריתת בסיס (BER) בהתחשב בכך שמחקרים ביוכימיים עם אנזימי BER מציעים מנגנוני תיקון DNA ייחודיים בנוקלאוזומים התלויים בדרישות מבניות ספציפיות לאנזים לקטליזה ובמיקום המבני של נגע ה- DNA בתוך הנוקלאוזום: 7,8,9,10,11,12,13 . בהתחשב בכך ש-BER הוא תהליך חיוני לתיקון DNA, יש עניין רב למלא פערים אלה תוך יצירת נקודת מוצא שממנה ניתן לבצע מחקרים מבניים אפשריים מבחינה טכנית אחרים הכוללים קומפלקסים נוקלאוזומליים רלוונטיים.

Cryo-EM הופכת במהירות לשיטת הבחירה לפתרון המבנה התלת מימדי (3D) של קומפלקסים שההכנה בקנה מידה גדול של מדגם הומוגני מאתגרת. אמנם, התכנון והטיהור של NCPs מורכבים עם גורם תיקון DNA (NCP-DRF) ככל הנראה ידרוש אופטימיזציה מותאמת, ההליך המוצג כאן כדי ליצור ולהקפיא קומפלקס NCP-DRF יציב מספק פרטים על איך לייעל את הדגימה ואת הכנת רשת cryo-EM. שתי זרימות עבודה (שאינן סותרות זו את זו) המוצגות באיור 1, והפרטים הספציפיים בפרוטוקול מזהים שלבים קריטיים ומספקים אסטרטגיות למיטוב שלבים אלה. עבודה זו תניע את תחום תיקון הכרומטין והדנ"א לכיוון שבו השלמת מחקרים ביוכימיים עם מחקרים מבניים הופכת לאפשרית מבחינה טכנית כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים של תיקון דנ"א נוקלאוזומי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הרכבת חלקיקי ליבה נוקלאוזומים באמצעות דיאליזה מלחית

הערה: הכנת חלקיקי ליבה נוקלאוזומים באמצעות חלבוני היסטון רקומביננטיים למחקרים מבניים תוארה בפירוט רב על ידי אחרים14,15,16. בצע את הטיהור של היסטונים רקומביננטיים X. laevis והרכבת אוקטמר היסטון המתוארים על ידי אחרים14,15, והרכיב את המצע הנוקלאוזומלי כמתואר להלן.

  1. רכוש שלושה אוליגונוקלאוטידים (המפורטים בטבלה 1) בקנה המידה שצוין: UND-197mer, 161mer, 35mer.
    1. PAGE לטהר אולטרמרים (197mer ו-161mer) כמתואר17.
      1. כמויות שקולות אנליות של אוליגונוקלאוטידים בחיץ חישול 1x (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 50 mM NaCl). לדוגמה, לערבב 40 μL של 161-mer [166.7 μM]; 8 μL של 35-mer [292.4 μM]; 16.8 μL של גדיל קומפ 197-mer [408.2 מיקרומטר]; 10 μL של 10x חיץ אנאלי ו 10.9 μL של dH2O.
        הערה: קריטי לשלוט בתגובת החישול באמצעות שיפוע טמפרטורה. ראו טבלה 2 לפרטים על שיפוע הטמפרטורה.
  2. בצעו שינויים בקנה מידה קטן (קנה מידה של 1/57 מהדוגמה המוצגת להלן עבור נפח סופי של 50 μL) כדי לקבוע את היחס בין דנ"א לאוקטמר היסטון (יחסי התחלה אופייניים של DNA:octamer הם כדלקמן: 1:0.9, 1:1.1, 1:1.2, 1:2; מוצג באיור 2A); זה קריטי לקבוע את היחס הזה באופן אמפירי עם קונסטיטוציות מחדש בקנה מידה קטן.
    1. לאחר קביעת יחס זה, הכינו קונסטיטוציה מחדש בקנה מידה גדול. לדוגמה, לערבב 32.9 μL של DNA-197 bp [99.4 μM]; 1647.1 מיקרוליטר של TE (1x); 1120 μL של 5 M NaCl, ו-62.3 μL של אוקטמר היסטון WT [2.56 μM].
  3. יצירת מאגרי דיאליזה: RBנמוך ו-RBגבוה כמתואר בטבלה 3 ובטבלה 4, בהתאמה; לקבוע את החוקות מחדש כפי שתואר קודם14.
    1. מעבירים את צינור הדיאליזה לתוך הכד המכיל RBגבוה, ומאפשרים לדיאליזה להמשיך, תוך ערבוב עדין, למשך 16 שעות או עד ש-2 ליטר RBנמוך מועבר לכד הפסולת.
  4. העבירו את צינור הדיאליזה לתוך 1 ליטר המכילה חיץ RB50mM (טבלה 5) ואפשרו לדגימה להתנתק למשך 3 שעות לפחות או למשך הלילה.
    1. להעריך את יעילות ההרכבה מחדש על ג'ל 6% פוליאקרילאמיד nondenaturing, להבטיח שיש פחות מ 10% DNA חופשי ופס NCP יחיד; יש לאחסן NCPs בטמפרטורה של 4°C. ראו איור 2A (נתיב 5) ואיור 2B לקבלת תוצאות מייצגות של בנייה מחדש אופטימלית.

2. הכן קומפלקס גורם תיקון NCP-DNA (NCP-DRF)

  1. טיהור על ידי אלקטרופורזה ג'ל הכנה
    הערה: שיטה זו היא עתירת העבודה ביותר (מבין השתיים המתוארות), ובעוד שהיא יעילה בהסרת מינים בעלי משקל מולקולרי גבוה (HMW) (איור 6A) בגלל גורם הדילול הגבוה, זה יכול להוביל לפירוק מסוים כפי שמוצג ב איור 7A (NCP prep cell out lane), שחרור DNA. עם זאת, עד 25% DNA חופשי עדיין תואם למחקרי cryo-EM. בגלל הדילול הגבוה, השתמש בשיטה זו כדי לטהר את NCP בלבד, ולא את כל המכלול.
    1. הכן 70 מ"ל של 6% תמיסת ג'ל פוליאקרילאמיד ללא דנטורציה ב- 0.2x TBE, באמצעות תמיסת ג'ל פוליאקרילאמיד 37.5:1, אקרילאמיד:ביסקרילאמיד. יוצקים ג'ל גלילי עם רדיוס חיצוני של 28 מ"מ ומתפלמרים לילה.
    2. להרכיב את מנגנון הפעלת הג'ל המכין, באמצעות קרום דיאליזה עם חתך 6-8 kDa MW. השתמש ב- 0.25x TBE כמאגר הריצה ובמאגר אלוציה אחד (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7.5). הפעילו מראש את הג'ל הגלילי בהספק קבוע של 12W למשך שעה אחת, ואספו שברים המפעילים את המשאבה הפריסטלטית בקצב זרימה של כ-1 מ"ל/דקה.
      הערה: אם גלאי UV אינו זמין לזיהוי שברים המכילים DNA, ניתן לבצע ניסוי סינון עם 32P-NCP כדי לזהות את שברי העניין. שמירה על כל התנאים זהים, NCPs ללא תווית לאחר מכן ניתן לטהר ללא גלאי UV.
    3. רכז את 2.8 מ"ל של NCP ל 250 μL באמצעות מסנן צנטריפוגלי (MW לחתוך 30 kDa), ולטעון על ג'ל הכנה אלקטרופורזה במשך 6 שעות בסך הכל. בשעה 2 שעות, כאשר ציאנול xylene נגמר של הג'ל, להתחיל לאסוף 1.5 מ"ל שברים.
      הערה: בשעה 2.5 שעות, שברים יהיו נקיים מקסילן ציאנול; הדנ"א (197mer) נפלט בערך 3-3.5 שעות, וה-NCP צפוי להיפלט ב-4.5-5 שעות.
    4. לנתח שברים של עניין על 6% nondenaturing פוליאקרילאמיד ג'ל. שברי בריכה המכילים את NCP, ומיד להתרכז עם מסנן צנטריפוגלי (MW לחתוך 30 kDa) ל 1 מ"ג / מ"ל. למחרת, להעריך את האיכות של NCP על 6% פוליאקרילאמיד nondenaturing ג'ל לפני קומפלקס עם גורם תיקון DNA (DRF) של עניין.
    5. לדגור את NCP ואת DRF של עניין על קרח במשך 15 דקות באמצעות חיץ אופטימלי עבור קומפלקס ספציפי. לדוגמה, ערבבו 1,000 מיקרוליטר של NCP [1.2 מיקרומטר]; 260 μL של 5x חיץ מחייב (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2), 22 μL של 3 M KCl, ו 18 μL של MBP- Pol β-APE1 [338 μM].
      הערה: הטמפרטורה והחוזק היוני שבו מורכב מורכב עשוי להזדקק אופטימיזציה עבור קומפלקסים שונים.
    6. מוסיפים גלוטראלדהיד (נפתח טרי; ציון EM) לריכוז סופי של 0.005%. לכן, לתגובה זו, להוסיף 26.8 μL של 0.25% גלוטראלדהיד עם 13.2 μL של dH2O. מערבבים היטב, ודגרים בטמפרטורת החדר במשך 13 דקות.
    7. להרוות עם 1 M Tris-Cl, pH 7.5, לריכוז סופי של 20 mM Tris-Cl, pH 7.5. רכז ל~50 μL והחלף את החיץ עם מאגר הקפאה 1x: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7.5 באמצעות עמודת התפלה.
      אזהרה: גלוטראלדהיד עלול לגרום לכוויות חמורות בעור ולנזק לעיניים; זה מזיק אם נבלע, וזה רעיל אם נשאף. יש ללבוש מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ולטפל בגלוטראלדהיד במכסה מנוע מנדף ולעטות מסכה.
      הערה: קריטי לבצע את תגובת ההצלבה בנפח גדול עם NCP בריכוז נמוך זה. ניסיונות קודמים של crosslinking, אפילו בריכוז זה של גלוטראלדהיד, אך בריכוז גבוה פי 10 של NCP הובילו לצבירה של הדגימה ולהצלבת יתר כפי שמצוין על ידי SDS PAGE וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. ברשתות האלה לא היו חלקיקים שניתן להבחין בהם עם גושים בלבד (איור 5D,E).
    8. קבע את הספיגות ב-OD 280 וב-OD 260 והתרכז עוד יותר במידת הצורך כדי להגיע ל-1.3-3 מ"ג/מ"ל, בהתבסס על OD 280 (יחס אופייני של OD260/ OD 280= 1.7-2 מניב חלקיקים טובים). עבור נפח קטן זה של 50 μL, השיטה הטובה ביותר כדי להפחית את אובדן הדגימה היא לעשות כפתור דיאליזה עם מכסה של צינור 1.7 מ"ל מכוסה על ידי קרום דיאליזה (6-8 kDa MW חתך), לחתוך את החלק התחתון של הצינור ולהשתמש בשפה של הצינור כדי לאטום את הממברנה על גבי המכסה.
    9. הניחו את כפתור הדיאליזה המכיל את הדגימה על גבי מצע פוליאתילן גליקול, כאשר הממברנה פונה כלפי מטה (בדקו את ההתקדמות כל 2 דקות). שיטה זו מועדפת כאשר הריכוז הדרוש קטן או שווה פי 2.5 כדי למנוע דילול או איבוד הדגימה במרכז. זה קריטי להכין מיד רשתות cryo-EM של המתחם לאחר שלב זה.
  2. טיהור לפי גודל לא כולל כרומטוגרפיה
    1. יום לפני ההקפאה, יש לשטוף ולאזן עמוד אי הכללת גודל עם 60 מ"ל של dH2O, ואחריו 80 מ"ל של חיץ הקפאה (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) למשך הלילה בקצב של 0.4 מ"ל/דקה. באמצעות NCPs מיד לאחר הרכבה מחדש, להכין את אותו קומפלקס באמצעות כמויות גדולות פי 2.5 כדלקמן: לערבב 2,500 μL של NCP [1.2 מיקרומטר]; 650 μL של 5x חיץ קשירה; 45 μL של MBP-Pol β-APE1 [338 μM] ו-55 μL של 3M KCl.
    2. דוגרים על התערובת על קרח ללא קרוסלינקר במשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסף גלוטראלדהיד לריכוז סופי של 0.005% כמתואר בשיטת הג'ל המכין. במקרה זה, לעומת זאת, רכז את הקומפלקס במסנן צנטריפוגלי מאוזן מראש (עם חיץ הקפאה) לכ- 120 μL.
    3. נתחו מיד את שברי השיא ורכזו את השברים המכילים את ההיסטונים ואת MBP-Pol β-APE1 כפי שצוין קודם לכן. ראו איור 5A,B,C לקבלת תוצאות מוצלחות בשיטת אי-הכללת הגודל ובאיור 7 בשתי השיטות.

3. להקפיא קומפלקס נוקלאוזומלי

  1. לאחר הפעלת מקפיא צלילה ומילוי מכשיר האדים עם 50 מ"ל של dH2O, להגדיר את טמפרטורת החדר ל 22 ° C ו HR (לחות) ל 98%. הניחו את האתאן ואת החנקן הנוזלי (המכילה קופסת רשת מסומנת) במחזיקי החלל שלהם.
  2. כסו את האתאן במתקן למכסה אתאן, ושפכו עליה בזהירות חנקן נוזלי (LN2), תוך מילוי LN 2 ב-LN2. כאשר רמת LN2 התייצבה ומגיעה ל -100% וטמפרטורה של -180 מעלות צלזיוס, פתח בזהירות את שסתום האתאן ומלא את האתאן עד שהוא יוצר בועה על המכסה השקוף. הסר את מתקן אתאן.
  3. הניחו שני ניירות סינון על מכשיר הניקוי והדקו אותם באמצעות טבעת מתכת. עבור אל ההגדרה והשתמש בפרמטרים הבאים עבור blotting: 0 pre-blot, 3 s blot, 0 post-blot; בחר A-plunge ולחץ על אישור.
  4. במסך הראשי, לחצו על Load Crups, וטענו אותם ברשת כאשר צד הפחמן/יישום פונה שמאלה (מוכן כמו קודם). כייל את המלקחיים תוך התאמת ציר Z כדי להבטיח כתם מוצק. לחץ על החדר התחתון ולהחיל 3 μL של המתחם (1.3-3 מ"ג / מ"ל; OD280). לחץ על Blot/A-plunge. פעולה זו תסובב את הרשת לכתם מהחזית ותצלול להקפיא אותה.
  5. העבר ואחסן את הרשת בתיבת הרשת בתא LN2 . לאחר שכל ארבע הרשתות הוקפאו והונחו בתיבת הרשת, סובבו את המכסה למצב נייטרלי, שבו כל הרשתות מכוסות על ידי המכסה, והדקו את הבורג. ניתן לאחסן רשתות ב- LN2 עד לתחילת ההקרנה.

4. רשתות מסך

  1. לפני טעינת הדגימות במיקרוסקופ, הניחו את הרשתות המזוגגות על טבעת ואבטחו אותן באמצעות קליפ C. בצע תהליך חיתוך זה תחת LN2 בחדר מבוקר לחות, כדי למנוע זיהום קרח.
  2. בעת טעינת המיקרוסקופ, הכנס את הרשתות לקלטת של 12 חריצים. העבר את הקלטת לתוך קפסולת ננו-תא וטען אותה לטוען האוטומטי. המנגנון הרובוטי autoloader יוזם את התהליך.
  3. מעבירים את הרשת מהקלטת לשלב המיקרוסקופ. התאימו את הבמה לגובה אאוצנטרי על ידי נדנוד השלב ב-10° והזזת גובה Z בו-זמנית עד להזזה מישורית מינימלית בתמונות.
  4. לאחר שמגיעים לגובה האוצנטרי, התחל בהדמיה. ראשית, השג את האטלס על ידי צילום תמונת מונטאז' בגודל 3X3 של הרשת, שבה כל מונטאז' מצולם בהגדלה של פי 62. בחר שלושה ריבועים בגדלים שונים; צלם את הגובה האוצנטרי ולאחר מכן צלם בהגדלה של 210x.
  5. לאחר יצירת תמונה של ריבוע, בחרו חור אחד מכל אחד מהשוליים, מהמרכז וביניהם בתוך הריבועים. דמיינו כל חור בהגדלה של 2600x.
  6. לפני צילום תמונה בהגדלה גבוהה זו, המיקוד האוטומטי מתרחש בהסטה של אזור ההדמיה. צלם את תמונת ההגדלה הגבוהה ממרכז החור בהגדלה של 36,000x ובזמן חשיפה של 7.1 שניות, 60 פריימים, גודל של 1.18 פיקסלים וביטול מיקוד של 3 מיקרומטר. ראו תמונות מייצגות של ההקרנה באיור 5, איור 6 ואיור 7.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NCPs שהורכבו כראוי (איור 2) שימשו ליצירת קומפלקס עם חלבון היתוך רקומביננטי של MBP-Polβ-APE1 (איור 3). כדי לקבוע את היחס בין NCP ל-MBP-Polβ-APE1 ליצירת קומפלקס יציב, ביצענו מבחני הסטת ניידות אלקטרופורטית (EMSA) (איור 4), שהראו פס מוזז יחיד של NCP עם עודף מולארי של פי 5 של MBP-Polβ-APE1. במהלך האופטימיזציה של הפיכת קומפלקס זה, crosslinking עם glutaraldehyde היה קריטי כדי למנוע NCP להתפרק. בתחילה, הרכבה של קומפלקס NCP-Polβ-APE1 בוצעה ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול ספציפי לטיהור גורם תיקון ה- DNA יהיה תלוי באנזים המעניין. עם זאת, ישנן כמה המלצות כלליות, כולל שימוש בשיטות רקומביננטיות לביטוי וטיהור חלבונים18; אם החלבון המעניין קטן מדי (<50 kDa), קביעת המבנה על ידי cryo-EM הייתה כמעט בלתי אפשרית עד לאחרונה באמצעות שימוש במערכות היתוך19, פיגומים קושרי ננו-גוף20, ואופטימיזציה של אסטרטגיות הדמיה21.

זה די נפוץ להשיג רשתות באיכות ירודה בשלבים הראשונים. ניסיו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר מריו בורגניה מליבת cryo-EM במכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה ולד"ר ג'ושוע שטראוס מאוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל על ההדרכה וההכשרה שלהם בהכנת רשת cryo-EM. אנו מודים גם לד"ר Juliana Mello Da Fonseca Rezende על הסיוע הטכני בשלבים הראשונים של פרויקט זה. אנו מעריכים את תרומתם ותמיכתם העיקרית של ד"ר סמואל וילסון המנוח וחברי מעבדתו, במיוחד ד"ר רג'נדרה פראסאד וד"ר ג'ונאס ג'מסן לטיהור קומפלקס APE1-Polβ המאוחה גנטית. המחקר נתמך על ידי תוכנית המחקר Intramural של המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה [מספרי מענק Z01ES050158, Z01ES050159 ו- K99ES031662-01].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 מ' HEPES; pH 7.5תרמו פישר סיינטיפיק15630080
1 מ' MgCl2Thermo Fisher ScientificAM9530G
10x TBEBio-rad1610733
25% glutaraldehydeFisher Scientific50-262-23
3 M KClThermo Fisher Scientific043398.K2
491 תא הכנהמסנן צנטריפוגלי Bio-rad1702926
Amicon Ultra 15 (חיתוך MW 30 kDa)Millipore SigmaZ717185
Amicon Ultra 4 (MW cutoff 30 kDa)Millipore SigmaUFC8030
AutoGrid פינצטהטד פלה47000-600
מקפיא צלילה אוטומטיLeicaLeica EM GP
C-1000 מגע thermocyclerBio-rad1851148
C-clamps וטבעותThermo Fisher6640--6640
תחנת גזירהSubAngostromSCT08
ממברנת דיאליזה (MW cufoff 6-8 kDa)פישר סיינטיפיק15370752
פינצטה יהלומיםTechni-Pro758TW0010
dsDNADNA משולב טכנולוגיותN / A
FEI טיטאן קריוסתרמו פישרKRIOSG4TEM
FPLC מערכת טיהורAKTA
דגם 2110Bio-rad7318122
זוהר מערכת ניקוי פריקתטד פלה91000S
תיבות רשתSubAngostromPB-E
חבילת אביזרי אחסון רשתSubAngostromGSAX
אתאן נוזליN/AN/A
חנקן נוזליN/AN/A
Minipuls 3 משאבה דו-ראשית פריסטלטיתGilsonF155008
NanodropThermo Fisher ScientificND-2000
Novex 16%, Tricine, 1.0 מ"מ, מיני ג'ל חלבוןThermo פישר סיינטיפיקEC6695BOX
פיפטמןגילסוןFA10002M
קצות פיפטה (VWR) תמיסתVWR76322-528
37.5:1)פוליאתילן גליקול 1610158
(PEG)Millipore SigmaP4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500Millipore Sigma
גורם תיקון DNA רקומביננטי מטוהרN/A N/A
R 1.2/1.3 Cu 300 רשתות רשתQuantifoilN1-C14nCu30-01
אוקטמר היסטון רקומביננטיN/AN/
כלי חיתוך קפיץSubAngostromCSA-01
Superdex 200 עמודה 10/300Millipore SigmaGE28-9909-44
שידור אלקטרונים מיקרוסקופתרמו פישרTalos Arctica 200 קילו וולט
פינצטה הרכבה עבור FEI Vitrobot Mark IV-ITed Pella47000-500
UltraPure GlycerolThermo Fisher Scientific15514011
VitrobotThermo FisherMark IV מערכת
Whatman נייר סינון (55 mM)Cytiva1005-055
קסילן ציאנולתרמו פישר Scientific440700500
עמודי התפלה מיקרו ספין Zeba, 7K MWCO, 75 ומיקרו; תרמופישר סיינטיפיק89877
מסנן צנטריפוגלי אספן שברים טהור 29018224 ג'ל פוליאקרילאמיד (ביו-ראדPURX35050A

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
  4. Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
  5. Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
  6. McGinty, R. K., Tan, S. Nucleosome structure and function. Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).
  7. Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
  8. Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
  9. Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).
  10. Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
  11. Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
  12. Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
  13. Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
  14. Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
  15. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
  16. McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
  17. Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
  18. Burgess, R. R. D., Murray, P. Guide to Protein Purification. 463, Academic Press. (2009).
  19. Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909(2016).
  20. Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118(2021).
  21. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032(2019).
  22. Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255(2018).
  23. Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

cludedPlunge Freezing

מאמרים קשורים